CC BY
13
Original articles
Оригинальные статьи
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet Инфекция и иммунитет
2020, vol. 10, no. 4, pp. 671-685 2020, Т. 10, № 4, с. 671-685
САЛЬМОНЕЛЛА-ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ КЛЮЧЕВЫХ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ БАКТЕРИЙ ВЛИЯЮТ НА ТРАНСКРИПЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ Foxp3 И RORyt В КИШЕЧНО-АССОЦИИРОВАННОЙ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ КРЫС
Ю.В. Букина1, Л.Я. Федонюк2, Г.Д. Коваль3, Ю.А. Шеховцева4, А.М. Камышный1, А.А. Губарь1, В.А. Губка1
1 Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
2 Тернопольский государственный медицинский университет, г. Тернополь, Украина 3Буковинский государственный медицинский университет, г. Черновцы, Украина
4Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина
Резюме. Кишечный микробиом участвует во многих физиологических процессах хозяина, способствует формированию и поддержанию иммунного гомеостаза за счет регулировки иммунных реакций, направленных на защиту от колонизации патогенами. Особую роль в дифференцировке различных субпопуляций Т-лимфоцитов играют сегментарные нитевидные бактерии (Segmented filamentous bacteria, SFB), способные индуцировать в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) дифференцировку провоспалительных Thn-клеток, а представители рода Clostridium (cluster IV и XIVa) и Bacteroides fragilis (полисахарид A [PSA]) стимулируют образование Т-регуляторных клеток (Treg) и продукцию супрессорного цитокина IL-10. Важными метаболитами B. fragilis являются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), которые способны активировать клетки КАЛТ через рецептор FFAR2. Уменьшение концентрации КЦЖК снижает численность Treg в кишечнике и нарушает баланс Th17/Treg. Эти изменения напрямую ведут к снижению уровня мРНК FFAR2, Foxp3 и повышению экспрессии RORyt в КАЛТ. Поэтому целью работы было определить уровень ключевых иммунорегуляторных бактерий в пристеночной микрофлоре кишечника крыс и его влияние на транскрипционную активность генов Foxp3 и RORyt в КАЛТ при сальмонелла-индуцированном воспалении и на фоне введения ванкомицина и B. fragilis. Для определения родовой и видовой принадлежности бактерий, а также их количества в микрофлоре крыс применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) с идентификацией их по генам 16S rDNA. Для изучения транскрипционной активности генов использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЛР). В ходе эксперимен-
Адрес для переписки:
Букина Юлия Вячеславовна
69035, Украина, Запорожье, пр. Маяковского, 26,
Запорожский государственный медицинский университет.
Тел.: +38 096 400-46-26; +38 095 512-09-29.
E-mail: [email protected]
Библиографическое описание:
Букина Ю.В., Федонюк Л.Я., Коваль Г.Д., Шеховцева Ю.А., Камышный А.М., Губарь А.А., Губка В.А. Сальмонелла-индуцированные изменения уровня ключевых иммунорегуляторных бактерий влияют на транскрипционную активность генов РохрЭ и Р0Яу1 в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани крыс // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, № 4. С. 671-685. Сог 10.15789/2220-7619-БЮ-1151
© Букина Ю.В. и соавт., 2020
Contacts:
Yuliia V. Bukina
69035, Ukraina, Zaporozhye, pr. Majakovskogo, 26, Zaporozhye State Medical University. Phone: +38 096 400-46-26; +38 095 512-09-29. E-mail: [email protected]
Citation:
Bukina Yu.V., Fedoniuk L.Ya., Koval G.D., Shekhovtsova Iu.O., Kamyshnyi A.M., Gubar A.O., Gubka V.O. Salmonella-induced changes in the level of key immunoregulatory bacteria affect the transcriptional activity of the Foxp3 and RORgt genes in the gut-associated lymphoid tissue of rats // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2020, vol. 10, no. 4, pp. 671-685. doi: 10.15789/2220-7619-SIC-1151
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-SIC-1151
та при введении животным ванкомицина и сальмонелл наблюдалось увеличение уровня SFB и уменьшение A. muciniphila, F. prausnitzii. Также при инфицировании крыс S. Enteritidis и S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином отмечалось возрастание численности SFB на фоне выраженного уменьшения Bacteroides— Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV, IV и F. prausnitzii, что приводило к уменьшению уровня экспрессии мРНК генов Foxp3+ и увеличению RORyt+ соответственно. Однако введение B. fragilis животным, получавшим S. Enteritidis или S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином, обуславливало уменьшение уровня SFB и мРНК RORyt+ и, наоборот, увеличивало численность Bacteroides—Prevotela group,
A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV, IV, F. prausnitzii и экспрессию генов Foxp3+, что свидетельствует о восстановлении гомеостаза кишечного микробиома. Полученные результаты показали, что B. fragilis может с успехом применяться при лечении воспалительных заболеваний кишечника или заболеваний с нарушением барьерной функции кишечника.
Ключевые слова: микробиом, кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань, сальмонелла, ванкомицин, бактероиды, экспрессия, ПЦР-РВ.
SALMONELLA-INDUCED CHANGES IN THE LEVEL OF KEY IMMUNOREGULATORY BACTERIA AFFECT THE TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF THE Foxp3 AND RORyt GENES IN THE GUT-ASSOCIATED LYMPHOID TISSUE OF RATS
Bukina Yu.V.a, Fedoniuk L.Ya.b, Koval G.D.c, Shekhovtsova Iu.O.d, Kamyshnyi A.M.a, Gubar A.O.a, Gubka V.O.a
aZaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine b Ternopil State Medical University, Ternopil, Ukraine c Bukovinian State Medical University, Chernovtsy, Ukraine dKharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine
Abstract. Intestinal microbes involved in many physiological processes owner, contributes to the formation and maintenance of immune homeostasis by regulating immune responses to protect against colonization by pathogens. A special role in the differentiation of various subpopulations of T-lymphocytes play the segmental filamentous bacteria (Segmented filamentous bacteria, SFB), capable of inducing a gut-associated lymphoid tissue (GALT) differentiation proinflammatory Th17-cells and members of the genus Clostridium (cluster IV and XIVa) and Bacteroides fragilis (polysaccharide A [PSA]), stimulating the formation of regulatory T-cells (Treg) and production of suppressor of cytokine IL-10. Important metabolites of B. fragilis are short-chain fatty acids (SCFA), which are able to activate GALT cells through the FFAR2 receptor. Lowering of the SCFA concentration leads to the reduction of the number of Treg in the intestine and breaks Th17/Treg balance. These changes lead to direct reducing of mRNA FFAR2, Foxp3 expression and increasing in RORyt GALT. Therefore, the goal was to determine the level of the key in the edge immunoregulatory bacteria intestinal microflora rats and their effects on the transcriptional activity of the genes Foxp3 and RORyt in GALT with Salmonella-induced inflammation and during administration of vancomycin and B. fragilis. To determine the genus and species of bacteria, as well as their number in the microflora of rats, was used the method of polymerase chain reaction (PCR-RV) with their identification by 16S rDNA genes. To study the transcriptional activity of genes using polymerase chain reaction reverse transcription real-time (RT-PCR). During the experiment with the introduction of animals vancomycin and Salmonella there was an increase in the level of SFB and a decrease in A. muciniphila, F. prausnitzii. Also, during infecting rats with S. Enteritidis and S. Typhimurium on the background of pre-treatment with vancomycin, there was an increase in the number of SFBs against the background of a pronounced decrease in Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. clusters XIV, IV, and F. prausnitzii, which led to a decrease in the expression level of Foxp3+ mRNA and an increase in RORyt+, respectively. However, administration of B. fragilis to animals receiving S. Enteritidis or S. Typhimurium against pretreat-ment with vancomycin caused a decrease in the level of SFB and mRNA RORyt+, and, conversely, increased the number of Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. clusters XIV, IV, F. prausnitzii and expression of Foxp3+ genes, which indicates the restoration of the homeostasis of the intestinal microbiome. The obtained results showed that
B. fragilis can be successfully used in the treatment of inflammatory bowel diseases or diseases with impaired intestinal barrier function.
Key words: microbiome, gut-associated lymphoid tissue, Salmonella, Vancomycin, Bacteroides, expression, RT-PCR.
Многовековая коэволюция хозяина и микробов привели к их симбиозу, в котором ми-кробиота участвует во многих физиологических процессах хозяина, а он, в свою очередь, предоставляет субстрат для питания бактерий [29].
В дополнение к метаболическим функциям, микробиота способствует формированию и поддержанию иммунного гомеостаза за счет регулировки иммунных реакций, направленых на защиту от колонизации патогенами [30].
Среди огромного количества комменсаль-ных бактерий, населяющих ЖКТ, особую роль играют отдельные виды ключевых иммуно-регуляторных бактерий, которые направляют дифференцировку различных субпопуляций Т-лимфоцитов, а Т-клеточные рецепторы (TCR) этих иммунных клеток являются комменсал-специфическими [19, 37]. В этом контексте сегментарные нитевидные бактерии (SFB) являются индукторами дифференци-ровки Т-хелперов 17 типа (Th17), а большинство SFB-индуцированных ТЫ7-клеток, в свою очередь, являются специфичными для антигенов SFB. Используя гибридомные TCR у SFB-колонизированных мышей, Yang и соавт. показали, что большинство TCR ТЫ7-клеток специфически распознают антигены SFB [40].
Среди обитающих в кишечнике 19 кластеров (от I до XIX) класса Clostridia наибольшим Treg-индуцирующим потенциалом обладают представители кластеров IV и XIVa (также известные как группы Clostridium leptum и Clostridium coccoides соответственно). Clostridium кластера XIVa включает в себя виды, относящиеся к родам Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus, Coprococcus, Dorea, Lachnospira, Roseburia и Butyrivibrio. Clostridium кластера IV состоит из родов Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus и Anaerofilum [26]. В частности, Treg-индуцирующая активность у мышей была обнаружена в коктейле из 46 штаммов рода Clostridium, принадлежащих к кластерам IV и XIVa [6]. Был также идентифицирован коктейль из 17 человеческих штаммов Clostridia, обладающий активностью Treg-индуцирования [5]. Одним из представителей Clostridium кластера IV является вид Faecali-bacterium prausnitzii, влияющий на баланс Th17/ Treg в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) [42]. F. prausnitzii — один из основных производителей бутирата в кишечнике и способен уменьшать воспаление за счет стимуляции продукции большого количества IL-10 и блокады активации ядерного фактора NF-kB, что приводит к подавлению выработки провоспалительных цитокинов (IFNy, TNFa, IL-1ß, IL-8, IL-12) и повышению активности Foxp3+ Tregs в КАЛТ [12]. В 2016 г. в суперна-тантах культур F. prausnitzii идентифицировали белок, названный микробной противовоспалительной молекулой (MAM) [32]. Было показано, что по крайней мере семь пептидов белка MAM F. prausnitzii индуцируют продукцию IL-10 in vitro и блокируют развитие DSS-индуцированного колита у мышей [8].
Индукторами дифференцировки Т-регуля-торных клеток в кишечнике являются также представители филума Bacteroidetes Bacteroides fragilisи Bacteroides thetaiotaomicron [39]. Важными
метаболитами B. fragilis являются короткоце-почечные жирные кислоты (КЦЖК), выполняющие роль связующего звена между микро-биотой и иммунной системой, которые активируют клетки КАЛТ через рецептор FFAR2. Уменьшение концентрации таких КЦЖК, как бутират, пропионат и ацетат, снижает численность Treg в кишечнике и нарушает баланс Th17/ Treg, а уровень мРНК FFAR2 изменяется при развитии экспериментальных ВЗК [36]. Ранее мы показали, что введение B. fragilis животным, предобработанным ванкомицином, с последующим инфицированием S. Typhimurium повышает уровень мРНК гена FFAR2 в КАЛТ, влияет на экспрессию эффекторных белков сальмонелл SipA, SopB, SopE2 [1], а также обуславливает увеличение уровня концентрации КЦЖК, что способствует снижению сальмонелла-индуциро-ванного воспаления [9].
Значительный интерес представляет и им-мунорегуляторный потенциал Akkermansia mu-ciniphila — муцин-деградирующей бактерии из филума Verrucomicrobia. Plovier и соавт. (2017) показали, что введение A. muciniphila либо ее наружного мембранного белка Amuc_1100 активирует Toll-подобные рецепторы 2 типа (TLR2), сигнализация через которые увеличивала экспрессию генов, кодирующих белки плотных контактов claudin 3 и occludin [31].
Помимо иммунорегуляторного потенциала вышеуказанных комменсальных бактерий, значительный интерес представляет их способность повышать устойчивость к колонизации и инвазии возбудителей за счет конкурирования за метаболиты, выработки ингибирую-щих веществ и развития иммунных реакций в КАЛТ. Поэтому целью работы было определить уровень ключевых иммунорегуляторных бактерий в пристеночной микробиоте кишечника крыс и его влияние на транскрипционную активность генов Foxp3 и RORyt в КАЛТ при сальмонелла-индуцированном воспалении и на фоне введения ванкомицина и B. fragilis.
Материалы и методы
Исследования проводились на 120 самцах крыс линии Вистар массой 110—150 г в возрасте 2—3 месяца. Животные были разделены на восемь групп по 15 крыс в каждой группе. Группа 1 — контрольные животные; группа 2 — Vancomycin (животные, которым вводили ван-комицин в дозе 50 мг/кг); группа 3 — S. Ente-ritidis (животные, которым вводили S. Enteri-tidis в количестве 3 х 108 КОЕ/мл); группа 4 — S. Typhimurium (животные, которым вводили S. Typhimurium в количестве 3 х 108 КОЕ/мл); группа 5 — Vancomycin+S. Enteritidis (животные, получившие при пероральном вве-
дении ванкомицин в дозе 50 мг/кг и через сутки получившие бактериальную нагрузку S. Enteritidis в количестве 3 х 108 КОЕ/мл); группа 6 — Vancomycin+S. Typhimurium (животные, получившие при введении per os ванкомицин в дозе 50 мг/кг и через сутки получившие бактериальную нагрузку S. Typhimurium в количестве 3 х 108 КОЕ/мл); группа 7 — Vancomycin+S. Enteritidis+B. fragilis (животные, получившие при пероральном введении ван-комицин в дозе 50 мг/кг, через сутки — бактериальную нагрузку S. Enteritidis в количестве 3 х 108 КОЕ/мл и на следующий день B. fragilis в количестве 3 х 108 КОЕ/мл); группа 8 — Vancomycin+S. Typhimurium+B. fragilis (животные, получившие при пероральном введении ванко-мицин в дозе 50 мг/кг, через сутки — бактериальную нагрузку S. Typhimurium в количестве 3 х 108 КОЕ/мл и на следующий день — B. fragilis в количестве 3 х 108 КОЕ/мл). На пятые сутки крыс выводили из эксперимента с соблюдением принципов эвтаназии. Заражение животных проводили суточными культурами сальмонелл, выращенных на 1,5% МПА, полученных из музея штаммов микроорганизмов Украинского центра по контролю и мониторингу заболеваний МОЗ Украины. Культуры бактероидов выращивали на питательных средах, приготовленных согласно методическим рекомендациям «Лабораторная диагностика гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных аспоро-генными анаэробными микроорганизмами» (Харьков, 2000). Бактериальные суспензии стандартизировали при помощи денситометра DEN-1B (Biosan, Латвия) по МакФарланду (McF). Для введения крысам S. Еnteritidis, S. Typhimurium и B. fragilis нами были приготовлены суспензии в концентрации 1,0 стандарта McF, что соответствует концентрации 3 х 108 КОЕ/мл.
Молекулярно-генетические исследования по определению родовой и видовой принадлежности бактерий, а также их количественного содержания в микробиоте крыс проводились методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) с идентификацией их по генам 16S rDNA. В качестве материала для ПЦР-РВ исследований микробиома использовали пристеночное содержимое кишечника крыс. Соскобы со слизистой оболочки подвздошной кишки лизировали в буфере ASL (Qiagen, Германия). Выделение тотальной ДНК из соскобов выполнялось в соответствии с инструкциями производителя. Обилие кишечных бактерий измеряли количественной ПЦР на термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) с использованием SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, США) и специфических видо- и родоспецифических прайме-ров (Thermo Scientific, США) (см. табл. 1). Количественные результаты нормировали по универсальной 16S rDNA и анализировали с использованием метода ACt. Статистический анализ выполнялся с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software).
Определение уровня транскрипционной активности генов Foxp3, RORyt в КАЛТ проводилось с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ПЦР-ОТ). РНК выделяли из сгруппированных лимфоидных узелков (Пейеровых бляшек) подвздошной кишки крыс. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора «Trizol RNA Prep 100» (Лаборатория Изоген, Россия), который содержит Trizol reagent и ExtraGene. Для проведения обратной транскрипции и получения кДНК использовали «Набор реагентов для проведения обратной транскрипции (ОТ-1)» (Синтол, Россия). Реакционная смесь общим объемом 25 мкл содержала: 2 мкл тотальной РНК, 1 мкл
Таблица 1. Праймеры для определения бактериальных групп по 16S rDNA
Table 1. Primers for the determination of bacterial groups of 16S rDNA
16S universal UniF340: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'
16S universal UniR514: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGGC-3'
Segmented filamentous bacteria (SFB) SFB736F: 5'-GACGCTAGGCATGAGAGCAT-3'
Segmented filamentous bacteria (SFB) SFB844R: 5'-GACGGCACGGATTGTTATTCA-3'
Akkermansia muciniphila F: 5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
Akkermansia muciniphila R: 5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'
Faecalibacterium prausnitzii F: 5'-CCCTTCAGTGCCGCAGT-3'
Faecalibacterium prausnitzii R: 5'-GTCGCAGGATGTCAAGAC-3'
Bacteroides-Prevotella group Bac303FGAAGGTCCCCCACATTG
Bacteroides-Prevotella group Bac708RCAATCGGAGTTCTTCGTG
Clostridial cluster IV F: TTAACACAATAAGTAATCCACCTGG
Clostridial cluster IV R:ACCTTCCTCCGTTTTGTCAAC
Clostridial cluster XIV F: CGGTACCTGACTAAGAAGC
Clostridial cluster XIV R: AGTTTCATTCTTGCGAACG
Random-6 праймера, 8,5 мкл деионизирован-ной Н2О, очищенной от нуклеаз, 12,5 мкл реакционной смеси и 1 мкл ревертазы MMLV-RT. Обратную транскрипцию проводили при 45°С на протяжении 45 мин с последующим нагреванием для инактивирования MMLV-RT на протяжении 5 мин при 92°С.
Для определения уровня экспрессии исследуемых генов крыс Foxp3, RORyt использовали набор реактивов Maxima SYBR Green qPCR MasterMix (2x) (Thermo Scientific, США) и ам-плификатор CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad, США). Финальная реакционная смесь для амплификации содержала краситель SYBR Green, ДНК-полимеразу Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase, по 0,2 мкл прямого и обратного специфических праймеров, 1 мкл матрицы (кДНК). Реакционную смесь доводили до общего объема 25 мкл добавлением дио-низированной Н2О. Специфические пары прай-меров (5'—3') для анализа исследуемых и рефе-ренсного генов были подобраны при помощи программного обеспечения Primer-Blast (www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и изготовлены фирмами Metabion (Германия) и Thermo Scientific (США) (см. табл. 2).
После начальной денатурации на протяжении 10 мин при 95°C амплификация состояла из 45 циклов и проводилась при следующих условиях: денатурация — 95°С, 15 с; отжиг — 59—61°С, 30-60 с; элонгация — 72°С, 30 с. В качестве референс-гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии исследуемых генов крыс был использован ген глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH). Относительное нормализованное количество кДНК таргетных генов определяли сравнительным методом AACt. Статистический анализ данных ПЦР проводили при помощи программного обеспечения CFX Manager™ (Bio-Rad, США). В эксперимент включали отрицательные контроли без добавления кДНК матрицы в реакцию ПЦР, без добавления мРНК матрицы в синтезе кДНК, без добавления фрагмента в синтезе кДНК. Все реакции амплификации выполняли на индивидуальных образцах в трех повторах.
Результаты и обсуждение
В ходе проведения исследований полученные нами результаты показали, что при введении экспериментальным животным ванко-мицина наблюдалось снижение численности представителей F. prausnitzii (р < 0,0017) (рис. 1В), A. muciniphila (р < 0,0001) (рис. 1Б), представительство бактерий рода Clostridium cluster IV (р < 0,0046) (рис. 1Д) и Bacteroides+Prevotella
Таблица 2. Праймеры для определения уровня экспрессии генов Foxp3 и RORyt крысы
Table 2. Primers for determining the level of gene expression of Foxp3 and RORyt rats
Ген Праймер
Foxp3 F = CGAGACTTGGAAGTCAGCCAC R = TCTGAGGCAGGCTGGATAACG
RORyt F = AACATCTCGGGAGTTGCTGG R = TCGATTTGTGAGGTGTGGGT
GAPDH F = GCCTGGAGAAACCTGCCAAG R = GCCTGCTTCACCACCTTCT
(р < 0,0005) (рис. 1Г) снижалось менее интенсивно, а уровень Segmented filamentous bacteria в этой группе достоверно увеличивался (р < 0,0001) по сравнению с контролем (рис. 1А). Также при инфицировании крыс S. Enteritidis и S. Typhimurium в группах III и IV отмечалось уменьшение A. muciniphila (р < 0,0001; р < 0,0001) (рис. 1Б) и Bacteroides+Prevotella (р < 0,0002; р < 0,0002) (рис. 1Г), а количество представителей SFB (р < 0,0001) (рис. 1А) возрастало по отношению к контрольной группе.
В другом случае, при комбинированном введении ванкомицина и сальмонелл, в пристеночной микробиоте крыс наблюдались более выраженные изменения количественного состава представителей этих родов бактерий. Так, в V и VI экспериментальных группах регистрировалось резкое снижение численности F. prausnitzii (р < 0,0011; р < 0,0002) (рис. 2В, 3В), A. muciniphila (р < 0,0286; р < 0,0055) (рис. 2Б, 3Б), Clostridium duster IV (р < 0,0024; р < 0,0033) (рис. 2Д, 3Д), Clostridium duster XIV (р < 0,0127; р < 0,0198) (рис. 2Е, 3Е) и Bacteroides+Prevotella (р < 0,0189; р < 0,0017) (рис. 2Г, 3Г), а уровень SFB достоверно увеличивался (р < 0,0001; р < 0,0001) (рис. 2А, 3А) по сравнению с третьей и четвертой группами. Однако при совместном введении ванкомицина, сальмонелл и B. fragilis в VII и VIII группах отмечалось интенсивное увеличение количества Clostridium duster IV (р < 0,0019; р < 0,0005) (рис. 2Д, 3Д), Clostridium duster XIV (р < 0,0151; р < 0,0021) (рис. 2Е, 3Е) и Bacteroides+Prevotella (р < 0,0001; р < 0,0001) (рис. 2Г, 3Г). Численность представителей F. prausnitzii и A. muciniphila достоверно возрастала только в VIII группе (р < 0,0166; р < 0,0001) (рис. 3Б, 3В), а уровень SFB в этих группах достоверно снижался (р < 0,0001; р < 0,0001) (рис. 2A, 3A) по сравнению с контролем (см. табл. 3).
Учитывая, что B. fragilis являются одними из основных продуцентов КЦЖК, которые активируют клетки КАЛТ, мы определили уровень экспрессии мРНК транскрипционного фактора Foxp3, направляющего дифферен-цировку Т-клеток в сторону Treg. Так, транскрипционная активность гена Foxp3 в группах
1 х 10_02
3 О
сг - 1x10 "' аз сд
1x10"'
1x10"'
Segmented filamentous bacteria
р < 0.0001 vs control
I ¡л J
^ J?
v <
1x10"'
1x10"'
1x10"'
га о 1x10"'
CD DC
1x10-'
1x10"'
Akkermansia muciniphila
p < 0.0001 vs control
ДдД
ДД ДдД
/
1 х 10 '
1x10J
н
3 о О"
ш М > £
_га о оз ^ ОС
1x10-'
1x10й
1 х 10-'
Faecalibacterium prausnitzii
р < 0.0001 vs control
т
4
Jfl
1
ОфО» фооО
<ь■
✓
Bacteroidetes+Prevotella group
1x10°'
>, 1x10-1 'i I
3 O
О ю 1x10-' > £
ra o
o
DC
1x10"'
1x10"'
X
p < 0.001 vs control
r~r
ДдД
ДДддД 4«4
ООО
оОо о
/ / А*
/ у
<ь-
1x10"'
■S < 1x10-°=
ш В 1х10"°!
СИ
1х10"и ■
Clostridium cluster IV
р< 0.0046 vs control
Г
1
[РЧЬ
4a
Дд Л
«ev
/
1 х 1001
-Р <г I X IU
«t
3 О ст
о ю >
га о
о ■** 1x10"'
1x10"'
Clostridium cluster XlVa
X
У
X
jr
/
Рисунок 1 (1-й фрагмент). Относительное количество представителей Segmented filamentous bacteria (А), Akkermansia muciniphila (Б), Faecalibacterium prausnitzii (В), Bacteroides+Prevotella (Г), Clostridium cluster IV (Д) и Clostridium cluster XIV (Е) по 16S rDNA при введении ванкомицина, S. Enteritidis и S. Typhimurium
Figure 1 (fragment 1). The relative number of representatives of Segmented filamentous bacteria (A), Akkermansia muciniphila (B), Faecalibacterium prausnitzii (C), Bacteroides+Prevotella (D), Clostridium cluster IV (E) и Clostridium cluster XIV (F) by 16S rDNA with the introduction of vancomycin, S. Enteritidis and S. Typhimurium
Ж(С)
Foxp3 mRNA expression
S. Enteritidis Foxp3 Target
S.Typhimurium
D RORyt mRNA expression control vs Salmonella
S. Enteritidis RORyt Target
S. Typhimurium
Рисунок 1 (2-й фрагмент). Относительное нормализованное количество мРНК генов Foxp3 (a) и RORyt (b) в сгруппированных лимфоидных узелках подвздошной кишки крыс при ведении S. Enteritidis и S. Typhimurium
Figure 1 (fragment 2). Relative normalized amount mRNA of Foxp3 (a) and RORyt (b) genes in grouped lymphoid nodules of the ileum of rats when administered by S. Enteritidis and S. Typhimurium
III, IV и VI оставалась без изменений [рис. 1Ж(а), 2Ж (c1)] и достоверно снижалась в V группе (на 67%, р < 0,05) [рис. 2Ж (с)]. Однако при введении B. fragilis относительное нормализованное количество мРНК гена Foxp3 в группах Vancomycin+S. Enteritidis+B. fragilis и Vancomy-cin+S. Typhimurium+B. fragilis увеличилось в 2,5 и 85 раз соответственно (р < 0,05) [рис. 3Ж (e, el)]. Увеличение уровня экспрессии транскрипционного фактора RORyt, регулирующего диф-ференцировку субпопуляции ТЫ7-клеток, наблюдалось в III, IV, V и VI группах [рис. 1Ж (b), 2Ж (d, dl)] в 2,9; 3,9; 13 и 2,5 раза и достоверно снижался в VIII группе (на 70%, р < 0,05) (рис. 3Ж (f1), рис. 4, III обложка).
Обсуждение
Определенные представители кишечной микрофлоры, такие как Segmented filamentous bacteria, Faecalibacterium prausnitzii, Akkermansia muciniphila, Clostridium cluster IV, Clostridium cluster XIVa, Bacteroides fragilis, способны влиять на активацию врожденных и адаптивных звеньев в КАЛТ, что определяет исход инфекционного заболевания [10, 22].
Существует сложная и динамическая перекрестная связь между кишечной микробиотой и дифференцировкой CD4+ Т-клеток, играющих важную роль в организации адаптивных иммунных реакций в условиях гомеостаза и воспаления. Увеличение продукции Th17-клеток в тонком кишечнике может быть вызвано колонизацией SFB, измененной флорой Шаэдлера (ASF) и зачастую зависит от количественного содержания клостридий и определенных комменсалов. Почему SFB преимущественно индуцирует дифференцировку Th17?
Два недавних исследования показали, что ключевой особенностью SFB, необходимой для индукции Th17, является тесная связь с эпителиальными клетками кишечника. Используя специфичные для мышей и крыс штаммы SFB, Atarashi и соавт. обнаружили, что только штаммы, полученные от первоначального хозяина, способны индуцировать клетки Th17, что было связано с видоспецифической адгезией. Адгезия SFB индуцировала экспрессию эпителиальных сывороточных амилоидных белков (SAA1/2) и реактивного белка, продуцирующего кислород — Duox2 — в эпителиальных клетках. SAA1 усиливает индукцию IL-17A и IL-17F клетками Th17, а также воздействует на дендритные клетки, способствуя индукции Th17 и повышению экспрессии RORyt+ [4]. Также действие IL-22, канонического цитокина Th17, индуцирует выработку антимикробных пептидов, эффективных против бактерий, способных вызвать присоединение или удаление штаммов, таких как C. rodentium и некоторых штаммов E. coli, S. Typhimurium, Yersinia enterocolitica [20, 34]. Обнаружено, что колонизация SFB приводит к повышенной экспрессии молекул МНС II класса на эпителиальных клетках кишечника и влияет на гликозилирование энтероци-тов, специфически вызывая экспрессию GM1-гликолипидов, предназначенных для ингиби-рования прикрепления другого агента [41].
Полученные нами результаты совпадают с данными других экспериментов, демонстрирующих, что колонизация кишечника Bacteroides fragilis с помощью его полисахарида A (PSA) индуцирует Tregs и продукцию IL-10 посредством передачи сигналов через TLR2 [17]. Кроме того, бактериальные метаболиты — ко-роткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) —
1x10"'
Е < 1 хЮ-02-
™ S
О"
ш со
.1 s
« О 1x10-'
а)
ос
1x10"'
Segmented filamentous bacteria
р< 0.0001 vs S. Enteritidis
p < 0.0001 vs S. Enteritidis+Vancomicin
X c^
1x10"
■3 < 1x10"
■g S 1 x 10-05
CE
1x10"
Akkermansia muciniphila
p < 0,0286 vs S. Enteritidis
I Z I
m
4
X ^
1x10"'
H
=> О
1x10"'
я о
1x10"'
1x10"'
Faecalibacterium prausnitzii
X
p< 0,0011 vsS. Enteritidis
Г
1
»Ii
д
■Jf
s
„4^
X #
1 хЮ-1
1X10"1
Bacteroidetes+Prevotella group
p < 0,0001 vs S. Enteritidis + Vancomicin
■T
X
p<0,0189vsS. Enteritidis
Г
V,
1
■Jf
s
„4^
»p
4
п О
О"
ш аз .1 £ о
а>
СП
1x10"'
1x10"°'
1x10"'
1x10"'
1x10"'
Clostridium cluster IV
p < 0,0019 vs S. Enteritidis+Vancomicin «
I -T- I
p< 0,0024 vs S. Enteritidis
I
ДДДД Д
r <
1x10-°° 1x10-°' 1 хЮ-02
ai 03 > <□
■■Я ^ 1x10 -(
Со о
1x10"' 1x10"'
Clostridium cluster XlVa
p < 0,0151 vs S. Enteritidis+Vancomicin
Г
1
ППр„П°
p < 0,0127 vs S. Enteritidis'
ЛДдДД
A
s-
y /
-X Jt
V
y
y
г
X
>S Ъ'
Рисунок 2 (1 -й фрагмент). Относительное число представителей Segmented filamentous bacteria (А), Akkermansia muciniphila (Б), Faecalibacterium prausnitzii (В), Bacteroides+Prevotella (Г), Clostridium cluster IV (Д) и Clostridium cluster XIV (Е) по 16S rDNA при комбинированном ведении ванкомицина, S. Enteritidis и B. fragilis
Figure 2 (fragment 1). The relative number of representatives of Segmented filamentous bacteria (A), Akkermansia muciniphila (B), Faecalibacterium prausnitzii (C), Bacteroides+Prevotella (D), Clostridium cluster IV (E) и Clostridium cluster XIV (F) by 16S rDNA with the combined management of vancomycin, S. Enteritidis и B. fragilis
Ж(О)
Foxp3 mRNA expression
S. Enteritidis
S. Enteritidis+ Foxp3 Vancomicin Target
Ж(С)
I RORyt mRNA expressions. Enteritidis vsS. Enteritidis+Vancomicin
S. Enteritidis
S. Enteritidis+ RORyt Vancomicin Target
Foxp3 mRNA expression
S. Typhimurium
S. Typhimurium + Foxp3 Vancomicin Target
Щ RORyt mRNA expression after B. fragilis administration
Vancomicin + Vancomicin +
S. Typhimurium + RORyt s. Typhimurium B. fragilis Target
Рисунок 2 (2-й фрагмент). Относительное нормализованное количество мРНК генов Foxp3 (c, c1) и RORyt (d, d1) в сгруппированных лимфоидных узелках подвздошной кишки крыс при ведении S. Enteritidis и S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином. Нормализация по методу AACt с референс-геном GAPDH
Figure 2 (fragment 2). Relative normalized amount of mRNA Foxp3 (c, c1) and RORyt (d, d1) genes in grouped lymphoid nodules of the ileum of rats when administered by S. Enteritidis and S. Typhimurium on the background of pre-treatment with vancomycin. Normalization by the AACt method with the GAPDH reference gene
также способны регулировать продукцию Tregs клеток и усиливать ацетилирование локуса Foxp3 в Tregs [33]. При исследовании мышей, колонизированных 17 человеческими штаммами Clostridium, уровни содержания КЦЖК (ацетата, пропионата, изобутирата и бутирата) были повышены, что стимулировало продукцию супрессорного цитокина TGFß в эпителиальных клетках толстой кишки и косвенно способствовало развитию Tregs. Рецепторы, которые активируются SCFA, а именно связанные с G-белком (GPCR), такие как GPR43 (FFAR2), экспрессируются как в эпителиальных клетках, так и в большинстве гематопоэтических клетках. Соответственно, мыши, лишенные GPR43, имели меньшее количество Tregs [3].
Использование очищенного PSA может защитить животных от развития колита и рассеянного склероза. Известно, что B. fragilis тесно связывается с криптами кишечника. Когда у B. fragilis разрушается PSA, они теряют способность индуцировать Tregs и ассоциировать с кишечным эпителием, что позволяет предположить важность Tregs для колонизации B. fragilis в этой
нише. Эффект PSA является примером мощного терапевтического потенциала, который может быть раскрыт посредством детального изучения комменсальных микроорганизмов [14].
В целом комменсалы могут регулировать иммунную специфичность посредством нескольких механизмов: а) микрорганизмы в кишечнике могут индуцировать популяции Т-клеток, которые экспрессируют два TCR: один TCR распознает сам комменсал, а другой реагирует на собственный пептид. Миграция этих Т-клеток в ткани хозяина может вызвать патологию и аутоиммунитет; б) CD4+ и CD8+ Т-клетки могут быть активированы независимо от их TCR через Toll-подобные рецепторы (TLR). В частности, стимуляция бактероидами TLR на T-клетках способствует их дифференциров-ке в Treg; в) комменсальные микроорганизмы могут экспрессировать эпитопы, имитирующие собственные пептиды, которые, как известно, управляют аутоиммунитетом. Собственные реактивные Т-клетки будут активироваться этими антигенами в кишечнике, а затем поступать в ткани и вызывать аутоиммунитет [28].
=> о
о
1x10" 1x10" 1x10" 1x10" 1 хЮ"05 J 1x10"'
1 X10"'
Segmented filamentous bacteria
p < 0.0001 vs S. Typhimurium
. •• « I
.V'i'.V
p < 0.0001 vs S. Typhimurium + Vancomicin
/ <ь-
У
✓
4
э Q
O"
О) w .1 £ о
О) DC
1 хЮ-02 1x10 03 1x10-°"
1 X10 "05
1x10-°' 1 x10-07
Akkermansia muciniphila
p « 0,0001 vs S. Typhimurium + Vancomicin
n&P
]г p < 0,0055 vsS. Typhimurium
1 Ч'1' 1 I I
• AAA
"д" ДдДД
.ci?
✓
¿y
#
11 2 О
о
CD ~
DC
1x10"°' -, 1 хЮ-02 -1 хЮ-03
1 X10 "°4
1 хЮ-05
1 X10 "06
1 хЮ-07
Faecallbacterium prausnitzil
p < 0,0166 vs S. Typhimurium+Vancomicin
E^E
p < 0,0002 vs S. Typhimurium
i
У
/ <b•
< /у
ч
= a
iS о a)
DC
1x10"' 1x10'
1X10"1
1x10"' 1x10"' 1x10"'
Bacteroidetes+Prevotella group
p < 0,0001 vs S. Typhimurium+Vancomicin
□ □□□
p < 0,0017 vs S. Typhimurium
г
i
У
<ь■
у
/
<f J <b•
<
1x10"
1x10"'
4
з О
ш 03 5 <o
1 x 10 "°2
1 X10"
Clostridium cluster IV
p < 0,0005 vs S. Typhimurium + Vancomicin
Г
.к
i
»u
9
p < 0,0033 vs s. Typhimurium
Г
1
дддД дДд
/
II
CT
0) M >
ra о
tu
ее
1x10"'
1x10"'
1 x 10-'
1x10"'
1x10й
Clostridium cluster XlVa
p < 0,0021 vs S. Typhimurium + Vancomicin
i
X
p < 0,0198 vs S. Typhimurium
г
i
д
A
/ <
<ь-
/ <b•
/
X -Ф
Рисунок 3 (1-й фрагмент). Относительное число представителей Segmented filamentous bacteria (А), Akkermansia muciniphila (Б), Faecalibacterium prausnitzii (В), Bacteroides+Prevotella (Г), Clostridium cluster IV (Д) и Clostridium cluster XIV (Е) по 16S rDNA при сочетанном ведении ванкомицина, S. Typhimurium и B. fragilis
Figure 3 (fragment 1). The relative number of representatives of Segmented filamentous bacteria (A), Akkermansia muciniphila (B), Faecalibacterium prausnitzii (C), Bacteroides+Prevotella (D), Clostridium cluster IV (E) и Clostridium cluster XIV (F) by 16S rDNA with combined management of vancomycin, S. Typhimurium and B. fragilis
Ж(С)
Foxp3 mRNA expression after В. fragilis administration
Foxp3 mRNA expression after B. fragilis administration
cr 1.0
Ж(С)
Vancomicin + S. Enteritidis Foxp3 Target
RORyt mRNA expression Vancomicin+S. Enteritidis vs Vancomicin+S. Enteritidis+B. fragilis
Vancomicin + S. Enteritidis RORyt Target
1.2
Vancomicin + S.Typhimurium
Foxp3 Target
Vancomicin + S.Typhimurium + B. fragilis
Q RORyt mRNA expression Vancomicin+S. Typhimurium vs Vancomicin+S. Typhimurium+B. fragilis
0.8 -
^ 0.6-CÖ
E о
CO 0.2 -
0.0
р < 0.05
Vancomicin+ Vancomicin+
S. Typhimurium+ RORyt S.Typhimurium B. fragilis Target
Рисунок 3 (2-й фрагмент). Относительное нормализованное количество мРНК генов Foxp3 (e, e1) и RORyt (f, f1) в сгруппированных лимфоидных узелках подвздошной кишки крыс при ведении B. fragilis экспериментальным животным получавшим S. Enteritidis и S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином. Нормализация по методу AACt с референс-геном GAPDH
Figure 3 (fragment 2). Relative normalized amount of mRNA Foxp3 (e, e1) and RORyt (f, f1) genes in grouped lymphoid nodules of the ileum of rats when B. fragilis was administered to experimental animals treated with S. Enteritidis and S. Typhimurium on the background of pre-treatment with vancomycin. Normalization by the AACt method with the GAPDH reference gene
Комменсал ьная микробиота кишечника обеспечивает устойчивость к колонизации патогенными микроорганизмами. Эксперименты показали, что у мышей при заражении ТурЫ-шигшш определяется более высокая устойчивость к патогенам, нежели в условиях их предобработки антибиотиком, при которой наблюдается более резкое нарушение резидентного сообщества, что приводит к повышенной инвазии сальмонелл и формированию у людей хронического бессимптомного носительства. Комменсальные виды Bаcteroides Брр. способны ограничивать сальмонелла-индуцированную инфекцию в кишечнике за счет производства КЦЖК, таких как пропионат, ацетат и бутират. Однако сальмонеллы могут избегать реакций врожденного и адаптивного иммунитета посредством продукции эффекторных белков, вызывающих внедрение, выживание и ауторепро-дукцию бактерий в пределах тканей организма, что приводит к воспалению кишечника [2, 7, 29].
Было обнаружено, что введение живых A. muciniphila повышало эндогенную выработ-
ку специфических биологически активных липидов, оказывало противовоспалительное действие и регулировало эндогенную выработку кишечных пептидов, участвующих в регуляции глюкозы и барьерной функции кишечника, а именно глюкагоно-подобных пептидов 1 и 2 (GLP-1 и GLP-2) [11, 21, 24, 35]. Установлено, что высокий уровень метаболитов таких представителей, как Clostridia, может способствовать развитию Пейеровых бляшек, aß-TCR интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) и продукции IL-7, IL-6, TGFß, IgA, а также влиять на соотношение CD4-CD8+ и CD4+CD8- лимфоцитов [32]. Вдобавок Clostridium spp. XIV и IV кластеров, посредством активации экспрессии транскрипционного фактора Foxp3 и IL-10, индуцируют накопление Tregs-клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника, а за счет матричных металлопротеиназ (ММР) активируют TGF-ß и индоламин 2,3-диоксигеназу (IDO) в эпителиальных клетках толстой кишки и снижают численность Th17, что игра-
Таблица 3. Количественное определение содержания микроорганизмов в пристеночной микрофлоре крыс по 16S rDNA
Table 3. Quantitative determination of the content of microorganisms in the wall microflora of rats by 16S rDNA
Группы Segmented filamentous bacteria Candidatus Arthromitus subphylum Clostridium Faecalibacterium prausnitzii phylum Firmicutes Akkermansia muciniphila phylum Verrucomicrobia
16S (CT mean) SFB (CT mean) 2"ACt 16S (CT mean) F. prausnitzii (CT mean) 2"ACt 16S (CT mean) A. muciniphila (CT mean) 2-Act
Control 10,06 27,91 0,000005 9,74 22,93 0,00015 10,17 21,79 0,00051
Vancomicin 10,03 22,02 0,00025* 10,09 28,98 0,0000028* 10,17 27,76 0,0000083*
S. Enteritidis 9,94 21,0 0,00047* 10,32 23,25 0,00018 10,22 26,57 0,000017*
S. Typhimurium 9,92 20,13 0,00089* 9,96 22,98 0,00015 10,05 26,24 0,000018*
S. Enteritidis+Vancomicin 10,12 17,45 0,0067a 10,28 30,24 0,0000014a 9,95 28,81 0,0000025a
S. Typhimurium+Vancomicin 9,91 17,09 0,0075b 10,24 30,04 0,0000015" 10,20 28,97 0,0000029"
S. Enteritidis+Vancomicin+S. fragilis 10,01 30,12 0,00000093е 10,05 18,26 0,0068 9,73 17,99 0,0046
S. Typhimurium+Vancomicin+S. fragilis 10,02 31,05 0,00000051d 9,98 18,20 0,0054d 9,90 18,01 0,0039d
Группы Clostridium cluster IV (Clostridium leptum, C. sporosphaeroides, C. cellulosi, Eubacterium, Ruminococcus and Anaerofilum genera) Clostridium clusterXIV (Clostridium, coccoides, C. aminovalericum, C. populeti, C. clostridiiforme, C. propionicum, C. neopropionicum, C. lentocellum, C. colinum, C. piliforme, Epulopiscium sp., Eubacterium rectale, E. cellulolyticum Ruminucoccus torques, R. gnavus, Dorea, Lachnospira, Butyrivibrio genera, Acetitomaculum ruminis, Epulopicium sp., Coprococcus eutactus, Roseburia cecicola, and Streptococcus hansenii) Bacteroides+Prevotella Bacteriodetes: Prevotella cluster (P. melaninogenica, P. intermedia, P. nigrescens, P. ruminicola, P. zoogleoformans, P. heparinolytica); B. fragilis; porphyromonas cluster (Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis, P. asaccharolytica, P. circumdentaria, P. salivosa)
16S (CT mean) Clostridium cluster IV (CT mean) 2*4Ct 16S (CT mean) Clostridium cluster XIV (CT mean) 2-ACt 16S (CT mean) Bacteroides+ Prevotella group (CT mean) 2-ict
Control 9,96 15,54 0,029 10,02 15,28 0,045 9,83 14,17 0,091
Vancomicin 10,07 17,81 0,0064* 10,10 16,72 0,014 9,71 17,11 0,0077*
S. Enteritidis 10,13 16,44 0,017 9,82 16,33 0,021 9,94 18,93 0,0032*
S. Typhimurium 10,25 16,03 0,029 9,89 16,10 0,024 10,41 19,17 0,0032*
S. Enteritidis+Vancomicin 10,07 19,99 0,0014a 9,88 21,04 0,00065a 10,07 22,27 0,00026a
S. Typhimurium+Vancomicin 10,27 20,07 0,0014b 10,10 20,99 0,00066b 9,96 22,18 0,00029b
S. Enteritidis+Vancomicin+B. fragilis 10,01 12,65 0,22е 9,53 13,89 0,076е 9,88 12,56 0,187c
S. Typhimurium+Vancomicin+S. fragilis 9,65 12,75 0,15d 9,33 13,86 0,062d 10,17 12,64 0,212d
Примечания. * Достоверность различий параметров р < 0,005 по отношению к контрольной группе; а — достоверность различий параметров р < 0,005 по отношению к группе S. Enteritidis; b — достоверность различий параметров р < 0,005 по отношению к группе S. Typhimurium; с —достоверность различий параметров р < 0,005 по отношению к группе S. Enteritidis + Vancomicin; d —достоверность различий параметров р < 0,005 по отношению к группе S. Typhimurium + Vancomicin.
Notes. * The reliability of the differences in the parameters p < 0.005 in relation to the control group; a —the reliability of the differences in the parameters p < 0.005 in relation to the groups. Enteritidis; b —the reliability of the differences between the parameters p < 0.005 in relation to the groups. Typhimurium; c —the reliability of the differences between the parameters p < 0.005 in relation to the groups. Enteritidis + Vancomicin; d —the reliability of the differences in the parameters p < 0.005 in relation to the group S. Typhimurium + Vancomicin.
ет важную роль в поддержании врожденного и адаптивного иммунного гомеостаза в кишечнике [13, 15, 18, 23, 25, 27].
В целом до настоящего времени было известно, что только некоторые из комменсальных микробов способны модулировать специфические иммунные параметры, но последние работы показывают иммуномодулирующее действие филогенетически все более разнообразных кишечных микробов человека. Большинство бактерий оказывали несколько специализированных, дополнительных или избыточных транскрипционных и иммуномодулирующих эффектов. Удивительно, но зачастую они не зависели от микробной филогении. Эти исследования могут определить важные терапевтические эффекты.
Действительно, скрининг кишечного мик-робиома дал ряд открытий, как ожидаемых, так и непредвиденных. Например, было обнаружено, что отдельные микроорганизмы способны индуцировать клетки Th17 в эпителии кишечника до уровня, аналогичного уровню, вызываемому SFB, как это было подробно показано в других экспериментах [16]. Однако стало неожиданным наблюдение, что около четверти исследованных бактерий, охватывающих различные виды, могут вызывать индукцию ÄOÄyi+Helios-Tregs в толстом кишечнике [38]. Другая, ранее не известная, но потенциально интересная иммуномодулирующая активность представителей Veillonella состоит в том, что они стимулируют увеличение IL-10-продуцирующих CD4+ T-клеток и параллельное снижение IL-22-продуцирующих эпителиальных клеток в толстой кишке. L. rhamnosus, значительно снижает число дендритных клеток, а F. varium оказывает необычайно сильную иммуностимулирующую активность [5].
Выводы
Введение животным ванкомицина и сальмонелл обуславливало количественное изменение уровня ключевых иммунорегуляторных бактерий: увеличение уровня SFB и существенное уменьшение A. muciniphila, F. prausnitzii. При инфицировании крыс S. Enteritidis и S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином наблюдалось более резкое изменение в количественном составе микробиоты, приводящее к уменьшению уровня экспрессии мРНК генов Foxp3+ и увеличению RORyt соответственно. Однако введение экспериментальным животным B. fragilis, получавшим S. Enteritidis или S. Typhimurium на фоне предобработки ванкомицином, уменьшало уровни SFB и мРНК RORyt, а также значительно увеличивало представительство Bacteroides—Prevotela group, A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV, IV, F. prausnitzii и экспрессии генов Foxp3+, что свидетельствует о восстановлении гомеоста-за кишечного микробиома.
Изучение молекулярных механизмов взаимодействия SFB с КАЛТ позволяет выяснить их влияние на физиологические, метаболические и иммунные процессы в кишечнике и, возможно, использовать A. muciniphila, Clostridium spp. кластеров XIV и IV, F. prausnitzii и Bacteroides— Prevotela group в качестве инструмента для разработки новых методов профилактики и терапии воспалительных заболеваний кишечника или заболеваний с нарушением барьерной функции кишечника.
B. fragilis снижает дисбиотические проявления, способствует восстановлению кишечного микробиома и может применяться как общая адъювантная терапия в сочетании с антибактериальными препаратами.
Список литературы/References
1. Букина Ю.В., Камышный А.М., Полищук Н.Н., Топол И.А. Сальмонелла-индуцированные изменения кишечной микробиоты и транскриптома генов иммунного ответа на фоне введения ванкомицина и Bacteroides fragilis // Патолопя. 2017. Т. 14, № 1 (39). С. 12-19. [Bukina Y.V., Kamyshnyi A.M., Polishchuk N.N., Topol I.A. Salmonella-induced changes in the gut microbiota and immune response genes transcriptome during administration of vancomycin and Bacteroides fragilis. Patologiya = Pathology, 2017, vol. 14, no. 1 (39), pp. 12-19. (In Russ.)]
2. Agbor T.A., McCormick B.A. Salmonella effectors: important players modulating host cell function during infection. Cell Microbiol., 2011, vol. 13,pp. 1858-1869. doi: 10.1111/j.1462-5822.2011.01701.x
3. Arpaia N., Campbell C., Fan X. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature, 2013, vol. 504, pp. 451-455. doi: 10.1038/nature12726
4. Atarashi K., Tanoue T., Ando M., Kamada N., Nagano Y. Th17 cell induction by adhesion of microbes to intestinal epithelial cells. Cell, 2015, vol. 163,pp. 367-380. doi: 10.1016/j.cell.2015.08.058
5. Atarashi K., Tanoue T., Oshima K., Suda W., Nagano Y., Nishikawa H., Fukuda S., Saito T., Narushima S., Hase K. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature, 2013, vol. 500, pp. 232-236. doi: 10.1038/nature12331
6. Atarashi K., Tanoue T., Shima T., Imaoka A., Kuwahara T., Momose Y., Cheng G., Yamasaki S., Saito T., Ohba Y., Taniguchi T., Takeda K., Hori S., Ivanov I.I., Umesaki Y., Itoh K., Honda K. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science, 2011, vol. 331, pp. 337-341. doi: 10.1126/science. 1198469
7. Behnsen J., Perez-Lopez A., Nuccio S.P., Raffatellu M. Exploiting host immunity: the Salmonella paradigm. Trends Immunol., 2015, vol. 36, pp. 112-120. doi: 10.1016/j.it.2014.12.003
8. Breyner N.M., Michon C., de Sousa C.S., Vilas Boas P.B., Chain F., Azevedo V.A., Langella P., Chatel J.M. Microbial antiinflammatory molecule (MAM) from Faecalibacterium prausnitzii shows a protective effect on DNBS and DSS-induced colitis model in mice through inhibition of NF-kB pathway. Front. Microbiol., 2017, vol. 8:114. doi: 10.3389/fmicb.2017.00114
9. Bukina Yu.V., Varynskyi B.O., Voitovich A.V., Koval G.D., Kaplaushenko A.G., Kamyshnyi O.M. The definition of neutrophil extracellular traps and the concentration of short-chain fatty acids in salmonella-induced inflammation of the intestine against the background of vancomycin and bacteroides fragilis. Pathology, 2018, vol. 15, no. 1 (42), pp. 10—17.
10. David L.A., Maurice C.F., Carmody R.N., Gootenberg D.B., Button J.E., Wolfe B.E. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature, 2014, vol. 505, pp. 559-563. doi: 10.1038/nature12820
11. Dubourg G., Lagier J.C., Armougom F., Robert C., Audoly G., Papazian L. High-level colonisation of the human gut by Verrucomicrobia following broad-spectrum antibiotic treatment. Int. J. Antimicrob. Agents, 2013, vol. 41, pp. 149-155. doi: 10.1371/ journal.pone.0095476
12. Ferreira-Halder C.V., Faria A.V.S., Andrade S.S. Action and function of Faecalibacterium prausnitzii in health and disease. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2017, vol. 6,pp. 643-648. doi: 10.1016/j.bpg.2017.09.011
13. Feuerer M., Hill J.A., Kretschmer K., von Boehmer H., Mathis D., Benoist C. Genomic definition of multiple ex vivo regulatory T cell subphenotypes. Proc. Natl. Acad. Science USA, 2010, vol. 107, pp. 5919-5924. doi: 10.1073/pnas.1002006107
14. Furusawa Y., Obata Y., Fukuda S. Commensal microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic regulatory T cells. Nature, 2013, vol. 504, pp. 446-450. doi: 10.1038/nature12721
15. Geuking M.B., Cahenzli J., Lawson M.A., Ng D.C., Slack E., Hapfelmeier S., McCoy K.D., Macpherson A.J. Intestinal bacterial colonization induces mutualistic regulatory T cell responses. Immunity, 2011, vol. 34, pp. 794-806. doi: 10.1016/j.immu-ni.2011.03.021
16. Geva-Zatorsky N., Sefik E., Kua L., Pasman L., Tan T.G., Ortiz-Lopez A., Yanortsang T.B., Yang L., Jupp R., Mathis D., Benoist C., Kasper D.L. Mining the human gut microbiota for immunomodulatory organisms. Cell, 2017, vol. 168, no. 5, pp. 928943. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.022
17. Goto Y., Umesaki Y., Benno Y., Kiyono H. Epithelial glycosylation in gut homeostasis and inflammation. Nat. Immunol., 2016, vol. 17, no. 11, pp. 1244-1251. doi: 10.1038/ni.3587
18. Honda K., Littman D.R. The microbiome in infectious disease and inflammation. Annu. Rev. Immunol., 2012, vol. 30, pp. 759795. doi: 10.1146/annurev-immunol-020711-074937
19. Hooper L.V., Littman D.R., Macpherson A.J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science, 2012, vol. 336, no. 6086, pp. 1268-1273. doi: 10.1126/science.1223490
20. Ivanov I.I., Atarashi K., Manel N., Brodie E.L., Shima T., Karaoz U., Wei D., Goldfarb K.C., Santee C.A., Lynch S.V., Tanoue T., Imaoka A., Itoh K., Takeda K., Umesaki Y., Honda K., Littman D.R. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell, 2009, vol. 139,pp.485-498. doi: 10.1016/j.cell.2009.09.033
21. Keestra-Gounder A.M., Tsolis R.M., Baumler A.J. Now you see me, now you don't: the interaction of Salmonella with innate immune receptors. Nat. Rev. Microbiol., 2015, vol. 13, pp. 206-216. doi: 10.1038/nrmicro3428
22. Korpela K., Flint H.J., Johnstone A.M., Lappi J., Poutanen K., Dewulf E. Gut microbiota signatures predict host and microbiota responses to dietary interventions in obese individuals. PLoS One, 2014, vol. 9 (6): e90702. doi: 10.1371/journal.pone.0090702
23. Lathrop S.K., Bloom S.M., Rao S.M., Nutsch K., Lio C.W., Santacruz N., Peterson D.A., Stappenbeck T.S., Hsieh C.S. Peripheral education of the immune system by colonic commensal microbiota. Nature, 2011, vol. 478, pp. 250-254. doi: 10.1038/nature10434
24. Li J., Lin S., Vanhoutte P.M., Woo C.W., Xu A. Akkermansia muciniphila protects against atherosclerosis by preventing metabolic endotoxemia-induced inflammation in apoe-/-mice. Circulation, 2016, vol. 133, pp. 2434-2446. doi: 10.1038/nature10434
25. Littman D.R., Rudensky A.Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell, 2010, vol. 140, pp. 845-858. doi: 10.1016/j.cell.2010.02.021
26. Lopetuso L.R., Scaldaferri F., Petito V., Gasbarrini A. Commensal Clostridia: leading players in the maintenance of gut homeostasis. Gut Pathog, 2013, vol. 5(1): 23. doi: 10.1186/1757-4749-5-23
27. Nagano Y., Itoh K., Honda K. The induction of Treg cells by gut-indigenous Clostridium. Curr. Opin. Immunol., 2012, vol. 24, pp. 392-397. doi: 10.1016/j.coi.2012.05.007
28. Ochoa-Reparaz J., Mielcarz D.W., Wang Y., Begum-Haque S., Dasgupta S. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol., 2010, vol. 3, pp. 487-495. doi: 10.1038/ mi.2010.29
29. Ost K.S., Round J.L. Communication between the microbiota and mammalian immunity. Annu. Microbiol. Rev., 2018, vol. 72, pp. 399-422. doi: 10.1146/annurev-micro-090817-062307
30. Pickard J.M., Zeng M.Y., Caruso R., Nunez G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. Immunol. Rev., 2017, vol. 279, no. 1, pp. 70-89. doi: 10.1111/imr.12567
31. Plovier H., Everard A., Druart C., Depommier C., Van Hul M., Geurts L., Chilloux J., Ottman N., Duparc T., Lichtenstein L., Myridakis A., Delzenne N.M., Klievink J., Bhattacharjee A., van der Ark K.C., Aalvink S., Martinez L.O., Dumas M.E., Maiter D., Loumaye A., Hermans M.P., Thissen J.P., Belzer C., de Vos W.M., Cani P.D. A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat. Med., 2017, vol. 1, pp. 107-113. doi: 10.1038/nm.4236
32. Quevrain E., Maubert M.A., Michon C., Chain F., Marquant R. Identification of an antiinflammatory protein from Faecalibacterium prausnitzii, a commensal bacterium deficient in Crohn's disease. Gut, 2016, vol. 65, pp. 415-425. doi: 10.1136/ gutjnl-2014-307649
33. Round J.L., Mazmanian S .K. Inducible Foxp3+ regulatory T-cell development by a commensal bacterium of the intestinal microbiota. Proc. Natl. Acad. Science USA, 2010, vol. 107, pp. 12204-12209. doi: 10.1073/pnas.0909122107
34. Sano T., Huang W., Hall J.A., Yang Y., Chen A. An IL-23R/IL-22 circuit regulates epithelial serum amyloid A to promote local effector Th17 responses. Cell, 2015, vol. 163, pp. 381-393. doi: 10.1016/j.cell.2015.08.061
35. Shin N.R., Lee J.C., Lee H.Y., Kim M.S., Whon T.W., Lee M.S. An increase in the Akkermansia spp. population induced by metformin treatment improves glucose homeostasis in diet-induced obese mice. Gut, 2014, vol. 63, pp. 727—735. doi: 10.1136/ gutjnl-2012-303839
36. Smith P.M., Howitt M.R., Panikov N. The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science, 2013, vol. 341, no. 6145, pp. 569-573. doi: 10.1126/science.1241165
37. Sorini C., Cardoso R.F., Gagliani N., Villablanca E.J. Commensal bacteria-specific CD4+ T cell responses in health and disease. Front. Immunol., 2018, vol. 9:2667. doi: 10.3389/fimmu.2018.02667
38. Tan T.G., Sefik E., Geva-Zatorsky N., Kua L., Naskar D., Teng F., Pasman L., Ortiz-Lopez A., Jupp R., Wu H.J. Identifying species of symbiont bacteria from the human gut that, alone, can induce intestinal Th17 cells in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016, vol. 113, pp. 8141-8150. doi: 10.1073/pnas.1617460113
39. Telesford K.M., Yan W., Ochoa-Reparaz J., Pant A., Kircher C., Christy M.A., Begum-Haque S., Kasper D.L., Kasper L.H. A commensal symbiotic factor derived from Bacteroides fragilis promotes human CD39(+)Foxp3(+) T cells and Treg function. Gut Microbes., 2015, vol. 6, pp. 234-242. doi: 10.1080/19490976.2015.1056973
40. Yang Y., Torchinsky M.B., Gobert M., Xiong H., Xu M. Focused specificity of intestinal TH17 cells towards commensal bacterial antigens. Nature, 2014, vol. 510, pp. 152-156. doi: 10.1038/nature13279
41. Zheng Y., Valdez P.A., Danilenko DM., Hu Y., Sa S.M., Gong Q., Abbas A.R., Modrusan Z., Ghilardi N., de Sauvage F.J., Ouyang W. Interleukin 22 mediates early host defense against attaching and effacing bacterial pathogens. Nat. Med., 2008, vol. 14, pp. 282-289. doi: 10.1038/nm1720
42. Zhou L., Zhang M., Wang Y., Dorfman R.G., Liu H., Yu T., Chen X., Tang D., Xu L., Yin Y., Pan Y., Zhou Q., Zhou Y., Yu C. Faecalibacterium prausnitzii Produces butyrate to maintain Th17/Treg balance and to ameliorate colorectal colitis by inhibiting histone deacetylase. Inflamm. Bowel Dis, 2018, vol. 24, iss. 9, pp. 1926-1940. doi: 10.1093/ibd/izy182
Авторы:
Букина Ю.В., ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Запорожского государственного медицинского университета, г. Запорожье, Украина;
Федонюк Л.Я., д.м.н., профессор, зав. кафедры медицинской биологии Тернопольского государственного медицинского университета им. И.Я. Горбачевского, г. Тернополь, Украина; Коваль Г.Д., д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии Буковинского государственного медицинского университета, г. Черновцы, Украина;
Шеховцова Ю.А., к.м.н., ассистент кафедры внутренней медицины и эндоскопии Харьковского национального медицинского университета, г. Харьков, Украина; Камышный А.М., д.м.н., профессор, зав. кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Запорожского государственного медицинского университета, г. Запорожье, Украина;
Губарь А.А., к.м.н., доцент кафедры урологии Запорожского государственного медицинского университета, г. Запорожье, Украина;
Губка В.А., д.м.н., доцент, профессор кафедры госпитальной хирургии Запорожского государственного медицинского университета, г. Запорожье, Украина.
Поступила в редакцию 18.02.2019 Принята к печати 20.05.2020
Authors:
Bukina Yu.V., Assistant Professor, Microbiology, Virology and Immunology Department, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine;
Fedoniuk L.Ya., PhD, MD (Medicine), Professor, Head of Medical Biology Department, Gorbachevskij Ternopil State Medical University, Ternopil, Ukraine;
Koval G.D., PhD, MD (Medicine), Professor of Clinical Immunology,
Allergology and Endocrinology Department, Bukovinian State
Medical University, Chernovtsy, Ukraine;
Shekhovtsova Iu.O., PhD (Medicine), Assistant Professor,
Department of Internal Medicine and Endocrinology, Kharkiv
National Medical University, Kharkiv, Ukraine;
Kamyshnyi A.M., PhD, MD (Medicine), Professor, Head
of Microbiology, Virology and Immunology Department, Zaporozhye
State Medical University, Zaporozhye, Ukraine;
Gubar A.O., PhD (Medicine), Associate Professor, Urology
Department, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye,
Ukraine;
Gubka V.O., PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Professor of Hospital Surgery Department, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine.
Received 18.02.2019 Accepted 20.05.2020
