CC BY
16
DOI 10.29254/2077-4214-2017-4-3-141-231-234 УДК: 616-092:618.112:618.112:616-092.4
Cpi6Ha В. О., Грушка Н. Г., Кондрацька О. А., Блашкв Т. В., Янчй Р. I.
РОЗПОД1Л ОДНОНИТКОВИХ РОЗРИВ1В ДНК ЯДЕР ООЦИТ1В В УМОВАХ ВПЛИВУ АНТИОКСИДАНТА, БЛОКАТОРА ПАРП, СУБСТРАТА
NOS, БЛОКАТОРА iNOS
1нститут фiзiолоrïï iM. О.О. Богомольця НАН Укра'ши (м. Кив)
Роботу виконано в рамках НДР в^ту iмyнофi-зюлогп 1нституту фiзiоnогiï iM. О.О. Богомольця НАН Укра'ши: «Доошдження молекулярно-генетичних та iмyнопатоnогiчних механiзмiв функцюналыних пору-шень жшочо' репродуктивно' системи та можливост ïx корекцп» (державний реестрацмний номер теми 0112U008233).
Вступ. Проблема передчасно' недостатностi яеч-ниюв (ПНЯ) у сучасному сycпinьствi стае все бтыш актуальною через вщстрочку материнсыкого вiкy та становиты одну i3 причин безпniдця, а також значно попршуе якiсты життя молодих жiнок.
В основi ПНЯ буды-якого ^енезу лежиты невласти-вий репродуктивному в^ дефiцит примордiаnыниx фоniкyniв, аж до повного виснаження оварiалыного резерву. Незважаючи на те що у деяких жшок може спостерiгатися рют власних фоniкyniв, якiсты яйцекш-тини при цыому рiзко знижено [1].
ПНЯ вивчаюты на моделях з використанням гри-зyнiв [6,12,13], основы дослщження спрямованi на корекцiю пошкодження яечникiв [7,8,10,11].
Ранiше нами, з використанням моделi експе-рименталыного iмyнного ушкодження, яка частко-во вщображае ПНЯ, було встановлено пригнiчення мейотичного дозрiвання ооцитiв та посилення пошкодження ДНК ядер клггин фо^кулярного оточен-ня ооцитiв, тимуса i niмфатичниx вyзniв (збinышення однониткових розривiв (ОНР) ДНК), а також показано, що ц досniджyванi показники покращуютыся при застосyваннi антиоксиданту, блокатора NO-синтази, через ймовiрне зменшення проявiв оксидативно-ы-трозативного стресу[3,4].
Виходячи iз мовленого вище, актуалыними на сыогодн е вивчення можливого (NO-залежного) ме-xанiзмy регуляцп репарацп ДНК, що вщображаетыся як ОНР а саме дослщження особливостей розподiny ОНР ДНК ядер ооци™ в експерименталыних умовах впливу in vitro антиоксиданта, блокатора полi (АДФ-рибозо) поniмерази (ПАРП), блокатора NO-синтази, субстрату NOS, що ранше не було вивчено.
Мета роботи полягала у дослщжены розподту ОНР ДНК ядер ооцитiв in vitro в умовах впливу антиоксиданта (ресвератрол), блокатора ПАРП (4- пдро-ксиквшазолш), субстрата NOS (_-арпнш гщрохло-рид), блокатора iNOS (амшогуанщин).
Об'ект i методи дослiдження. Дослщи проводили на статевозрinиx самицях мишей л i н i ï СВА масою 18-22 г з дотриманням вимог 6вропейсыко'| конвенцп про захист хребетних тварин, що викорис-товуютыся для дослщних та iншиx наукових цinей,
(Страсбург 1986) та Закону Укра'ши «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» (2006).
Ооцити неферментативно (мехаычно) видтяли з яечникiв мишей та кулытивували протягом 4 год. в окремих камерах по 400 мкл кулытуралыного серед-овища DME з 15 mM HEPES, концентрацiя Са12+ 1,71 mM, температура 37°С з наступними речовинами: _-аргiнiн гiдроxnорид - субстрат NOS у концентрацп 0,04 mM; амшогуанщин, АГ- специфiчний блокатор iNOS у концентрацп 0,02 mM; 4- гщроксиквшазолш4-ГК - блокатор ПАРП-1у концентрацп 1,0 mM; ресвератрол - антиоксидант у концентрацп 2,0 цМ. ВЫ вико-ристан речовини виробництва фiрми «Sigma»,США.
Для виявлення ОНР ДНК ядер ооци™ використо-вували метод лужного гелы-електрофорезу iзоnыова-них кniтин (метод ДНК-комет - «DNA-comet assay») [9]. Згщно методицi за позитивний контролы вико-ристовували ооцити, якi пiсnя перюду кулытивування (4 год.) пщдавали впливу Н2О2 (температура 4еС, 250mM, 5 хв.). Негативний контролы - кулытивован протягом 4 год. ооцити в середовищi DME з 15 мМ HEPES. Анаniз ДНК-комет, забарвлених Хехст 33342 (700 мкмолы/л), здiйснюваnи вiзyалыно, використову-ючи nюмiнесцентний мiкроскоп ЛЮМАМ И-1 (Росiя) при застосyваннi водночмерЫйного об'ектива (430). На кожному мiкропрепаратi анаniзyваnи не менше 30 окремо розташованих ДНК-комет. За стввщношен-ням ДНК у "головГ' та "хвостГ' комети подinяnи на 5 клаЫв (0-4).
Резулытати обробляли статистично в програмi Graph Pad Prism version 5.00 for Windows (Graph Pad Soft ware, California USA). Пюля перевiрки на нор-маnынiсты розподту аналiз груп даних проводили з використанням one-way ANOVA з подалышим мно-жинним порiвнянням за допомогою пост-хок тесту Newman-Keuls. Вщмшност вважали статистично значущими при р<0,05. Резулытати виражали як M±m (середне ± стандартна похибка).
Результати дослщження та ïx обговорення. Встановлено, що блокатор ПАРП-1 - 4-ГК блокатор iNOS- АГ а також 'х комбша^я, призводяты до пере-розподту ОНР ДНК ооцитiв у бк збinышення пошкодження ДНК. Субстат NOS _-арпнш та антиоксидант ресвератрол не чинили пошкоджувалыного впливу на ДНК ооци™, навпаки вiдмiчаnосы певне збтышення кinыкостi кniтин з ядрами 0/1 класу (рис. 1).
Вщомо, що розриви ДНК, спричиненi, зокрема, й активними формами азоту, активуюты ПАРП, що е необxiдним для процеЫв репарацп. Однак, при силы-ному yшкодженнi ДНК надмiрна актива^я ПАРП може призводити до значного збтышення синтезу проза-
100
80
60
40 --
20
L гтИ IT I
□ 0/1 клас
□ 2 клас
■ 3 клас
■ 4 клас
-9-, *
lu
1
Негат. контроль
4-ГК
АГ
L-apriHÍH Ресверагрол 4-ГК+АГ
форм кисню та азоту, посилення гено-токсичного стресу та актива^я ПАРП [2,5,17].
Нами вперше отримано данi, якi свiдчать про те, що за умов впли-ву 4-ГК i L-аргiнiна (вщповщно 1,0 mM/0,04mM) вiдбуваeться зменшен-ня пошкодження ДНК ядер ооцитiв по вщношенню до величин у груп 4-ГК: частки ядер ооцитiв 3 i 4 кпаЫв змен-шуються у, вiдповiдно, 1,7 рази i 2,1 рази, а ядер 0/1 i 2 кпаЫв зростають у, вщповщно, 3,1 рази i 1,9 рази; за умов впливу 4-ГК i ресвератрола (вщповщно 1,0 тМ/2,0цМ) вщбуваеться Рис. 1. Вплив 4-ГК, АГ, L-арпнша, ресвератрола на розподш ОНР ДНК зменшення пошкодження ДНК ооци-
ядер ооци1ЧВ. ^в, а саме - частка кттин з ядрами 3
Примпжи: * - р<0.05 - в1рог1дн1сть в1дм1нностей величин середн1х груп даних вщносно i 4 класу зменшуеться у вщповщно
1,4 рази i 1,8 рази, а частки ядер 0/1, 2 клаЫв зростають у, вщповщно, 2,6 рази i 1,7 рази у порiвняннi з такими за умов культивування з 4-ГК (рис. 2, 3).
За умов впливу АГ i ресвератрола (вщповщно 0,02 тМ/ 2,0 цМ) вщбуваеться зменшення пошкодження ДНК ооци™, а саме - частка кштин з ядрами 3 i 4 класу зменшуеться до, вщповщно, 22,78±1,53% (p<0.05, n=6) i 25,19±1,67% (p<0.05, n=6) у по-рiвняннi з, вiдповiдно, 32,96±1,67% i 35,93±1,67% за умов культивування з АГ, а ядер 0/1 класу зростае до 31,85±1,67% (p<0.05, n=6) по вщно-шенню до величини за умов культивування з АГ - 12,22±2,72%.
Отриманi нами данi узгоджуються з
таких величин у негативному контроль
100
80
60
40 —
20
1
□ 0/1 клас
□ 2 клас
■ 3 клас
■ 4 клас
S *
m
Негат. контроль 4-ГК
L-арпшн 4-FK+L-aprÍHÍH
Рис. 2. Вплив 4-ГК i L-аргiнiна на розподiл ОНР ДНК ядер ооцитiв.
Примпжи: *— р<0.05 - вiрогiднiсть вiдмiнностей величин середнiх груп даних вщносно таких величин у негативному контроле
m
□ 0/1 клас
□ 2 клас
■ 3 клас
■ 4 клас
Б-р<0.05^ропднють вщмшностей величин середнiх груп даних вщносно таких величин [14-16] i можуть забезпечити в майбут-у rpyni 4-ГК. ньому обфунтування нов1тн1х п1дход1в,
спрямованих на зменшення пошкодження ДНК, а отже i в терапевтичних цтях - на корекцю ПНЯ у ж1нок.
Таким чином, отриман дан1 про розподт ОНР ДНК ооцит1в в умовах впливу антиоксиданта (ресвератрол), блокатора ПАРП (4-ГК), субстрата NOS (1_-арпын), блокатора iNOS(Ar) i |'х ана-л1з дають п1дстави стверджувати, що NO бере участь в регуляцп репараци ОНР ДНК ооцит1в.
Висновки. Представлен! резуль-тати досл1дження Ытегрально'! цтю-ност1 генома ооцит1в з використанням антиоксиданту (ресвератрол), блока-тору ПАРП-1 (4-ГК), субстрата NOS (_-арпн1н), блокатору iNOS (АГ) дають пщстави стверджувати NO-залежнiсть регуляцп репарацп ДНК, що вщобра-жаеться як однонитковий розрив. Перспективи подальших дослiджень. Необ-х1дно окремо детально вивчити розподт ОНР ДНК ядер кл1тин фолкулярного оточення ооцит1в в умовах впливу антиоксиданта (ресвератрол), блокатора ПАРП, субстрата NOS, блокатора iNOS.
.100 80 60 40 20 0
int
Негат. контроль 4-ГК
Ресвератрол
4-ГК+Ресвер
Рис. 3. Вплив 4-ГК i ресвератрола на розподш ОНР ДНК ядер ооци^в.
Примпжи: * - р<0.05 - вiрогiднiсть вiдмiнностей величин середнiх груп даних вщносно таких величин у негативному контроле
Б - р<0.05^ропднють вiдмiнностей величин середнiх груп даних вщносно таких величин у груп 4-ГК.
пальних чинник1в та посилення загибел1 кл1тин по некротичному типу 1з розривом плазматично! мемб-рани. Вихщ кл1тинного вм1сту назовн1, в свою чергу, активуе кл1тини-ефектори запалення, наслщком чого е синтез прозапальних цитоюыв, генерац1я активних
Лiтература
1. Kas'yan Ye.S. Problema prezhdevremennoy yaichnikovoy nedostatochnosti. Sovremennyye podkhody k diagnostike i lecheniyu / Ye.S. Kas'yan // Slovo o zdorov'ye. - 2017. - № 11. - S. 35-40.
2. Makogon N.V. PolH(ADF-ribozo) polHmeraza 1: fHZHologHchna ta patofHZHologHchna rol' / N.V. Makogon, H.M. Alekseyeva // FHZHologHchniy zhurnal - 2012. - T. 58, № 3. - S. 95-112.
3. SrHbna V.O. OdnonitkovH rozrivi DNK yader klHtin folHkulyarnogo otochennya ootsitHv, timusa н lHmfatichnikh vuzlHv za umov yeksperimental'nogo Hmunnogo ushkodzhennya ta zastosuvannya antioksidanta / V.O. SrHbna, N.G. Grushka, R.H. YanchHy // VHsnik problem bHologHH' н meditsini. - 2016. - № 2, tom 3 (130). - S. 195-199.
4. Funktsional'noye sostoyaniye yaichnika, matki, timusa i limfaticheskikh uzlov u myshey s eksperimental'nym immunokompleksnym povrezhdeniyem v usloviyakh vvedeniya substantsii nanochastits nol'-valentnogo zheleza / V.A. Sribnaya, A.P. Litvinenko, L.S. Reznichenko [ta Hn.] // Problemy reproduktsii. - 2016. - № 22 (4). - S. 20-27.
5. A review on PARP1 inhibitors: Pharmacophore modeling, virtual and biological screening studies to identify novel PARP1 inhibitors / S. Singh, J. Sarma, L. Narasu [et al.] // Curr Top Med Chem. - 2014. - № 14 (17). - Р. 2020-2030.
6. Autoantibodies to heat-shock protein, HSPA5, and epitope spreading: high-dose dexamethasone therapy rescues ovarian function in experimental autoimmune ovarian insufficiency mouse model / K. Kadam, P. Mande, N. Gawas [et al.] // Am J Reprod Immunol. - 2016. - № 75 (5). - P. 580-593.
7. Autoimmune polyglandular syndrome type 3 (APS-3) among patients with premature ovarian insufficiency (POI) / K. Szlendak-Sauer, D. Jakubik, M. Kunicki [et al.] // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2016. - № 203. - P. 61-65.
8. Autoimmune primary ovarian insufficiency / C. Silva, L. Yamakami, N. Aikawa [et al.] // Autoimmun Rev. - 2014. - № 13 (4-5). -P. 427-430.
9. Assessment of 1,2-propanediol (PrOH) genotoxicity on mouse oocytes by comet assay / A. Berthelot-Ricou, J. Perrin, C. di Giorgio [et al.] // Fertil Steril. - 2011. - Vol. 96. - Р. 1002-1007.
10. Bukovsky A. Immunoregulation of follicular renewal, selection, POF, and menopause in vivo, vs. neo-oogenesis in vitro, POF and ovarian infertility treatment, and a clinical trial / A. Bukovsky, M. Caudle // Reprod Biol Endocrinol. - 2012. - № 10. - P. 97-112.
11. Growth hormone treatment of premature ovarian failure in a mouse model via stimulation of the Notch-1 signaling pathway / T. Liu, S. Wang, L. Zhang [et al.] // Exp Ther Med. - 2016. - № 12 (1). - P. 215-221.
12. Hydrogen-rich Water Exerting a Protective Effect on Ovarian Reserve Function in a Mouse Model of Immune Premature Ovarian Failure Induced by Zona Pellucida3 / X. He, S. Wang, C. Yin [et al.] // Chin Med J. - 2016. - № 129 (19). - P. 2331-2337.
13. Psychosocial vulnerability, resilience resources, and coping with infertility: a longitudinal model of adjustment to primary ovarian insufficiency / M. Driscoll, M. Davis, L. Aiken [et al.] // Ann Behav Med. - 2016. - № 50 (2). - P. 272-284.
14. Resveratrol during in vitro maturation improves the quality of bovine oocyte and enhances embryonic development in vitro / V. Torres, L. Mucoz, R. Urrego, [et al.] // Reprod Fertil Dev. - 2016. - № 29 (1). - P. 199-203.
15. Resveratrol protects mouse oocytes from methylglyoxal-induced oxidative damage / Y Liu, X. He, X. Huang [et al.] // PLoS One.
- 2013. - № 8 (10). - P. 779-806.
16. Resveratrol-induced mitochondrial synthesis and autophagy in oocytes derived from early antral follicles of aged cows / M. Sugi-yama, R. Kawahara-Miki, H. Kawana [et al.] // J Reprod Dev. - 2015. - № 61 (4). - P. 251-259.
17. Veith S. RecQ helicases and PARP1 team up in maintaining genome integrity / S. Veith, A. Mangerich // Ageing Res Rev. - 2015.
- № 23 (A). - P. 12-28.
РОЗПОД1Л ОДНОНИТКОВИХ РОЗРИВ1В ДНК ЯДЕР ООЦИТ1В В УМОВАХ ВПЛИВУ АНТИОКСИ-ДАНТА, БЛОКАТОРА ПАРП, СУБСТРАТА NOS, БЛОКАТОРА iNOS Cpi6Ha В. О., Грушка Н. Г., Кондрацька О. А., Блашюв Т. В., Янчш Р. I.
Резюме. Мета роботи полягала у до^джены розподту однониткових розр^в ДНК ядер ооцитв в умовах впливу антиоксиданта, блокатора ПАРП, субстрата NOS, блокатора iNOS in vitro. Для вивчення розподту однониткових розривiв ДНК ядер ооци^в використовували метод лужного гель-електрофорезу iзо-льованих кл™н (метод ДНК-комет - «DNA-comet assay»).
Отриман дан про розподт однониткових розривiв ДНК ооци^в в умовах впливу антиоксиданта (рес-вератрола), блокатора ПАРП (4-гщроксиквшазолЫ), субстрата NOS ^-арпын), блокатора iNOS (амшогуа-нщин) дають пщстави стверджувати, що NO бере участь в регуляци репарацп однониткових розривiв ДНК ооци^в, що може забезпечити в майбутньому обфунтування нов^ых пiдходiв, спрямованих на зменшення пошкодження ДНК, а отже i в терапевтичних цтях - на корекцт передчасно! недостатност яечниюв у жшок.
Ключовi слова: однонитковi розриви ДНК, ооцити, передчасна недостатнють яечниюв.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК ЯДЕР ООЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ВЛИЯНИЯ АНТИОКСИДАНТА, БЛОКАТОРА ПАРП, СУБСТРАТА NOS, БЛОКАТОРА iNOS
Срибная В. А., Грушка Н. Г., Кондрацкая Е. А., Блашкив Т. В., Янчий Р. И.
Резюме. Цель работы заключалась в исследовании распределения однонитевых разрывов ДНК ядер ооцитов в условиях воздействия антиоксиданта, блокатора ПАРП, субстрата NOS, блокатора iNOS in vitro. Для изучения распределения однонитевых разрывов ДНК ядер ооцитов использовали метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет - «DNA-comet assay»).
Полученные данные о распределении однонитевых разрывов ДНК ооцитов в условиях воздействия антиоксиданта (ресвератрол), блокатора ПАРП (4-гидроксиквиназолин), субстрата NOS (L-аргинин), блокатора iNOS (аминогуанидин) дают основания утверждать, что NO участвует в регуляции репарации однонитевых разрывов ДНК ооцитов, что может обеспечить в будущем обоснования новых подходов, направленных на уменьшение повреждения ДНК, а значит и в терапевтических целях - на коррекции преждевременной недостаточности яичников у женщин.
Ключевые слова: однонитевые разрывы ДНК, ооциты, преждевременная недостаточность яичников.
OOCYTES SINGLE-STRAND DNA BREAKS WITH THE INFLUENCE OF ANTIOXIDANT, PARP-1 IHIBITOR, NO SYNTHASE SUBSTRATE, iNOS IHIBITOR
Sribna V. O., Grushka N. G., Kondratska O. A., Blashkiv T. V.,
Yanchiy R. I.
Abstract. Premature ovarian failure (POF) - an ovarian function disorder affecting women under 40 - is actively studied. This disease is fairly widespread due to the delay in maternal age, and today is a medical and social problem. POF is studied on models using rodents and main researches are aimed at correction of ovarian disorder.
Previously, using a model of experimental immune complex-mediated failure, which partially reflects POF, inhibition of oocytes meiotic maturation and increased DNA damage of follicular cells surrounding oocytes, thymic and lymph nodes cells (increase of single-strand breaks of DNA) was established, and it was shown that these investigated parameters are improved with the use of antioxidant, iNOS ihibitor, because of the probable reduction of manifestations of oxidative-nitrosatitative stress.
The purpose of the work was to investigate the distribution of single-strand DNA breaks of oocyte nuclei with the influence of antioxidant, PARP inhibitor, iNO-synthase inhibitor, NOS substrate.
The study was carried out on non-pregnant female BCA mice. For DNA damage assessment DNA-comet assay (alkaline) was used. Comets were separated into 4 classes (0/1; 2; 3; 4) depending on the value of DNA in the "head" and "tail" of comet.
It was established that the PARP inhibitor - 4-Hydroxyquinazoline (4-GQ) and iNOS ihibitor - aminoguanidine (AG), as well as their combination, lead to the redistribution of single-strand DNA breaks of oocytes in the direction of increasing the DNA damage. NOS substrate L-arginine and antioxidant resveratrol did not have a damaging effect on the DNA of oocytes, on the contrary, there was a certain increase in the number of cells with nuclei 0/1 classe.
It was obtained that under the influence of 4-GQ and L-arginine (1.0 mM / 0.04 mM, respectively) there was a decrease in the oocyte DNA damage in relation to the values in the group of 4-GQ: the particles of 3 and 4 classe's nuclei decrease in, respectively, 1,7 and 2,1 times, and nuclei 0/1 and 2 classes increase in, respectively, 3,1 and 1,9 times; under the influence of 4-GQ and resveratrol (1.0 mM / 2.0цМ, respectively), there was obtained a decrease in the oocyte DNA damage, namely, the proportion of cells with 3 and 4 class's nuclei decrease in, respectively, 1,4 and 1,8 times, and the particles of nuclei 0/1, 2 classes increase in, respectively, 2,6 and 1,7 times as compared to those under the influence of 4-GQ.
Under the influence of AG and resveratrol (0,02 mM / 2,0 цМ, respectively), there was a decrease in the oocyte DNA damage, namely, the number of cells with 3 and 4 class nuclei was reduced to 22.78 ± 1.53% (p < 0.05, n = 6) and 25.19 ± 1.67% (p <0.05, n = 6) compared with, respectively, 32.96 ± 1.67% and 35.93 ± 1.67% under the influence of AG, and 0/1 class nuclei increased to 31.85 ± 1.67% (p <0.05, n = 6) relative to the value under the influence of AG - 12.22 ± 2.72%.
Conclusions. The results of the study of the integral integrity of the oocyte genome using antioxidant (resveratrol), the PAPP-1 (4-GK) inhibitor, the NOS substrate (L-arginine), the iNOS inhibitor (aminoguanidine) give grounds to defend the NO-dependence of the DNA repair regulation, which is displayed as single-strand DNA breaks.
Keywords: single-strand DNA breaks, oocytes, premature ovarian failure.
Рецензент - проф. fly6iHiH С. I.
Стаття надшшла 01.11.2017 року
