CC BY
37
1 ' 20 16
Том 12 / Vol. 12
Роль воспалительного компонента опухолевого микроокружения эндометриоидной аденокарциномы тела матки при различных исходах заболевания
Д.А. Зиновкин
ГУ«Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека»; Республика Беларусь, 246040, Гомель, ул. Ильича, 290
Контакты: Дмитрий Александрович Зиновкин [email protected]
Представлены данные о прогностической значимости опухоль-ассоциированных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, естественных киллеров, макрофагов и дендритных клеток в отношении эндометриоидной аденокарциномы. Также определена их роль в ранней (до 3 лет) прогрессии данного заболевания.
Ключевые слова: опухолевое микроокружение, прогноз, эндометриоидная аденокарцинома
DOI: 10.17 650/1994-4098-2016-12-1-73-78
The role of tumor inflammatory component of the tumor microenvironment of the endometrioid adenocarcinoma
of the corpus uteri in different disease outcomes
D.A. Zinovkin
Republican Research Center for Radiation Medicine and Human Ecology; 290 Il'icha St., Gomel', 246040, Republic of Belarus
This article presents data on the role of tumor associated T cells, B cells, natural killer cells, macrophages and dendritic cells in the prognostic value of the endometrioid adenocarcinoma. Furthermore, there was determining of its role in the early (up to 3 years) progression of the disease.
Key words: tumor microenvironment, prognosis, endometrioid adenocarcinoma
Введение
Микроокружение большинства эпителиальных опухолей состоит из разрастающихся клеток эпителиального компонента опухоли и десмопластической стромы, к которой относятся стромальные клетки, сосудистая сеть и инфильтрат иммунных клеток. Локальный иммунный ответ играет важную роль в защите организма от прогрессирования и инвазии злокачественной опухоли [1]. Известно, что воспалительные клетки, инфильтрирующие опухоль, представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из разных субпопуляций: опухоль-ассоциированных Т-лимфо-цитов (ОАТ), опухоль-ассоциированных В-лимфоци-тов (ОАВ), опухоль-ассоциированных естественных киллеров (ЕК), опухоль-ассоциированных макрофагов (ОАМ) и дендритных клеток (ДК). Роль данной воспалительной инфильтрации при злокачественных новообразованиях до сих пор до конца не ясна. Изначально предполагалось, что воспалительные клетки, ассоциированные с опухолью, проявляют исключительно противоопухолевое действие. Однако регрессия злокачественных образований под действием иммунной системы встречается крайне редко. И более того,
известно, что некоторые популяции макрофагов зачастую проявляют функции, способствующие опухолевому ангиогенезу [2].
Наиболее часто выявляемым типом рака эндометрия является эндометриоидная аденокарцинома (ЭА) которая выявляется, по мнению ряда авторов, в 75— 90 % всех случаев [3, 4]. Несмотря на это, на сегодняш- » ний день роль различных клеток локального иммун- ™ ного ответа в развитии и прогнозе ЭА тела матки — изучена недостаточно.
09
Материалы и методы
Характеристика пациенток. В исследовании ис- и пользовались данные Белорусского канцер-регистра и архивный гистологический материал 60 пациенток с патогистологически верифицированным диагнозом и ЭА I—III стадии (FIGO, 2009). Пациентки были разде- ™ лены на 2 группы: в 1-ю вошли женщины, имевшие е рецидивы либо умершие от ЭА в течение 5 лет после 4 постановки диагноза (неблагоприятный исход); ж во 2-ю — не имевшие рецидивов в течение данного пе- » риода (благоприятный исход). Группы были равнозначны по клинической стадии заболевания, степени
1 ' 2 0 16
Том 12 I Vol. 12
дифференцировки опухоли и получаемому лечению. Средний возраст больных в группе с благоприятным исходом составил 62,7 ± 10,1 года; с неблагоприятным — 65,2 ± 9,6 года.
Иммуногистохимическое окрашивание. Для исследования готовили срезы толщиной 3—4 мкм, которые монтировали на обработанные L-полилизином предметные стекла. Иммуногистохимическую реакцию проводили на срезах, полученных с парафиновых блоков опухолей, фиксированных в формалине и прошедших обычную проводку с использованием высокотемпературных методов восстановления антигенной иммунореактивности (обработка в микроволновой печи). В данном исследовании использовали первичные моноклональные мышиные антитела (Diagnostic Biosystems, США): для выявления ОАМ — антитела к CD68, ОАТ - к CD3, ОАВ - к CD20, ЕК - к CD57 и для детекции ДК — антитела к S100. Визуализацию результатов иммуногистохимической реакции и контрокрашивание гематоксилином проводили с помощью системы визуализации антител Mouse UnoVue™ HRP/DAB Detection System Kit (Diagnostic Biosystems, США).
Морфометрическое исследование. Микропрепараты фотографировали с помощью микроскопа Nicon Eclipse 50i c цифровой фотокамерой DS-F1 с разрешением 1689 на 1415 пикселей в 5 неперекрывающихся полях зрения. Подсчет параметров проводили с использованием пакета прикладных программ для анализа изображений. Все измерения осуществляли при увеличении х 400, площадь одного поля зрения составляла 6299,11 х 397,67 = 118 952,07 мкм2. Экспрессию антител оценивали исходя из процента иммуногистохимически позитивных клеток на 100 клеток в поле зрения, результат выражали в процентном содержании позитивных клеток.
Статистический анализ. Обработку данных проводили с использованием пакета программ МеёСа1е у15.4. При сравнении исследуемых групп по иммуно-гистохимическим критериям применяли ЯОС-анализ (данные были представлены медианой, нижним и верхним квартилями). Обязательным компонентом ЯОС-анализа являлось определение доверительного интервала (ДИ) и площади под ЯОС-кривой (ЛИС). При ЛИС 0,9—1,0 качество прогностической модели признается отличным; 0,8—0,9 — очень хорошим; 0,7— 0,8 — хорошим; 0,6—0,7 — средним; 0,5—0,6 — неудовлетворительным [5].
Пороговые значения показателей, полученных при ЯОС-анализе, были использованы для расчета относительного риска (ОР) раннего (до 3 лет) неблагоприятного исхода заболевания. Для этого все пациентки были перераспределены на 2 группы: 1-я — с ранней (до 3 лет) прогрессией заболевания и гибелью пациенток; 2-я — прожившие более 3 лет после постановки диагноза. Статистически значимыми считали результаты прир < 0,05.
Результаты
В данном исследовании в группе с неблагоприятным исходом медиана экспрессии СБ3 составляла 28,8 % (9,4—62,1 %); в группе с благоприятным исходом - 43,8 % (14,8-53,4 %). При проведении ЯОС-ана-лиза экспрессии СБ3 установлено, что ЛИС составила 0,868 (ДИ 0,746-0,942; р < 0,001). Чувствительность составила 83,3 % (ДИ 65,3-94,4), специфичность — 96,7 % (ДИ 82,8-99,9), пороговое значение показателя - 36,9 %.
Экспрессия СБ3 проявлялась в виде коричневого окрашивания мембран и цитоплазмы ОАТ различной интенсивности в зоне инвазии ЭА, с расположением данных клеток преимущественно возле железистого компонента опухоли (рис. 1).
Л - Л: 'ййЬдагг
г.?( - т
m ШЩЁ
швЁШШ
Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD3 в ОАТ: а — неблагоприятный исход; б -Здесь и на рис. 2—5: хромоген — диаминобензидин; контрокрашивание гематоксилином Майера
благоприятный исход. х 100.
ОПУХОЛИ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ
1 ' 20 16
Оригинальные статьи ALE REPRODUCTIVE SYSTEM I Том 12 / Vol. 12
Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с антителами к СБ20 в ОАВ: а — неблагоприятный исход; б — благоприятный исход. х 200
Рис. 3. Иммуногистохимическая реакция с антителами к СБ57 в ЭА: а — неблагоприяный исход; б — благоприятный исход. х 100
В 1-й группе больных ЭА медиана экспрессии СБ20 составляла 37,2 % (0-65,2 %); во 2-й - 35,5 % (30,8-52,7 %). ЛИС при проведении ЯОС-анализа экспрессии СБ20 ОАВ была равна 0,638 (ДИ 0,5040,758; р = 0,074). Чувствительность составила 46,7 % (ДИ 28,3-65,7), специфичность - 96,7 % (ДИ 82,899,9), пороговое значение показателя - 38,1 %.
ОАВ имели хорошо выраженное мембранное окрашивание; отмечались очаги плотно расположенных ОАВ, формирующие округлые инфильтраты (рис. 2).
Медиана экспрессии СБ57 в группе с благоприятным исходом составляла 24,3 % (0-47,4 %); в группе с неблагоприятным исходом - 45,6 % (22,0-71,4 %). При проведении ЯОС-анализа экспрессии СБ57 установлено, что ЛИС была равна 0,909 (ДИ 0,807-0,968; р < 0,0001). Чувствительность составила 83,3 % (ДИ 65,3-94,4), специфичность - 96,7 % (ДИ 82,8-99,9), пороговое значение показателя - 30,8 %.
При иммуногистохимическом исследовании в ЕК-клетках определялось окрашивание цитоплазмы
и мембраны. Степень инфильтрации данными клетками зоны инвазии ЭА варьировала от слабой до умерен -ной (рис. 3).
В группе пациенток с неблагоприятным исходом »
ЭА медиана экспрессии СБ68 составляла 38,2 % ™
(15,3-65,7 %); в группе с благоприятным исходом - —
64.6 % (44,5-84,2 %). ЛИС при проведении ЯОС-ана- = лиза экспрессии СБ68 ОАМ была равна 0,918 (ДИ ш 0,818-0,973; р < 0,0001). Чувствительность составила =
76.7 % (ДИ 57,7-90,1), специфичность - 96,7 % (ДИ „ 82,8-99,9), пороговое значение показателя - 45,5 %.
Экспрессия СБ68 определялась как коричневое
окрашивание цитоплазмы ОАМ различной степени и
интенсивности. Макрофаги располагались в виде ин- ™
фильтратов различной степени выраженности по пе- <= риферии опухоли (рис. 4).
в
В 1-й группе больных ЭА медиана экспрессии Б100 ж составляла 27,2 % (0-72,5 %); во 2-й - 28,05 % (17,7- » 36,9 %). ЛИС при проведении ЯОС-анализа экспрессии Б100 ДК составила 0,508 (ДИ 0,375-0,639; .75
1 ' 2 0 16
ОПУХОЛИ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ
Том 12 / Vol. 12 I TUMORS OF FEMALE REPRODUCTIVE Оригинальные статьи
Рис. 4. Иммуногистохимическая реакция с антителами к СВ68 в ЭА: а — неблагоприятный исход; б — благоприятный исход. х 400
Рис. 5. Иммуногистохимическая реакция с антителами к 3100 в ЭА: а — неблагоприятный исход; б — благоприятный исход. х 100
р = 0,923). Чувствительность составила 30 % (ДИ 14,7— 49,4), специфичность - 100 % (ДИ 88,4-100), пороговое значение показателя - 36,9 %. » Б100 экспрессировался на ДК, окрашивая их в ко-
™ ричневый цвет различной интенсивности. В группах — с благоприятным и неблагоприятным исходом опре-° делялись ДК, формирующие слабо выраженные ин-99 фильтраты стромы и желез (рис. 5).
На основании пороговых значений иммуногисто-и химических маркеров в группу пациенток, проживших менее 3 лет, вошли 25 больных, в группу проживших более 3 лет - 35. Для сравнительного анализа и между группами пациенток был проведен расчет ОР ™ раннего неблагоприятного исхода заболевания (см. е таблицу).
Расчет ОР показал, что факторами риска неблаго-ж приятного исхода заболевания являются следующие » прогностические критерии: низкая экспрессия СБ3 * (ОР 7,7; 95 % ДИ 0,4-19,6; р < 0,001), СБ68 (ОР 4,2; и. 95 % ДИ 0,6-9,1; р < 0,001); гиперэкспрессия СБ20
(ОР 5,6; 95 % ДИ 0,8-17,8;р < 0,001) и Б100 (ОР 12,6; 95 % ДИ 0,9-93,2;р < 0,001).
Обсуждение
ОАТ составляют основную популяцию иммунных клеток, инфильтрирующих злокачественные образования, и считаются необходимыми для эффективной элиминации малигнизированных клеток. Выраженная инфильтрация опухоли СБ3+ Т-лимфоцитами ассоциирована с благоприятным прогнозом различных типов рака эндометрия [6]. Кроме того, Р. Сегшакоуа и соавт. (2014) отмечали снижение СБ3+-клеток в строме опухолей Ш-1У стадии и у пациенток с высоким риском рецидивов рака эндометрия [7].
Инфильтрация ЕК-клетками, расположенными в строме опухоли, имеет благоприятное прогностическое значение в течении рака эндометрия. Однако по мнению К. 1по и соавт. (2008) ЕК-клетки не влияют на прогноз течения ЭА [8], что и было подтверждено в нашем исследовании.
1 ' 20 16
Том 12 I Vol. 12
Сравнительный анализ иммуногистохимических показателей у пациенток с различными исходами ЭА
Показатель, % Исход заболевания, n (%) р ОР (95 % ДИ)
прожили менее 3 лет прожили более 3 лет
CD3 < 36,9 22 (88) 1 (2,9) < 0,001 7,7 (0,4-19,6)
> 36,9 3 (12) 34 (97,1)
CD20 < 38,1 13 (52) 32 (91,4) < 0,001 5,6 (0,8-17,8)
> 38,1 12 (48) 3(8,6)
CD57 < 30,8 20 (80) 30 (85,7) 0,815 1,4 (0,7-4,3)
> 30,8 5 (20) 5(14,3)
CD68 < 45,5 18 (72) 6(17,1) < 0,001 4,2 (0,6-9,1)
> 45,5 7 (28) 29 (82,9)
S100 < 36,9 16 (64) 35(100) < 0,001 12,6 (0,9-93,2)
> 36,9 9 (36) 0 (0)
Известно, что ОАМ играют важную роль в канцерогенезе опухолей и в противоопухолевом иммунном ответе. При этом отмечается амбивалентность их функций: с одной стороны, они оказывают цитоток-сический эффект на опухолевые клетки, с другой -инициируя отторжение рака, стимулируют рост, мета-стазирование и ангиогенез опухоли [9].
Полученные нами данные позволили определить влияние отдельных факторов клеточного иммунного ответа на течение ЭА. По данным литературы, снижение количества ОАТ, ЕК-клеток и ОАМ является фактором неблагоприятного исхода заболевания [10]. В нашем исследовании эти данные подтвердились (р < 0,001).
Высокая экспрессия СБ20 ОАВ в нашем исследовании может быть ассоциирована со снижением общего количества ОАТ и ЕК-клеток в перитуморозном инфильтрате при неблагоприятном исходе заболевания (р < 0,001).
Большое количество Б100-позитивных ДК также было ассоциировано с неблагоприятным исходом ЭА. В литературе существует только одна публикация, указывающая на связь выраженной инфильтрации ДК с прогрессией рака [11].
Выводы
Экспрессия клетками локального иммунного ответа маркеров СБ3, СБ57 обладает хорошей прогностической силой, а СБ68 - отличной. В связи с этим данные маркеры могут применяться как иммуногисто-химические предикторы течения ЭА.
При наблюдаемой низкой общей выживаемости (менее 3 лет) чаще наблюдается гиперэкспрессия СБ20 (р < 0,001) и Б100 (р < 0,001), а также низкая экспрессия СБ3 (р < 0,001), СБ57 (р < 0,001), СБ68 (р < 0,001). Это может быть проявлением локального клеточного иммунодефицита как отдельного фактора прогрессии ЭА.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Shurin M.R., Umansky V., Malyguine A. The tumor immunoenvironment. Ed. by M.R. Shurin. New York: Springer, 2013. Pp. 19-125.
2. Жарков Н.В., Нуртазин С.Т., Жаркова И.М. Особенности морфологии и распределения опухоль-ассоциированных макрофагов
в колоректальных карциномах. Вестник Казахского национального университета им. аль-Фараби. Серия Биологическая 2009; 42(3):72-6. [Zharkov M.R., Nurtazin S.T.,
Zharkova I.M. The morphology and distribution of tumor associated macrophages in colorectal carcinomas. Vestnik Kazakhskogo natsional'nogo universiteta im. al'-Farabi. Seriya Biologicheskaya = Bulletin of al-Farabi Kazakhstan National University. Biological Series 2009;42(3):72-6. (In Russ.)].
3. Damjanov I., Fan F. Cancer grading manual. Ed. by I. Damjanov. New York: Springer, 2013.
4. World Health Organization classification of tumors. Pathology and genetics of tumours
of the breast and female genital organs. Lyon, 2000.
5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ Statistica. М.: Медиа-сфера, 2002. [Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. The use of applied programs Statistica. Moscow: Mediasfera, 2001.
(In Russ.)].
6. Jochems C., Schlom J. Tumor-infiltrating immune cells and prognosis: the potential
1 ' 2 0 16
Том 12 / Vol. 12
link between conventional cancer therapy and immunity. Exp Biol Med (Maywood) 2011;236(5):567-79.
7. Cermakova P., Melichar B., Tomsova M. et al. Prognostic significance of CD3+ tumor-infiltrating lymphocytes in patients with endometrial carcinoma. Anticancer Res 2014;34(10):5555-61.
8. Ino K., Yamamoto E., Shibata K. et al. Inverse correlation between tumoral
indoleamine 2,3-dioxygenase expression and tumor-infiltrating lymphocytes in endometrial cancer: its association with disease progression and survival. Clin Cancer Res 2008;14(8): 2310-7.
9. Klink M. Cancer immunoediting: elimination, equilibrium, and immune escape in solid tumors. Ed. by M. Klink. New York: Springer, 2013.
10. Modugno F., Ness R.B., Chen C., Weiss N.S. Inflammation and endometrial cancer: a hypothesis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14(12):
2840-7.
11. Aviary C., LaRue H., Hovington H.
et al. High level of mature tumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer. Hum Pathol 2013;44(8):1630-7.
