CC BY
40
Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 4-5, стр. 347-352 © 2012, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
роль ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА PAX-5 в ПАТОГЕНЕЗЕ БРОНХИАЛЬНОЙ Астмы
Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А., Иванов В.А., Липкин Г.И.
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург
Резюме. Рассмотрены характеристики экспрессии транскрипционного фактора PAX-5 (paired box 5) (BSAP), при разных клинико-патогенетических вариантах бронхиальной астмы (БА). Низкие уровни экспрессии PAX-5 могут быть причиной утяжеления течения АБА, а высокие — одним из значимых факторов в развитии НАБА. Предполагается, что инициация синтеза иммуноглобулина Е является менее важной функцией PAX-5 в патогенезе БА, чем угнетение дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки. Дальнейшее исследование особенностей PAX-5 и его взаимодействий с другими транскрипционными факторами при БА может представлять одно из перспективных направлений в изучении механизмов развития этого заболевания.
Ключевые слова: бронхиальная астма, аллергия, транскрипционные факторы, PAX-5, IgE, B-лимфоциты.
Mineev V.N., Sorokina L.N., Nyoma M.A., Lipkin G.I., Ivanov V.A.
ROLE OF PAX-5 TRANSCRIPTION FACTOR IN PATHOGENESIS OF BRONCHIAL ASTHMA Abstract. Expression characteristics of transcription factor PAX-5 (paired box 5) are considered for different clinical variants of bronchial asthma (BA). Low levels of PAX-5 expression may be a reason for progression into a severe allergic asthma, whereas higher levels of PAX-5 expression may represent a significant factor leading to development of non-allergic bronchial asthma. Initiation of IgE production is supposed to be a less important PAX-5 function in BA pathogenesis, than prevention of B-cell-to-plasmocyte differentiation. Further investigations of PAX-5 properties and its co-operations with other transcription factors may provide a promising path in further research of BA pathogenesis. (Med. Immunol., 2012, vol. 14, N 4-5, pp 347-352)
Keywords: bronchial asthma, allergy, transcription factors, PAX-5
Введение
В последнее время все больше исследователей обращают внимание на внутриклеточные системы лимфоцитов как ключевые точки различных патологических процессов: опухолей, аллергического воспаления, иммунодефицитов. Ранее нами уже рассматривалась сигнальная система JAK-STAT в лимфоцитах (Janus-kinase — signal transductor and activator of transcription) и ее роль в развитии и течении бронхиальной астмы [2, 3, 4, 5]. Основным элементом этой системы явля-
Адрес для переписки:
Минеев Валерий Николаевич 198516, Санкт-Петербург, Петродворец, Санкт-Петербургский пр., 56, кв. 15 Тел.: (812) 450-71-63.
E-mail: [email protected]
IgE, B lymphocytes.
ются транскрипционные факторы STAT (signal transductor and activator of transcription), транс-лоцирующиеся в ходе своей активации в ответ на воздействие на клетку интерлейкинов 4 и 13 (IL-4 и IL-13) из цитоплазмы в ядро. Транскрипционный фактор STAT6 в В-лимфоцитах участвует в процессах синтеза иммуноглобулина Е и рецептора к нему FceR II (CD23) [8, 11]. В В-клеточных процессах принимают участие и другие транскрипционные факторы, формирующие целые каскады взаимодействий, в том числе — белок РАХ-5 (paired box 5), именуемый также BSAP (B-cell specific activator protein). Этот транскрипционный фактор является ключевым фактором развития В-клеток во время лимфопо-эза [6] и наряду со STAT6 участвует в переключении В-лимфоцитов на синтез IgE [8]. По данным литературы, этот белок привлекает внимание
347
Минеев В.Н. и др.
Медицинская Иммунология
преимущественно как один из компонентов патогенеза опухолевых процессов [9, 10].
Роль В-лимфоцитов в развитии бронхиальной астмы позволяет предполагать, что РАХ-5 может быть весьма значимым фактором в патогенезе заболевания [6], поэтому целью нашей работы было оценить роль PAX-5 в механизмах развития бронхиальной астмы (БА), выявить связи содержания РАХ-5 в лимфоцитах больных БА с клиническими и лабораторными характеристиками заболевания.
Материалы и методы
Обследовано 18 практически здоровых лиц, 68 больных аллергической бронхиальной астмой (АБА) и 39 — неаллергической БА (НАБА) разной степени тяжести.
Все обследованные больные БА находились в клинике госпитальной терапии СПбГМУ имени академика И.П. Павлова. Проводилось комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее общеклинические методы, цитологический и бактериологический анализы мокроты, а также аллергологическое обследование. В обследованных группах проводили исследование функции внешнего дыхания. Диагноз устанавливали и проводили лечение в соответствии с критериями и стандартами международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GINA, 2010). Для исследования использовали лимфоциты периферической крови здоровых лиц и больных БА, выделенные на градиенте плотности Lymphoseparation Medium (производство “MP Biomedicals”, США) с использованием стандартной методики выделения мононуклеаров (Boyum, 1968) c последующим удалением моноцитов с осаждением на пластике в условиях инкубации в С02-инкубаторе при 37 °С в течение 1 часа.
Экспрессию мРНК PAX-5, р-актина и тяжелых цепей иммуноглобулина Е (CHe) оценивали путем проведения RT-PCR (reverse transcription-PCR — обратная транскрипция — полимеразная цепная реакция [ПЦР]) c нуклеиновыми кислотами, выделенными из лимфоцитов периферической крови. ПЦР проводилась в амплификаторе «iCycler» (BIO-RAD) в следующем режиме: инициация при 95 °С в течение 4-х минут, 30 циклов денатурации при 95 °С в течение 30 с, «отжига» праймеров при 60 °С в течение 30 с и полимеризации при 70 °С в течение 30 с. Завершающая полимеризация проводилась при 72 °С в течение 7 минут. Продукты амплификации размерами 241 пара оснований (PAX-5), 476 п.о. (CHe) и 315 п.о. (Р-актин) подвергались электрофорезу в 1,5% агарозном геле и окраске этидия бромидом. Результат электрофореза после фотографирования в ультрафиолетовом свете анализировался в программе Gel-Pro 3.1. Уровень экспрессии мРНК PAX-5 оценивался относительно уровня Р-актина.
Праймеры для PAX-5, р-актина, CHe были разработаны на основе известных последовательностей (GenBank) (PAX-5 5’: 5’- GGA ACT TGG AGA GGG AGC TT-3' и PAX-5 3': 5'- GGC TCT ACC TGG CTG TTC TG-3'; р-актин 5': 5'-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3' и р-актин 3': 5'-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3'; CHe 5': 5'-GGG TAC ACC CCA GGG ACT AT -3' и CHe 3’: 5’-TCT GGT GGA GTG GTT CAC AG-3’).
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы SPSS 13.0 с использованием методов и критериев параметрической и непараметрической статистики.
Результаты
Уровни экспрессии мРНК PAX-5 в лимфоцитах периферической крови у больных НАБА существенно выше, чем в группах АБА (р = 0,03) и практически здоровых лиц (р = 0,018) (кри-
ТАБЛИЦА 1. УРОВНИ мРНК РАХ-5 У ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И У БОЛЬНЫХ БА (ИНТЕГРИРОВАННАЯ ПЛОТНОСТЬ по отношению К р-АКТИНУ)
Контрольная группа (п = 18) Больные АБА (п = 58) Больные НАБА (n = 34)
Медиана Процентили Медиана Процентили Медиана Процентили
25-й 75-й 25-й 75-й 25-й 75-й
0,49 0,42 0,66 0,51 0,41 0,64 0,64 0,53 0,76
348
2012, Т. 14, № 4-5
Фактор PAX-5 в патогенезе бронхиальной астмы
ТАБЛИЦА 2. КОРРЕЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ мРНК РАХ-5 С УРОВНЯМИ СЫВОРОТОЧНОГО ОБЩЕГО IgE И мРНК CHs
(коэффиценты корреляции спирмана)
Группы обследованных IgE мРНКCHe
r = 0,343; r = 0,564;
Практически здоровые лица p = 0,211; p = 0,028;
n = 15 n = 15
r = 0,002; r = 0,528;
АБА p = 0,988; p < 0,001;
n = 52 n = 53
r = -0,006; r = 0,499;
НАБА p = 0,976; p = 0,004;
n = 28 n = 32
терий Вилкоксона—Манна—Уитни); значимых различий между группами здоровых лиц и АБА не выявлено (табл. 1).
При проведении анализа по критерию Кра-скела—Уоллеса разница в экспрессии мРНК РАХ-5 между группами больных БА и здоровыми лицами была значимой (H = 8,21; p = 0,017).
С учетом значимости IgE в патогенезе БА проведена оценка экспрессии IgE и мРНК тяжелых цепей IgE и ее связи с экспрессией мРНК РАХ-5 (табл. 2).
Роль PAX-5 в синтезе константных частей тяжелых цепей IgE у больных АБА, вероятно, является несколько более значимой по сравнению с группой НАБА, а вклад PAX-5 в продукцию собственно IgE уменьшается в группах больных БА по сравнению с контрольной группой.
Кроме того, при корреляционном анализе сила и значимость связи экспрессии РАХ-5 с экспрессией CHe были несколько выше в группе больных БА с нормальным и низким содержанием IgE в сыворотке (менее 150 МЕ/мл), чем в группе с высоким содержанием IgE (более
150 МЕ/мл) (г = 0,543; p < 0,001; n = 53 против г = 0,474; p = 0,017; n = 25). Можно предположить, что нарастание концентрации IgE обусловлено снижением контроля продукции его тяжелых цепей со стороны РАХ-5 и повышением активности других транскрипционных факторов, контролирующих синтез CHe (например, STAT6).
Основным исследованием, объективно характеризующим течение БА, является исследование функции внешнего дыхания, поэтому большой интерес представляют связи спирометрических показателей с экспрессией транскрипционных факторов, представленные в таблице 3.
По-видимому, снижение уровней экспрессии мРНК PAX-5 при АБА может быть связано с усилением бронхообструктивных процессов и ростом сопротивления бронхов воздушному потоку.
Еще одной чертой АБА является эозинофилия крови и мокроты. Рассмотрим, насколько связаны уровни экспрессии мРНК с показателями цитологического исследования содержимого бронхов. Нами обнаружена значимая отрицательная корреляция уровня экспрессии мРНК PAX-5
таблица 3. корреляции экспрессии мрнк рах-5 с показателями фвд (коэффиценты корреляции спирмана)
Показатели ФВД АБА НАБА
p = 0,366; p = 0,040;
Индекс Тиффно до бронхолитика p = 0,007; p = 0,833;
n = 53 n = 31
p = 0,366; p = -0,101;
Индекс Тиффно после бронхолитика p = 0,007; p = 0,588;
n = 53 n = 31
МОС50выд / МОС50вд до бронхолитика p = 0,333; p = 0,021; n = 48 p = 0,031; p = 0,866; n = 32
МОС50выд (% от должного) до бронхолитика p = 0,279; p = 0,041; n = 54 p = -0,018; p = 0,922; n = 33
349
Минеев В.Н. и др.
Медицинская Иммунология
□ ИКС □ ИКС+B/B
Рисунок 1. Медианы уровней экспрессии мРНК РАХ-5 в группах больных аллергической БА (АБА) и неаллергической БА (нАБА), принимавших ингаляционные кортикостероиды (икс) и комбинацию ИКС и внутривенных кортикостероидов (ИКС+В/В) (показаны уровни значимости по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни)
с количеством лейкоцитов (р = -0,390; р = 0,040; n = 28) и эозинофилов (p = -0,385; р = 0,043; n = 28) в мокроте больных АБА. При высоком уровне мРНК РАХ-5 (значения экспрессии более 0,9 по отношению к уровню экспрессии мРНК р-актина) подобная связь наблюдалась и с количеством эозинофилов в периферической крови (p = -0,881; р = 0,004; n = 8). Эти данные соотносятся с результатами анализа показателей ФВД и свидетельствуют о возможном блокировании фактором PAX-5 процессов аллергического воспаления.
Как известно, основными препаратами для базисной терапии БА являются глюкокортикостероиды (ГКС). В группе больных, принимавших пероральные ГКС (n = 5), уровень экспрессии мРНК PAX-5 был значительно выше, чем в группе БА, не принимавших пероральные ГКС (0,97±0,44 против 0,62±0,25 по отношению к экспрессии мРНК р-актина, критерий Вилкок-сона—Манна—Уитни, р = 0,049). Значимые различия наблюдались при анализе групп больных НАБА, принимавших только ингаляционные ГКС, и тех, кто дополнительно к этому получал ГКС внутривенно. В группе АБА различия были менее значимыми (рис. 1). Кроме этого, была выявлена значимая положительная корреляция между уровнем экспрессии мРНК PAX-5 и суточной дозой ингаляционных ГКС у больных БА (г = 0,254; р = 0,034; n = 70).
Обсуждение
По данным литературы, транскрипционный фактор РАХ-5 обладает различными функциями. Он не только переключает В-лимфоциты на продукцию IgE, но и обеспечивает приверженность В-клеток своей линии дифференцировки, препятствуя их апоптозу и превращению в плазматические клетки за счет угнетения плазмоцит-специфических генов [8].
Несмотря на то, что РАХ-5 способствует синтезу IgE, у больных БА с высокими уровнями экспрессии PAX-5 в лимфоцитах, тем не менее, наблюдаются меньшая выраженность обструкции по показателям ФВД и низкая степень воспалительных изменений мокроты и ее эозинофилии. В то же время РАХ-5 значимо больше экспрессирован при НАБА. Можно предположить, что нарастание экспрессии РАХ-5 ведет к продлению жизненного цикла В-лимфоцитов и их активности, выражающейся, в том числе, в усиленной презентации растворимых антигенов Т-хелперам. Малое количество PAX-5, вероятно, недостаточно для блокирования диф-ференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые лишаются поверхностных рецепторных комплексов и молекул главного комплекса гистосовместимости II, утрачивая, таким образом, возможность быть антиген-презенти-рующей клеткой [7]. Снижение концентрации РАХ-5 способствует, по всей видимости, преимущественному развитию ^2-пути иммунного
350
2012, Т. 14, № 4-5
Фактор PAX-5 в патогенезе бронхиальной астмы
ответа и аллергического варианта БА. Это может быть подтверждено снижением концентрации РАХ-5 при утяжелении течения АБА. Кроме того, инициирующее переключение В-лимфоцитов на синтез IgE фактором РАХ-5, по-видимому, слабо отражается на концентрации свободной фракции этого иммуноглобулина в сыворотке. Основными продуцентами IgE являются именно плазмоциты, в которых РАХ-5 уже супрессиро-ван. По всей видимости, на этой стадии диф-ференцировки В-клеток основной вклад в синтез IgE вносят уже другие факторы (например, STAT6), что косвенно подтверждается фактом снижения корреляции экспрессий РАХ-5 и CHe у пациентов с высокими уровнями сывороточного IgE. В связи с этим, нельзя исключить, что два этих белка (РАХ-5 и STAT6) обладают взаимным ингибирующим влиянием друг на друга. Ранее нами было выявлено утяжеление проявлений БА у больных с высокими уровнями экспрессии STAT6 [5].
Связь приема ГКС с уровнем экспрессии РАХ-5, вероятно, отражает возможную зависимость синтеза этого белка от транскрипционной активности стероидов. В то же время увеличение экспрессии РАХ-5 и соответствующее угнетение превращения В-лимфоцитов в секреторноактивные плазматические клетки могут лежать в основе противовоспалительного (противоаллергического) действия ГКС.
В заключении можно отметить, что PAX-5 в патогенезе БА в большей степени действует как фактор угнетения дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки, чем как активатор синтеза IgE. Низкие уровни экспрессии PAX-5, по-видимому, могут быть причиной утяжеления течения АБА, а высокие — одним из значимых факторов в развитии НАБА. Можно также предположить, что в В-лимфоцитах существует баланс транскрипционных факторов, регулирующих их секреторную и антиген-пред-ставляющую активность. Нарушение этого баланса может лежать в основе развития БА.
Сложность взаимодействия различных факторов в функционировании В-лимфоцитов требует более пристального внимания как к В-клеткам в целом, так и к сигнальным системам этих клеток. Безусловно, детальной оценки требуют и взаимоотношения транскрипционных факторов с рецепторными звеньями сигнальной системы JAK-STAT и системы IgE — CD23.
Тем не менее, внутри различных каскадов транскрипционных факторов можно выделить преимущественно провоспалительные и проти-
вовоспалительные звенья, что послужит предпосылкой к разработке принципиально новых поколений лекарственных веществ, влияющих на патогенез бронхиальной астмы.
Работа была частично поддержана в 2011 году грантом Правительства Санкт-Петербурга для аспирантов (№ 4/04-05/1-А).
Список литературы
1. Бережная Н.М. Интерлейкин-25 (IL-17E): виновник аллергии и противник рака // Цитокины и воспаление. — 2010. — № 3. — С. 3-14.
2. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии (Часть I) // Аллергология. — 2005. - № 4. - С. 38-44.
3. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии: механизмы негативной регуляции (Часть II) // Аллергология. - 2006. -№ 1. - С. 49-55.
4. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А. Влияние IL-4 на активность транскрипционного фактора STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. - 2009 . - Т. 11, № 2-3. -С.177-184.
5. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И. Фундаментальные и клинические аспекты JAK-STAT-сигнализации — СПб.: ВВМ, 2010. - 120 с.
6. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А., Иванов В.А., Липкин Г.И. Роль транскрипционного фактора PAX-5 в иммунологических процессах // Медицинская иммунология. - 2011. -№ 6. - С. 569-580.
7. Фрейдлин И.С., Тотолян Арег А. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 2001. -389 с.
8. Gould H.J., Beavil R.L., Vercelli D. IgE
isotype determination: epsilon germline gene
transcription, DNA recombination and B-cell differentiation // Br. Med. Bull. - 2000. - Vol. 56, N 4. - P. 908-924.
9. Mahmoud M.S., Huang N., Nobuyoshi M., Lisukov I.A., Tanaka H., Kawano M.M. Altered expression of Pax-5 gene in human myeloma cells // Blood. - 1996. - Vol. 87, N 10. - P. 4311-4315.
351
Минеев В.Н. и др.
Медицинская Иммунология
10. Oppezzo P, Dumas G., Lalanne A.I., Payelle-Brogard B., Magnac C., Pritsch O., Dighiero G., Vuillier F. Different isoforms of BSAP regulate expression of AID in normal and chronic lymphocytic leukemia B cells // Blood. — 2005. — ЛЫ. 105, N 6. — P. 2495-2503.
11. Visan I.A. The CD23 receptor-regulation of expression and signal transduction: Dissertation zur Erlangung des natur wissen schaftlichen
Doktorgrades / Bayerische Julius-Maximilian Universitet Wurzburg vorgelegt von. — Wurzburg, 2003. — 116 p. www.opus-bayern.de/uni-wuerzburg/ volltexte/2003/555/pdf/The_CD23_receptor-_ regulation_of_expression_and_signal_trans.pdf
поступила в редакцию 14.12.2011 отправлена на доработку 06.01.2012 принята к печати 19.01.2012
352
