CC BY
54
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616.223-002-018.23:577.112.6:577.322
РОЛЬ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА В СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЯХ БРОНХИАЛЬНОЙ СТЕНКИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ВОСПАЛЕНИЯ В БРОНХАХ
Елена Андреевна ГЕРЕНГ, Ирина Владимировна СУХОДОЛО, Раиса Ивановна ПЛЕШКО, Людмила Михайловна ОГОРОДОВА, Иван Васильевич МИЛЬТО, Екатерина Борисовна БУКРЕЕВА, Ольга Сергеевна КОБЯКОВА, Полина Александровна СЕЛИВАНОВА, Иван Сергеевич КРЕМИС
ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
Целью исследования явилась оценка влияния трансформирующего фактора роста в1 на развитие структурных изменений в слизистой оболочке бронхов при тяжелой форме бронхиальной астмы и хронической обструк-тивной болезни легких. С помощью гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов исследования установлено, что у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой бронхиальной астмы фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» определяется повышение содержания трансформирующего фактора роста в1 в клетках бронхиального эпителия с субэпителиальным фиброзом, утолщение базальной мембраны, а при хронической обструктивной болезни легких наблюдается повышенная плотность макрофагов, экспрессирующих рецепторы к трансформирующему фактору роста Р1, что сочетается с выраженным периваскулярным фиброзом, плоскоклеточной метаплазией бронхиального эпителия.
Ключевые слова: трансформирующий фактор роста Р1, фиброз бронхиальной стенки, воспаление в органах дыхательной системы.
Трансформирующий фактор роста Р1 (TGF-Р1), продуцируемый эпителиоцитами слизистой оболочки бронхов (СОБ), клетками воспалительного инфильтрата обладает выраженным иммунорегуляторным, антипролиферативным и регенерирующим действием [1]. Предпосылкой для проведения настоящего исследования послужили противоречивые данные о роли этого ростового фактора в реализации воспаления и структурных изменениях бронхиальной стенки при тяжелой форме бронхиальной астмы (БА) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Цель исследования - оценить роль TGF-P1 в развитии структурных изменений в слизистой оболочке бронхов при тяжелой форме БА и ХОБЛ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Проведено одномоментное сравнительное исследование 10 пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормонозависимая) (9 женщин и 1 мужчина) в возрасте от 36 до 62 лет (средний
Геренг Е.А. - к.м.н., старший научный сотрудник ЦНИЛ, доцент кафедры морфологии, [email protected] Суходоло И.В. - д.м.н. проф., зав. кафедрой морфологии, e-mail: [email protected] Плешко Р.И. - д.м.н., проф. кафедры морфологии
Огородова Л.М. - д.м.н., проф., член-кор. РАМН, заслуженный деятель науки, зав. кафедрой факультетской
педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, e-mail: [email protected]
Мильто И.В. - к.б.н., доцент кафедры морфологии, e-mail: [email protected]
Букреева Е.Б. - д.м.н., проф. кафедры внутренних болезней педиатрического факультета,
Кобякова О.С. - д.м.н., зав. кафедрой общей и врачебной практики (семейной медицины), e-mail: [email protected]
Селиванова П.А. - к.м.н., ассистент кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины, e-mail: [email protected]
Кремис И.С. - врач пульмонологического отделения, e-mail: [email protected]
возраст 49,09 ± 1,52 года) и 15 пациентов с тяжелым течением ХОБЛ (13 мужчин и 2 женщины) в возрасте от 54 до 65 лет (средний возраст 54,8 ± 11,6 года). Обязательным условием участия в исследовании было наличие письменного информированного согласия больного, одобренное локальным комитетом по этике ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России г. Томска № 2833/1 от 31.11.2011 г. Диагностика болезней проведена согласно критериям глобальной стратегии лечения и профилактики БА и ХОБЛ (GINA, GOLD, 2006). Общий стаж болезни при БА составил 14,8 ± 1,0 года, при ХОБЛ - 18,6 ± 2,6 года.
Контрольной группой выступали лица без патологии органов дыхания (n = 10), сопоставимые по полу и возрасту с исследуемыми больными.
Биоптаты (2-3 фрагмента) забирали во время бронхоскопии из устья среднедолевого бронха правого легкого. Материал фиксировали в 10 % забуференном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин по стандартной методике [2, 4].
Гистологические препараты окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону [2].
При обзорной световой микроскопии оценивали воспалительные, дисрегенераторные (пролиферацию базальных клеток, наличие плоскоклеточной метаплазии и бокаловидно-клеточной гиперплазии), фиброзные процессы.
На цифровой фотокамере Canon Power Shot A 630 (Япония) проводили съемку гистологических препаратов (7-10 случайных полей зрения для каждого среза). Цифровые фотографии подвергали морфометрическому исследованию с использованием компьютерной программы ImageJ 1.43 (режим доступа http://wwwrsb.info. nih.gov/ij/). За единичный объем принимали 1 мм2 ткани бронхов. С помощью метода точечного счета Автандилова с использованием Plugins «Grid» в бронхобиоптатах подсчитывали объемные плотности (мм3/мм3) покровного эпителия и отдельных клеточных форм, удельный объем соединительной ткани, желез, микрососудов. Используя окуляр-микрометр, определяли высоту эпителиального пласта, а также ширину базальной мембраны (мкм).
При помощи Plugins «Cell» программы Im-ageJ в 1 мм2 собственной пластинки СОБ подсчитывали плотность воспалительного инфильтрата и различных клеточных популяций (макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов, полиморф-ноядерных лейкоцитов).
Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных антител и системы визуализации фирмы «Dako» (Дания) LSAB2 System - HRP. Срезы докрашивали гематоксилином, заключали в бальзам.
Экспрессию CD4+-CD8+ клеток воспалительного инфильтрата оценивали на 1 мм2 ткани собственной пластинки СОБ.
Экспрессию рецепторов к TGF-ß1 в эпите-лиоцитах бронхов оценивали по интенсивности окраски срезов с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И-3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-2. Фотометрирование проводили в 50 клетках реснитчатого эпителия слизистой оболочки бронхов при длине волны монохроматического света 548 нм (зеленый).
Данные представляли в виде медианы (Me), меру рассеяния в виде квартильного интервала (Q025-Q075). В связи с тем, что небольшой объем выборки не позволил отнести данное распределение к нормальному закону, статистический анализ осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Сравнение показателей в трех несвязанных группах проводили дисперсионным анализом Краске-ла-Уоллиса. Сопряженность между полученными данными определяли посредством оценки коэффициентов корреляции рангов Спирмена. Критическим уровнем значимости считали значение p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
У пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормонозависимая) в СОБ выявлено увеличение плотности воспалительного инфильтрата преимущественно за счет лимфоцитов, которые принадлежали к субпопуляции CD4+-кле-ток (T-хелперы) (табл. 1). Этот факт указывает на развитие аллергического воспаления в СОБ у пациентов с исследуемым фенотипом астмы, что подтверждается статистически значимой положительной ассоциацией между плотностью CD4+-клеток в бронхиальной стенке, с одной стороны, и концентрацией сывороточного IgE (r = 0,72; p = 0,004) и суточной лабильностью бронхов (r = 0,85; p = 0,025) - с другой. Отмеченное нами повышение плотности эозинофи-лов в СОБ, а также связь эозинофильного инфильтрата с ремоделированием бронхиальной стенки нашло отражение в обратных корреляциях между эозинофилией СОБ и стажем болезни (r = -0,95; p = 0,005), а также объемом форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) (r = -0,75;
Примечание. Здесь и в табл. 2 * - отличие от величины соответствующего показателя лиц контрольной группы статистически значимо при р < 0,05, # - отличие от величины соответствующего показателя пациентов с бронхиальной астмой фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» статистически значимо при р < 0,05.
Таблица 1
Морфометрические показатели состава клеточного инфильтрата и количества CD4+- и CD8+-клеток в слизистой оболочке бронхов у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» и ХОБЛ, Ме (Q025-Q0 75)
Исследуемый параметр Контрольная группа (п = 10) Пациенты с бронхиальной астмой (п = 10) Пациенты с ХОБЛ (п = 10)
Суммарная плотность инфильтрата 267,94 (106,93-478,98) 1636,63 (1486,66-1854,71)* 1164,03 (999,05-1593,82)*#
Макрофаги 83,44 (26,43-125,22) 256,24 (234,32-282,44)* 183,23 (123,62-225,62)*,#
Полиморфно-ядерные лейкоциты 18,24 (5,86-24,43) 498,31 (365,21-533,42)* 528,62 (485,34-688,42)*,#
Эозинофилы - 26,43 (18,25-32,42)* 13,82 (12,27-24,52)*,#
Лимфоциты 166,22 (74,64-329,33) 855,72 (665,32-1006,43)* 438,36 (377,82-655,24)*,#
CD4+-лимфоциты 66,39 (29,85-131,82) 525,63 (185,24-635,47)* 102,35 (98,43-285,42)*,#
CD8+-лимфоциты 55,33 (24,88-109,77) 285,43 (136,43-342,23)* 336,01 (279,36-369,82)*,#
р = 0,001). Среди эозинофильных гранулоцитов преобладали клетки с признаками дегрануля-ции, что свидетельствует о высвобождении ими катионных белков, обладающих выраженным цитотоксическим действием на эпителий бронхов [3, 4]. Возможно, этим можно объяснить снижение высоты эпителиального пласта у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормоно-зависимая). Доказательством обнаруженного нами факта может служить корреляция между данным морфометрическим параметром и плотностью эозинофильных гранулоцитов в собственной пластинке СОБ (г = -0,91; р = 0,009).
В последние годы эозинофилам отводится ключевая роль в генерации оксида азота, образующегося вследствие высокой функциональной активности индуцибельной NO-синтазы. В условиях окислительного стресса, наблюдаемого при воспалении в СОБ у пациентов с данной формой астмы, оксид азота метаболизируется преимущественно с образованием пероксинит-рита, который стимулирует наработку TGF-P1 в бронхиальной стенке [5].
Действительно, у пациентов с фенотипом «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» определяется статистически значимое (р = 0,002) повышение содержания данного ростового фактора в клетках бронхиального эпителия (0,526 (0,437-0,688) усл. ед.; 0,415 (0,305-
0,586) усл. ед. при тяжелой форме ХОБЛ, 0,223 (0,098-0,395) усл. ед. - в контроле). Интересно, что у исследуемой группы пациентов с тяжелой формой астмы высокие показатели экспрессии рецепторов к TGF-P1 в бронхиальном эпителии СОБ сочетаются с большей плотностью клеток фибробластического ряда и утолщением базаль-ной мембраны (табл. 2).
Вероятно, все эти изменения взаимосвязаны: усиление высвобождения TGF-P1 из клеток бронхиального эпителия приводит к увеличению толщины базальной мембраны за счет повышения продукции коллагена I, III, VIII типов и компонентов основного вещества (фибронек-тина, тенасцина), синтезируемых лаброцитами [4]. Утолщение базальной мембраны можно рассматривать, с одной стороны, как защитно-приспособительную реакцию, с другой - как морфологический маркер бронхиальной гиперреактивности, наблюдаемой у пациентов с тяжелой формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» (гормоно-зависимой).
У пациентов с тяжелой формой ХОБЛ по сравнению с лицами всех сравниваемых групп в СОБ определяется самая высокая плотность макрофагов, экспрессирующих рецепторы к TGF-P1 и локализованных преимущественно периваскулярно. Известно, что TGF-P1 активизирует функционирование фибробластов, стимулируя развитие периваскулярного фиброза
Таблица 2
Морфометрические показатели слизистой оболочки бронхов у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой БА фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией» и ХОБЛ, Ме (^025 - Q07j)
Исследуемый параметр Контрольная группа (п = 10) Пациенты с бронхиальной астмой (п = 10) Пациенты с ХОБЛ (п = 10)
Объемная плотность покровного эпителия, мм3/мм3 0,201 (0,132-0,344) 0,155 (0,044-0,241)* 0,274 (0,162-0,551)*,#
Объемная плотность реснитчатых эпителиоцитов, мм3/мм3 0,141 (0,102-0,203) 0,081 (0,022-0,101)* 0,156 (0,121-0,255)*,#
Объемная плотность бокаловидных эпителиоцитов, мм3/мм3 0,042 (0,031-0,092) 0,021 (0,012-0,061)* 0,023 (0,011-0,081)*
Объемная плотность базальных эпителиоцитов, мм3/мм3 0,028 (0,012-0,043) 0,053 (0,014-0,085)* 0,107 (0,031-0,223)*,#
Относительный объем желез, мм3/мм3 0,271 (0,141-0,622) 0,191 (0,134-0,324)* 0,132 (0,054-0,266)*,#
Относительный объем микрососудов, мм3/мм3 0,047 (0,032-0,075) 0,065 (0,022-0,091)* 0,032 (0,014-0,135)*,#
Относительный объем соединительной ткани, мм3/мм3 0,661 (0,364-0,845) 0,751 (0,632-0,851)* 0,836 (0,602-0,891)*,#
Высота эпителиального пласта, мкм 38,13 (21,82-73,54) 19,32 (17,81-28,91)* 83,92 (65,62-94,84)*,#
Ширина базальной мембраны, мкм - 16,72 (8,15-29,12)* 6,48 (2,09-9,35)*,#
в собственной пластинке СОБ и сужение просвета сосудов [6]. Это приводит к уменьшению объемной плотности сосудов микроциркулятор-ного русла, утяжеляет течение ХОБЛ и клинически проявляется в снижении индекса Тиффно (отношение ОФВ1 к форсированной жизненной емкости легких ФЖЕЛ), что подтверждается в обнаруженной нами отрицательной ассоциации между индексом Тиффно и плотностью макрофагов, экспрессирующих рецепторы к TGF-P1 (г = -0,75; р = 0,004).
Согласно данным Б. 1ва|еу8, иммунорегу-ляторное влияние TGF-P1 осуществляется активацией пула Т-лимфоцитов и возрастанием числа CD8+-клеток [7]. У пациентов с тяжелой формой ХОБЛ в бронхиальной стенке нами обнаружено повышение плотности CD8+-клеток, локализующихся суб- и интраэпителиально (см. табл. 1). У пациентов с тяжелой формой ХОБЛ цитотоксический эффект проявляется деструктивными процессами в бронхиальной стенке, что в дальнейшем может приводить к развитию плоскоклеточной метаплазии (см. табл. 2). Метаплазия реснитчатого эпителия в многослойный плоский, наблюдаемая нами более чем в 50 % случаев у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ, расценивается как пролиферативно-кле-точный вариант реорганизации бронхиального эпителия, связанный с истощением структурно-
метаболических резервов клетки и снижением их белок-синтетической функции [4, 7].
Помимо непосредственного цитотоксичес-кого действия на клетки бронхиального эпителия, CD8+-лимфоциты вырабатывают TNF-a, который усиливает высвобождение 1Ь-8 из макрофагов. Под влиянием данного интерлейкина происходит активация нейтрофильных лейкоцитов, плотность которых была повышена в СОБ у пациентов с тяжелой формой ХОБЛ (см. табл. 1). При тяжелой форме ХОБЛ нейтрофилы участвуют в развитии окислительного стресса, формируют дисбаланс в протеиназно-антипро-теиназной системе с последующей структурной перестройкой бронхиальной стенки [8].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, аллергический тип воспаления, развивающийся в слизистой оболочке бронхов у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной формой бронхиальной астмы фенотипа «астма с фиксированной бронхиальной обструкцией», приводит к повышению содержания трансформирующего фактора роста Р1 в клетках бронхиального эпителия с развитием субэпителиального фиброза, утолщения базаль-ной мембраны с более высокими показателями бронхиальной гиперреактивности. В бронхиальной стенке у пациентов с тяжелой формой
ХОБЛ наблюдается повышенная плотность макрофагов, экспрессирующих рецепторы к трансформирующему фактору роста рр что сочетается с выраженным периваскулярным фиброзом, плоскоклеточной метаплазией бронхиального эпителия с более низкими показателями индекса Тиффно (ОФВ1/ФЖЕЛ).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Boxall C., Holgate S.T., Davies D.E. et al. The contribution of transforming growth factor^ and epidermal growth factor signaling to airway remodeling in chronic asthma // Eur. Respir. J. 2006. 27. 208-229.
2. Автандилов Г.Г. Основы количественной патологической анатомии. М., 2002. 240 с.
3. Непомнящих Г.И. Биопсия бронхов: морфогенез общепатологических процессов в легких. М., 2005. 405 с.
4. Jeffery P.K. Remodeling and inflammation of bronchi in asthma and chronic obstructive pulmonary disease // Proc. Am. Thorac. Soc. 2004. 1. 176-183.
5. Козина О.В., Огородова Л.М., Андрушке-вич В.В. и др. Метаболиты оксида азота и их значение в патогенезе бронхиальной астмы // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. (6). 34-37.
6. Wilson J.W., Hii S. The importance of the airway microvasculature in asthma // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2006. 6. 51-55.
7. Isajevs S., Taivans I., Strazda G. et al. Decreased FOXP3 expression in small airways of smokers with COPD // Eur. Respir. J. 2009. 33. 61-67.
8. Gernez Y., Tirouvanziam R., Chanez P. et al. Neutrophils in chronic inflammatory airway diseases: can we target them and how? // Eur. Respir. J. 2010. 35. 467-469.
ROLE OF THE TRANSFORMING GROWTH FACTOR^ IN STRUCTURAL CHANGES OF A BRONCHIAL WALL AT DIFFERENT VARIANTS OF INFLAMMATION IN BRONCHIA
Elena Andreevna GERENG, Irina Vladimirovna SUKHODOLO, Raisa Ivanovna PLESHKO, Lyudmila Mikhajlovna OGORODOVA, Ivan Vasilevich MILTO, Ekaterina Borisovna BUKREEVA, Olga Sergeevna KOBYAKOVA, Polina Aleksandrovna SELIVANOVA, Ivan Sergeevich KREMIS
Siberian State Medical University, 634050, Tomsk, Moskovsky tract, 2
The research aim was the evaluation of transforming factor of growth Pj influence on development of structural changes in mucous membrane of bronchial tubes at severe form of bronchial asthma and chronic obstructive lung disease. It has been determined by means of histological, immunohistological and morphometric methods, that the increase of level of the transforming factor of growth Pj in cells of bronchial epithelium with subepithelial fibrosis and thickening of basilar membranes were revealed at patients with severe therapeutecally resistant form of bronchial asthma of the phenotype «the asthma with the fixed bronchial obstruction», while the raised density of macrophages exposing receptors to the transforming growth factor Pj was found at patients with chronic obstructive lung disease, that is combined with expressed perivasculars fibrosis, squamous metaplasia of bronchial epithelium.
Keywords: transforming growth factor Pj, bronchial wall fibrosis, inflammation of the respiratory system.
Gereng E- candidate of medical sciences, senior researcher, assistant professor of the chair for morphology, e-mail: e-gereng@mail ru
Sukhodolo I.V. - doctor of medical sciences, professor, head of the chair for morphology, e-mail: [email protected]
Pleshko R.I. - doctor of medical sciences, professor of the chair for morphology, e-mail: [email protected] Ogorodova L.M. - doctor of medical sciences, professor, corresponding member of RAMS, honored worker of science, head of the chair of faculty pediatrics with the course f children diseases, e-mail: [email protected] Milto I.V. - candidate of biological sciences, assistant professor of the chair for morphology, e-mail: [email protected]
Bukreeva E.B. - doctor of medical sciences, professor of the chair for internal diseases of pediatric faculty, e-mail: [email protected]
Kobyakova O.S. - doctor of medical sciences, head of the chair for general and medical practice (family medicine), e-mail: [email protected]
Selivanovа P.A. - candidate of medical sciences, assistant of the chair for hospital therapy with the course of physical rehabilitation and sports medicine, e-mail: [email protected] Kremis I.S. - doctor of pulmonological department, e-mail: [email protected]
