CC BY
489
3 ПЕ°в1 III
Роль тандемной масс-спектрометрии в диагностике наследственных болезней обмена веществ
Г.В. Байдакова1, Т.А. Иванова1, Е.Ю. Захарова1, О.С. Кокорина2
ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115522, Москва, ул. Москворечье, 1; Медицинская компания 1^1ТКО; Россия, 125047, Москва, ул. 4-я Тверская-Ямская, 16, корп. 3
Контактные данные: Галина Викторовна Байдакова labnbo@yandex.ru
В статье рассматривается применение тандемной масс-спектрометрии в диагностике и скрининге наследственных болезней обмена веществ. Широкий спектр заболеваний, специфичность, простота пробоподготовки и высокая пропускная способность, обеспечиваемая технологией тандемой масс-спетрометрии (МС/МС), привели к разработке во многих странах программ расширенного скрининга новорожденных на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты окисления жирных кислот (ОЖК). Применение МС/МС в селективном скрининге позволило существенно улучшить диагностику некоторых классов заболеваний, таких как дефекты ОЖК. Новые специфические и быстрые методы МС/МС и высоко эффективной жидкостной хроматогра-фии—МС/МС дополняют или заменяют некоторые из классических методов газовой хроматографии с масс-спектрометриче-ской детекцией для множества метаболитов и заболеваний. В ближайшее время следует ожидать появления новых перспективных методов для диагностики не только отдельных нозологических форм, но и целых групп наследственных болезней обмена веществ.
Ключевые слова: наследственные болезни обмена веществ, тандемная масс-спектрометрия, скрининг новорожденных, лизосо-мные болезни накопления
DOI: 10.17650/2311-1267-2018-5-3-96-105
The role of tandem mass spectrometry in the diagnosis of inherited metabolic diseases
G.V. Baydakova1, T.A. Ivanova1, E.Yu. Zakharova1, O.S. Kokorina2
1Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow, 115522, Russia; Medical company INVITRO; Bldg. 3, 16 4th Tverskaya-Yamskaya St., Moscow, 125047, Russia
This paper reviews the clinical applications of tandem mass spectrometry in diagnosis and screening for inherited metabolic diseases. The broad-spectrum of diseases covered, specificity, ease of sample preparation, and high throughput provided by the MS/MS technology has led to the development of multi-disorder newborn screening programs in many countries for amino acid disorders, organic acidurias, and fatty acid oxidation defects. The application of MS/MS in selective screening has revolutionized the field and made a major impact on the detection of certain disease classes such as the fatty acid oxidation defects. New specific and rapid tandem mass spectrometry (MS/MS) and high performance liquid chromatography—MS/MS methods are supplementing or replacing some of the classical gas chromatography— MS/MS methods for a multitude of metabolites and disorders. In the near future, we should expect the emergence of new promising methods for diagnosing not only individual nosologic forms, but also entire groups of inherited metabolic diseases.
Key words: inherited metabolic diseases, tandem mass spectrometry, newborn screening, lysosomal storage disorders
Наследственные болезни обмена веществ (НБО) — НБО (более 100 нозологических единиц). Эти группы класс наследственных моногенных нарушений, вызван- НБО в ряде исследованных популяций имеют довольных мутациями в генах, кодирующих ферменты или но высокую суммарную частоту 1:2000—1:3000 живых другие белки, участвующие в определенном метаболиче- новорожденных [1, 2]. Большинство этих заболеваний ском пути. Отличительной чертой этого класса болезней манифестируют в раннем детском возрасте, характе-s является наличие высокоспецифичных биохимических ризуются острым началом, часто сопровождаются по-£ маркеров заболеваний, на выявлении которых базиру- ражением нервной системы. При этом около 20 форм я ется их лабораторная диагностика. Особое внимание болезней из этой группы поддаются лечению (дието-s к этому классу заболеваний связано с тем, что для терапия, витамины, кофакторы, ферменты), эффек-3 многих форм НБО уже созданы подходы к лечению. тивность которого во многом зависит от сроков уста-2 Наследственные нарушения метаболизма ами- новления диагноза.
^ нокислот, органических кислот и дефекты митохон- Группа лизосомных болезней накопления (ЛБН),
в дриального р-окисления — самые обширные группы включающая более 50 различных нозологических
Е
га
и
09
. Журнал
нодго
3
2018
форм, также имеет довольно высокую суммарную частоту — 1:5000—1:8000 живых новорожденных, при том, что частота отдельных нозологических форм крайне низка - 1:40 000-1:100 000 [3]. Методы ферментной заместительной терапии для лечения ЛБН начали применяться уже более 25 лет назад, и на сегодняшний день для 10 форм ЛБН разработаны препараты, которые позволяют скорректировать основные осложнения заболеваний и улучшить качество и продолжительность жизни больных.
Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия (МС) — аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию анализируемых молекул после их преобразования в ионы. Существенное отличие МС от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяется непосредственно масса молекул и их фрагментов. Результаты представляются графически (так называемый масс-спектр). В тандемном масс-спектрометре (МС/МС) масс-анализаторы выстраивают последовательно друг за другом (рис. 1). Из ионов, разделенных в первом масс-анализаторе, отбирают неидентифицированные по своему строению частицы (родительские ионы) и разбивают их на более мелкие фрагменты столкновением с атомами инертного газа (диссоциация, индуцированная соударением (ДИС)). Этот процесс реализуется перед вторым масс-анализатором, при помощи которого анализируют продукты распада (дочерние ионы). Иногда невозможно анализировать многокомпонентные, сложные смеси молекул без их предварительного разделения, в таком случае применяют хроматографическое разделение (жидкостная или газовая хроматография).
При МС/МС-анализе ионный сигнал пропорционален концентрации анализируемого соединения, линеен в пределах выявления (обычно пмоль/л) и практически не зависит от течения потока и объема вводимого образца. Для количественного измерения вводится внутренний стандарт. Внутренние стандарты имеют сходную анализируемому веществу структуру, чаще всего в качестве внутренних стандартов применяют стабильные изотопы.
Применение компьютерных алгоритмов позволяет проводить несколько типов МС/МС-сканирования в одном анализе, наиболее часто используются следующие методы:
♦ сканирование родительских ионов. Масс-анали-затор 1 сканирует все возможные родительские ионы, в то время как масс-анализатор 3 статически зафиксирован на одном уникальном дочернем ионе, полученном после ДИС. Например, основной фрагментированный ион для всех ацилкарнитинов составляет 85 а.е.м.;
♦ сканирование нейтральных потерь. И масс-ана-лизатор 1, и масс-анализатор 2 сканируют при постоянной разнице в m/z. Этот метод используется для мониторинга потерь нейтральных фрагментов после ДИС. Например, для большинства бутилированных аминокислот нейтральные потери составляют 102 а.е.м.;
♦ мониторинг множественных реакций (Multiple Reaction Monitoring, MRM). Масс-анализатор 1 и масс-анализатор 2 статичны для заранее определенной пары родительского и дочернего ионов, это дает наибольшую чувствительность и специфичность и главным образом используется при количественных измерениях.
МС/МС-анализ наиболее эффективен для соединений, имеющих сходные дочерние ионы или нейтральные молекулы, например для анализа аминокислот и ацилкарнитинов. Необходимо также подчеркнуть возможность МС/МС-анализа различных химических групп в одном анализе за очень короткое время (и 2 мин). Это обеспечивает широкий спектр анализов и высокую пропускную способность, что экономически выгодно для скрининга на большое число заболеваний.
Лабораторная диагностика аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов окисления жирных кислот
В диагностике этих групп болезней ключевую роль играет анализ аминокислот, общего и свободного карнитина, а также ацилкарнитинов в различных биологических жидкостях. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и пропускной способности МС/МС играет основную роль как в текущей диагностике этих групп заболеваний, так и в массовом скрининге новорожденных. МС/МС позволяет за короткий промежуток времени (менее 2 мин) определять в одном высушенном пятне крови (и 3 мкл) более 50 маркеров (аминокислоты и ацилкарнитины)
Е га
и
09
Рис. 1. Типичная блок-схема тандемного масс-спектрометра Fig. 1. A typical flow-chart of a tandem mass-spectrometer
Р
. Журнал
нодго
Е
га
и
09
множества заболеваний [4, 5]. Определяя уникальные для каждого соединения соотношения массы к заряду и сравнивая интенсивность аналитов с внутренними стандартами, данная технология дает точную количественную и качественную оценку соединений [6, 7] с очень низким процентом ложноположитель-ных результатов (0,2—0,3 %). Применение МС/МС в программах обследования новорожденных позволяет проводить неонатальный скрининг более чем 40 форм НБО [8, 9]. Чувствительность и специфичность МС/МС варьирует для разных заболеваний. В частности, сложности возникают при диагностике некоторых нарушений обмена аминокислот (недостаточности орнитинтранскарбомилазы, го-моцистинурии) и органических ацидурий (недостаточности биотинидазы, метилмалоновой ацидурии), поскольку при этих болезнях не у всех пациентов в неонатальном периоде выявляются значимые изменения концентрации маркерных метаболитов или маркер не является высокоспецифичным и требуются тесты 2-й линии для повышения специфичности скрининга [10, 11].
Аминоацидопатии относятся к наиболее частым НБО [12—14]. При наследственном заболевании, как правило, уровень специфического маркера повышается в десятки или сотни раз (таблица; рис. 2).
При этом необходимо отметить, что изменение концентрации аминокислот не всегда является высокоспецифичным и может наблюдаться у недоношенных детей, при хронических заболеваниях печени, воспалительных процессах. Например, при тирозине-мии 1-го типа у новорожденных основным маркером является повышение концентрации сукцинилацетона в крови и моче. Повышение тирозина может наблюдаться не только при тирозинемии, но и при других заболеваниях, связанных с поражением печени.
Термин «органическая ацидемия», или «органическая ацидурия» применяется к группе заболеваний, характеризующихся экскрецией органических кислот с мочой (см. таблицу) [15—18]. Новорожденные с органической ацидурией обычно не имеют клинических симптомов при рождении. Первые признаки болезни проявляются на первых неделях — месяцах жизни: нарушение вскармливания (частые срыгивания, рвота, сниженный аппетит), поражение нервной системы (нарушение сознания вплоть до комы, судороги, нарушение мышечного тонуса). Поэтому особенно важно поставить диагноз в первые дни жизни. Для данной группы заболеваний характерно изменение концентрации ацилкарнитинов при МС/МС (рис. 3).
Например, повышение уровня пропионилкарни-тина наблюдается при пропионовой и метилмалоновой ацидурии. Дифференциальная диагностика данных заболеваний включает количественное определение уровня органических кислот в моче [19].
а
Gly Ala If Ser 1 Leu+lle Iii III u ш* Ту Ifrtu i :/* Glu Г
]» ]60 ITCh L80 190 200 210 220 2J0 240 2» 2»
б
Ala
Pin
I .ein-Ik
ft Scr jVat ft jfr
Tyr 6 _i. I .
Glu
IM 144 190 160 TO ; V 100 200 210 220 270 240 2S0 260
Pro
.Väl
PlKä
Туг *
L i
Glu
Рис. 2. Схематичный МС/МС-спектр бутиловых эфиров аминокислот образцов крови при сканировании нейтральных потерь (102 а.е.м.): а — контроль; б — фенилкетонурия; в — лейциноз. Звездочками отмечены внутренние стандарты
Fig. 2. Schematic MS/MS spectra of the butyl ether of amino acids of blood samples on scanning of neutral loss (102 a.m.u): а — control; б — phenylketonuria; в — leucinosis. The internal standards are marked with asterisks
Ъ ft
_LI_■ L
t ciil
а
CIS: I
i
I» 440
* ?
C5-DC
б
CI8:1
w 1»
4» 140
в
Clftl eis /
% * * _u_I_L
1 «40 440 ЧО
c.i ■■' г
■ I
CIS
CIS]
IM Л0 1»
Ш i»
*M 140
130 УЮ
Рис. 3. Схематичный МС/МС-спектр бутиловых эфиров ацилкарнитинов образцов крови при сканировании родительских ионов (85 а.е.м.): а — метилмалоновая ацидемия; б — глутаровая ацидемия 1-го типа; в — изовалериановая ацидемия; г — недостаточность био-тинидазы. Звездочками отмечены внутренние стандарты Fig. 3. Schematic MS/MS spectrum of butyl ether of acylcarnitine of blood samples on scanning of parental ions (85 a.m.u): а — methylmalonic academia; б — glutaric acidemia type I; в — isovaleric academia; г — biotinidase deficiency. The internal standards are marked with asterisks
Митохондриальное в-окисление жирных кислот (ОЖК) — физиологический ответ на голодание, инфекционный процесс и повышенную мышечную активность. ОЖК — это процесс, при котором происходит последовательное отщепление одной молекулы ацетилкофермента А (ацетил-КоА) от активированных жирных кислот под действием ферментов с различной специфичностью к длине цепи. В печени образовавшиеся в результате в-окисления ацетил-КоА в период голодания направляются в цепь кетогенеза, в результате которого образуются кетоновые тела. Для каждой из стадий процесса ОЖК известны на-
Дифференциально-диагностические подходы подтверждающей диагностики, необходимые при выявлении отклонений при проведении МС/МС-анализа на аминокислоты и ацилкарнитины (начало)
№ Заболевание Сокращенное название Диагностика Подтверждающая диагностика
Кровь Моча Ген
Основной метаболит, мкмоль/л Дополнительные метаболиты (мкмоль/л) и соотношения
Аминоацидопатии
1 Фенилкетонурия ФКУ, PKU Phet Phe/Tyrt Газовая хроматография с масс-спектроме-трической детекцией (ГХМС): 4-гидрокси-фениллактат^ 4-гидроксифенилпирува^ PAH*
2 Тирозинемия 1-го типа TYR1 SAt Tyr t МС/МС: SAt FAH*
3 Болезнь с запахом кленового сиропа мочи Лейциноз, MSUD Leu/Ilet Valt, Leu/Phet, Leu/Alat ГХМС: 2-гидроксиизовалериановая^ 2-гидроксиизокапрановаяt, 2-гидрокси-3-метилвалериановаяt кислоты BCKDHA* BCKDHB*
4 Некетотическая гиперглицинемия NKH Glyt Повышение соотношения уровня глицина в цереброспинальной жидкости к плазме крови GLDC* GCST* GCSH
5 Гомоцистинурия/не-достаточность циста-тионин-р-синтетазы HCY Mett Met/Phet Качественный тест на наличие гомоцистина, гомоцистеина с нитропруссидом натрия* CBS*
6 Гомоцистинурия/ недостаточность метилентетрагидрофо-латредуктазы HCY Met^ Met/Phe^ Качественный тест на наличие гомоцистина, гомоцистеина с нитропруссидом натрия* MTHFR*
Заболевания, связанные с нарушением цикла мочевины (Кребса—Гензелейта)
7 Недостаточность кар-бамилфосфат-синтазы CPS I Cit^ Не наблюдается патологической экскреции органических кислот с мочой CPS1*
8 Недостаточность орнитин транскарбамилазы ОТС Cit^ ГХМС: оротовая кислота^ ураци^ OTC*
9 Аргининянтарная ацидурия/недостаточ-ность аргининосукци-нат лиазы АСА Citt, Argt ГХМС: оротовая кислотаt аргининоянтарная кислотаt ASL*
10 Недостаточность N-ацетилглютамат-синтазы NAGS Ci4 (не во всех случаях) Alat Не наблюдается патологической экскреции органических кислот с мочой NAGS*
11 Недостаточность аргиназы ARG Argt ГХМС: оротовая кислотаt ARG1* ARG2
12 Цитруллинемия 1-го типа CTLN1 Citt Cit/Argt ГХМС: оротовая кислота^ ураци^ ASS*
Органическая ацидурия
13 Изовалериановая ацидемия/недостаточ-ность изовалерил-КоА-дегидрогеназы IVA C5t С0^, C5/C2t, C5/C0t, С5/ C3t ГХМС: 3-гидроксиизовалериановая кислотаt и изовалерилглидинt IVD*
14 Пропионовая ациде-мия/недостаточность пропионил-КоА-карбоксилазы РА C3t С0^, C3/C2t, C3/C0t ГХМС: 3-гидроксипропионовая кислотаt, метилцитрат^ пропионилглицинt PCCA* PCCB*
15 Метилмалоновая ацидемия ММА C3t C4DCt, С3/ C2t, С0^, C3/C0t Качественный тест на присутствие метил-малоновой кислоты*. ГХ МС: метилмалоно-ваяt, 3-гидроксипропионоваяt кислоты MUT* MMAA* MMAB* MMACHC* MMADHC*
Е
га
и 09
Е
sc га
Р
. Журнал
нодго
Дифференциально-диагностические подходы подтверждающей диагностики, необходимые при выявлении отклонений при проведении МС/МС-анализа на аминокислоты и ацилкарнитины (окончание)
№ Заболевание Сокращенное название Диагностика Подтверждающая диагностика
Кровь Моча Ген
Основной метаболит, мкмоль/л Дополнительные метаболиты (мкмоль/л) и соотношения
ГХМС: 3-гидроксиизовалериановая кис-16 Недостаточность BTD С5ОНТ лотаТ, 3-гидрокси-пропионовая кислотаТ, BTD* биотинидазы С5ОН 1 тиглилглицинТ метилцитратТ, молочная (лактат) кислотаТ, 3-метилкротонилглицинТ
Глутаровая ацидемия 1-го типа/недостаточ- „.,„ 17 ность глутарил- GA1 C5DCT C5DC/C16T „ ЛХМС: глутар°вая1, GCDH* КоА-дегидрогеназы 3-ОН-глУтаРоваяТ ¡шслоты 1-го типа
Нарушения митохондриального ОЖК
Недостаточность 18 короткоцепочечной SCAD ацил-КоА-дегидроге-назы жирных кислот С4Т ГХМС: этилмалоновая кислотаТ ACADS*
Недостаточность 19 среднецепочечной MCAD 19 ацил-КоА-дегидроге- MCAD назы жирных кислот С8Т, С6Т, С10:1Т С10Т, С8/С10Т ГХМС: дикарбоновая ацидемия (адипиновая, субериновая, себациновая, додекан-диоевая кислоты) ACADM*
Недостаточность длинноцепочечной 20 3-гидроксиацил- LCHAD КоА-дегидрогеназы жирных кислот С16ОНТ, С18ОНТ, С18:1ОНТ С16:1ОНТ, С16ОН/С16Т, (С18ОН+ С18:1ОН+ С16ОН)/С0Т ГХМС: неспецифичный патологический профиль дикарбоновых и гидроксидикарбоновых кислот С6—С14 HADHA*
Недостаточность очень длинноцепочеч-21 ной ацил- VLCAD КоА-дегидрогеназы жирных кислот С14:1Т С16:1Т, С14Т, С18:1Т, С14:1/ С12:1Т, С14:1/ С16Т ГХМС: неспецифичный патологический профиль дикарбоновых и гидроксидикарбоновых кислот С6—С14 ACADVL*
Дефицит митохондри-22 ального трифункцио- TFP нального белка С16ОНТ С14-С18Т Не наблюдается патологической экскреции органических кислот с мочой HADHA* HADHB*
Множественный дефицит ацил-23 КоА-дегидрогеназы GA2 (глутаровая ацидурия 2-го типа) С4Т, С5Т, С6Т, С8Т, С10Т, С12Т, С14Т, С16Т, С18Т Все соотношения, применяемые к основным маркерам ГХМС: этилмалоноваяТ, глутароваяТ, субериноваяТ кислоты, изовалерилглицинТ ETFA* ETFB* ETFDH*
Системный 24 первичный дефицит SPCD карнитина C0¿, тотальное снижение ацилкарни-тинов (С0+С2+С3+ С16+ С18:1)/ CitT Не наблюдается патологической экскреции органических кислот с мочой SLC22A5*
Недостаточность 25 карнитин- CPT1 пальмитоилтрансфе-разы 1-го типа С0Т, C16¿, C18:1¿, C18¿ C0/(C16+C18)T ГХМС: неспецифическая дикарбоксильная ацидурия CPT1A* CPT1B* CPT1C
Недостаточность 2g карнитин- CPT2 пальмитоилтрансфе-разы 2-го типа C0¿, С16Т, С18:1Т, С18Т C0/(C16+C18)¿ ГХМС: неспецифическая дикарбоксильная ацидурия CPT2*
Недостаточность 27 карнитин/ацилкарни- CACT тин-транслоказы C0¿, С16Т, С18:1Т, С18Т C0/(C16+C18)¿ ГХМС: неспецифическая дикарбоксильная ацидурия SLC25A20*
Е
га
и
09
Примечание. * — анализ проводится в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (Москва). 100
I РкурнаЛ™ ДЕТСКОЙ
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ
з
2018
Differential diagnostic approaches of confirmatory diagnostics, necessary for detecting abnormalities when performing MS/MS analysis for amino acids and acylcarnitines (beginning)
№ Disease Abbreviation Diagnosis Confirmation diagnosis
Blood Urine Gene
Major metabolit, umol/l Additional metabolites (umol/l) and equilibration
Aminoacidopathy
l Phenylketonuria PKU Phet Phe/Tyrt GCMS: 4- hydroxyphenyl lactate t, 4-hydroxyphenyl pyruvic t PAH*
2 Tyrosinemia, type I TYRl SAt Tyr t MS/MS: SAt FAH*
3 Maple syrup urine disease Leucinosis Leu/Ilet Valt, Leu/Phet, Leu/Alat GCMS: 2-hydroxyisovalerict, 2-hydroxyisocapranict, 2-hydroxy-3-methylvalerict acids BCKDHA* BCKDHB*
4 Nonketotic hyperglycinemia NKH Glyt Increase in the ratio of glycine in the CSF to blood plasma GLDC* GCST* GCSH
5 Homocystinuria/ cystathionine p-synthase deficiency HCY Mett Met/Phet A qualitative test for the presence of homocystine, homocysteine with sodium nitroprusside* CBS*
б Homocystinuria/ methylenete trahydrofolate reductase deficiency HCY Met¿ Met/Phe^ A qualitative test for the presence of homocystine, homocysteine with sodium nitroprusside* MTHFR*
Diseases associated with disruption of the urea cycle (Krebs—Henseleit)
7 Carbamyl phosphate synthetase I deficiency CPS I Cit¿ There is no pathological egestion of organic acids with urine CPS1*
8 Ornithine transcarbamylase deficiency OTC Cit¿ GCMS: orotic acidt, uracilt OTC*
9 Argininosuccinic aciduria/ argininosuccinate lyase deficiency ACA Citt, Argt GCMS: orotic acidt argininosuccinic acidt ASL*
lO N-acetylglutamate synthetase deficiency NAGS Cit4- (not in all cases) Alat There is no pathological egestion of organic acids with urine NAGS*
ll Arginase deficiency ARG Argt GCMS: orotic acidt ARG1* ARG2
l2 Citrullinemia type I CTLN1 Citt Cit/Argt GCMS: orotic acidt, uracilt ASS*
Organic aciduria
l3 Isovaleric acidemia/ isovaleric acid CoA dehydrogenase deficiency IVA C5t C0¿, C5/C2t, C5/C0t, С5/ C3t GCMS: 3-hydroxyisovaleric acidt and isovaleryl glycinet IVD*
l4 Propionic acidemia/ propionyl-CoA carboxylase deficiency РА C3t C0¿, C3/C2t, C3/C0t GCMS: 3-hydroxypropionic acidt, methyl citratet, propionylglycinet PCCA* PCCB*
l5 Methylmalonic acidemia ММА C3t C4DCt, С3/ C2t, C0¿ C3/C0t Qualitative test for the presence of methylmalonic acid*. GCMS: methylmalonict, 3-hydroxypropionic acidt MUT* MMAA* MMAB* MMACHC* MMADHC*
E
ra
u
09
I РжЖурнал1™ ДЕТСКОЙ
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ
з
2018
Differential diagnostic approaches of confirmatory diagnostics, necessary for detecting abnormalities when performing MS/MS analysis for amino acids and acylcarnitines (end)
№ Disease Abbreviation Diagnosis Confirmation diagnosis
Blood Urine Gene
Major metabolit, umol/l Additional metabolites (umol/l) and equilibration
GCMS: hydroxyisovaleric acidt, 16 Biotinidase deficiency BTD C50Ht 3-hydroxypropionic acMt, ti^yMyd^ Bm* methyl citrate 1, lactic acid 1, 3-methylcrotonylglycinet
Glutar acidemia 17 CoApdehytUtajenase GA1 C5DCt C5DC/C16t GCMS: glutarict, 3-OH-glutarict acids GCDH* deficiency
Disorders of mitochondrial oxidation of fatty acid
Short chain acyl-18 CoA dehydrogenase SCAD deficiency of fatty acids C4I GCMS: ethylmalonic acidt ACADS*
Medium chain acyl-19 CoA-dehydrogenase MCAD deficiency of fatty acids C8I, C6I, ClG:lI C10t, C8/C10t GCMS: dicarboxylic acidemia (adipic, suberinic, sebacic, dodecanedioic acids) ACADM*
Long-chain 3-hydroxyacyl-20 CoA-dehydrogenase LCHAD (LCHAD) deficiency of fatty acids С16ОН*, С18ОН1, С18:1ОН* C16:10Ht, C160H/C16t, (C180H+ C18:10H+ C160H)/C0t GCMS: nonspecific pathological profile of dicarboxylic and hydroxydicarboxylic acids C6-C14 HADHA*
Very long-chain acyl-21 CoA-dehydrogenase VLCAD deficiency of fatty acids Cl4:lI C16:lt, C14t, C18:lt, C14:1/ C12:lt, C14:1/ C16t There is no pathological egestion of organic acids with urine ACADVL*
Mitochondrial 22 trifunctional protein TFP deficiency С16ОН* C14-C18t All ratios applied to the major markers HADHA* HADHB*
Multiple acyl-CoA-23 dehydrogenase deficiency GA2 (glutar aciduria II) C4I, C5I, C6I, C8I, ClGl, C12I, C14I, C16I, C18I All ratios applied to the major markers GCMS: ethylmalonict, glutarict, suberinet acids, isovaleryl glycinet ETFA* ETFB* ETFDH*
24 Systemic primary SPCD carnitine deficiency CG¿, total reduction of acylcarnitines (C0+C2+C3+ C16+ C18:1)/ Citt There is no pathological egestion of organic acids with urine SLC22A5*
Carnitine 25 palmitoyltransferase I CPT1 deficiency CGI, C16¿, C18:1¿, C18¿ C0/(C16+C18)t GCMS: nonspecific dicarboxylic aciduria CPT1A* CPT1B* CPT1C
Carnitine 26 palmitoyltransferase II CPT2 deficiency CG¿, C16I, Cl8:lI, C18I C0/(C16+C18)^ GCMS: nonspecific dicarboxylic aciduria CPT2*
2y Carnitine-acylcarnitine CACT translocase deficiency CG¿, C16I, Cl8:lI, C18I C0/(C16+C18)^ GCMS: nonspecific dicarboxylic aciduria SLC25A20*
E
ra
u
09
Note. * — analysis is carried out in Research Centre for Medical Genetics (Moscow).
1G2
нодго
следственные нарушения [20—22]. По результатам МС/МС наблюдается повышение уровня специфических ацилкарнитинов (см. таблицу; рис. 4).
Однако следует помнить, что концентрации ацилкарнитинов могут повышаться при приеме некоторых лекарственных препаратов и искусственных молочных смесей [23].
При некоторых НБО концентрации специфических метаболитов могут повышаться незначительно и/или только в моменты метаболического криза, поэтому для повышения эффективности МС/МС применяется не только определение концентраций метаболитов, но и диагностически значимые соотношения. Так, например, при недостаточности митохондриального трифункционального белка на фоне снижения свободного карнитина концентрации 3-гидрокси-палмитоилкарнитина (C16OH), 3-гидрокси-стеарилкарнитина (C18OH) и 3-гидрокси-олеилкарнитина (C18:1OH) могут быть в норме, в то время как соотношения (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/ С0 и С16ОН/С16 всегда будут повышены. Для диагностики фенилкетонурии важным является определение соотношения фенилаланин/тирозин, что позволяет уменьшить число ложноположительных результатов [24].
Практически все заболевания, выявляемые методом МС/МС, требуют проведения довольно разнообразных дополнительных тестов подтверждающей диагностики. Для диагностики органических аци-дурий и аминоацидопатий прежде всего это газовая хроматография, масс-спектрометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография [25, 26]. Для подтверждения нарушений митохондриального ß-окис-ления требуется проведение ДНК-диагностики.
Лизосомные болезни накопления
ЛБН — обширный класс НБО, обусловленных мутациями структурных генов, контролирующих процесс внутрилизосомного гидролиза таких макромолекул клетки, как гликозаминогликаны, липиды, гликопро-теины. Главным биохимическим признаком этих болезней является накопление субстратов в клетке вследствие снижения активности определенных ферментов лизосом. В последние годы МС/МС все чаще применяют для определения накапливаемых субстратов и активности ферментов для этой группы заболеваний.
С помощью МС/МС можно количественно определять гликозаминогликаны — характерные метаболиты, накапливаемые при мукополисахаридозах [27]. Для болезни Помпе (гликогеноз 2-го типа) биомаркером является специфический тетрасахарид глюкозы в моче ([Glc4 (Glca1—6Glca1—4Glca1—4Glc)]). Несмотря на высокую чувствительность этого биомаркера, он не является высокоспецифичным, поскольку его концентрация повышается и при других гликогенозах [28].
it а CIS:I
•tr lei*
CJ л ft 4 1? 1 ft i. л I Г,
%
а" ■ i
б
CI« cifcl CIS
t. Ц и
CM CI 4:1J 1/ CLCI CIS * V
C3 ft ft ft ft , 1 , ■ CI 2 --— it , 1 i
гк> >■» да но
^ л ■ 1.. .1
CI2
-Х-
xt
г
С18:1 скоь
I CIS I С160Я ;сшон
JXjc
i¥> Mi )№
Рис. 4. Схематичный МС/МС-спектр бутиловых эфиров ацилкарнитинов образцов крови при сканировании родительских ионов (85 а.е.м.): а — контроль; б — недостаточность среднецепочечной ацил-КоА-деги-дрогеназы жирных кислот; в — недостаточность очень длинноцепочеч-ной ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот; г — недостаточность длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот. Звездочками отмечены внутренние стандарты Fig. 4. Schematic MS/MS spectrum of butyl ether of acylcarnitine of blood samples on scanning of parental ions (85 a.m.u): а — control; б — medium-chain acyl-CoA-dehydrogenase deficiency of aliphatic acid; в — very long-chain acyl-CoA-dehydrogenase deficiency of aliphatic acid; г — long-chain 3-hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase deficiency of aliphatic acid. The internal standards are marked with asterisks
Показано, что в тканях пациентов со многими сфинголипидозами наблюдается накопление лизос-финголипидов (производных сфинголипидов, содержащих свободную аминогруппу), играющих различную патофизиологическую роль. В последние годы, благодаря развитию МС/МС, стало возможным их определение в различных биологических жидкостях и практически для каждого заболевания из группы сфинголипидозов описан уникальный лизосфинго-липид в качестве биомаркера для диагностики и контроля лечения. Так, при болезни Фабри повышается лизоглоботриаозилсфингозин (lysoGb3), при болезни Гоше —гликозилсфингозин (GlcSph или lysoGLl), при болезни Краббе — галактозилсфингозин (психозин или GalSph), лизосфингомиелин (LysoSM) — при болезни Ниманна—Пика тип А/В и LysoSM-509 — при болезни Ниманна—Пика тип С. Определение этих биомаркеров возможно и в пятнах высушенной крови, что повышает эффективность и качество диагностики и позволяет проводить мониторинг лечения этих ЛБН [29-31].
С 2000-х годов появилась еще одна область применения метода МС/МС — определение активности ферментов в пятнах высушенной крови путем измерения концентрации продуктов реакции после инкубации образца со специфическим для ферментов субстра-
Е га
и
09
в
P
. Журнал
нодго
том [3]. Это дало возможность проводить селективный и массовый скрининг ЛБН, для которых существуют методы патогенетического лечения. На сегодняшний день разработана и уже коммерчески доступна тест-система для одновременного определения активности 6 лизосомных ферментов (для диагностики болезней Краббе, Помпе, Фабри, Гоше, Ниманна—Пика тип А/В и мукополисахаридоза I типа). Тест является высокоспецифичным для каждого конкретного заболевания, поскольку применяются субстраты, близкие по своему строению к натуральным. Проходит апробацию новая тест-система для выявления других ЛБН (мукополисахаридозов типов II, III, VI, IVA, VII, нейронального цероидного липофусциноза 2-го типа) и в ближайшие годы ожидается ее появление [32], а в перспективе следует ожидать создания тест-систем для диагностики и многих других ЛБН.
Роль тандемной масс-спектрометрии в диагностике других наследственных болезней обмена веществ
С помощью МС/МС можно выявлять огромное число различных метаболитов. Созданы методы для выявления аномальных метаболитов желчных кислот, что необходимо для диагностики нарушений метаболизма холестерина и липидов, синтеза первичных желчных кислот, а также при дефектах биогенеза пе-роксисом [33—35]. При различных холестатических гепатобилиарных нарушениях с помощью МС/МС можно определять концентрации конъюгированных желчных кислот в различных биологических жидкостях.
Исследования по количественной оценке лизо-фосфатидилхолина в высушенных пятнах крови для
диагностики пероксисомных нарушении показывают высокую чувствительность данного маркера для его применения и в неонатальном скрининге при дефектах биогенеза пероксисом [36].
Метод МС/МС также позволяет количественно определять от 17 до 24 пуринов и пиримидинов в моче в одном анализе, что позволяет проводить диагностику нарушении обмена пуринов и пиримидинов [37].
Заключение
Роль МС/МС в диагностике НБО в последние годы значительно возросла и данныи метод повсеместно применяется в массовом и селективном скрининге для диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, нарушений митохондриального ß-окисле-ния. Также разработаны методы диагностики нарушений обмена пуринов и пиримидинов, пероксисомных заболеваний, определения активности ферментов ли-зосом и многие другие. Безусловно, что в ближайшее время следует ожидать появления новых перспективных методов для диагностики не только отдельных нозологических форм, но и целых групп НБО.
Конфликт интересов/Conflict of interests
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.
Финансирование/Financing
Спонсор исследования — Медицинская компания INVITRO.
Sponsor of the research — Medical company INVITRO.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
E ra
u
09
1. Schulze A., Lindner M., Kohlmuller D.
et al. Expanded newborn screening for inborn errors of metabolism by electrospray ioniza-tion-tandem mass spectrometry: results, outcome, and implications. Pediatrics 2003;111(6 Pt 1):1399-406. PMID: 12777559.
2. Garg U., Dasouki M. Expanded newborn screening of inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry: clinical and laboratory aspects. Clin Biochem 2006;39(4):315-32.
doi: 10.1016/j.clinbiochem.2005.12.009.
3. Gelb M.H., Turecek F., Scott C.R., Chamoles N.A. Direct multiplex assay of enzymes in dried blood spots by tandem mass spectrometry for the newborn screening of lysosomal storage disorders. J Inherit Metab Dis 2006;29(2-3):397-404.
doi: 10.1007/s10545-006-0265-4.
4. Wilcken B., Wiley V., Hammond J., Carpenter K. Screening newborns for inborn errors of metabolism by tandem mass spec-
trometry. N Engl J Med 2003;348(23):2304-12. doi: 10.1056/NEJMoa025225.
5. Yu C.L., Gu X.F. Newborn screening of inherited metabolic disease by tandem mass spectrometry. Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2006;38(1):103-6. PMID: 16415979.
6. Dooley K.C. Tandem mass spectrometry in the clinical chemistry laboratory. Clin Biochem 2003;36(6):471-81. PMID: 12951172.
7. Griffiths W.J. Tandem mass spectrometry in the study of fatty acids, bile acids, and steroids. Mass Spectrom Rev 2003;22(2):81-152. doi: 10.1002/mas.10046.
8. Carpenter K.H., Wiley V. Application of tandem mass spectrometry to biochemical genetics and newborn screening. Clin Chim Acta 2002;322(1—2):1—10. PMID: 12104075.
9. Green A., Pollitt R.J. Population newborn screening for inherited metabolic disease: current UK perspectives. J Inherit Metab Dis 1999;22(4):572-9. PMID: 10407789.
10. la Marca G., Malvagia S., Pasquini E.
et al. Rapid 2nd-tier test for measurement of 3-OH-propionic and methylmalonic acids on dried blood spots: reducing the false-positive rate for propionylcarnitine during expanded newborn screening by liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2007;53(7):1364-9. doi: 10.1373/clinchem.2007.087775.
11. Janzen N., Terhardt M., Sander S. et al. Towards newborn screening for ornithine transcarbamylase deficiency: fast non-chro-matographic orotic acid quantification from dried blood spots by tandem mass spectrome-try. Clin Chim Acta 2014;430:28-32.
doi: 10.1016/j.cca.2013.12.020.
12. Zytkovicz T.H., Fitzgerald E.F., Marsden D. et al. Tandem mass spectrometric analysis for amino, organic, and fatty acid disorders in newborn dried blood spots: a two year summary from the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 2001;47(11):1945-55. PMID: 11673361.
1G4
оссиискии
Журнал
13. Allard P., Grenier A., Korson M.S., Zytkovicz T.H. Newborn screening for hepatorenal tyrosinemia by tandem mass spectrometry: analysis of succinylacetone extracted from dried blood spots. Clin Biochem 2004;37(11):1010-5.
doi: 10.1016/j.clinbiochem.2004.07.006.
14. Chace D.H., Hillman S.L., Millington D.S. et al. Rapid diagnosis of homocystinuria and other hypermethioninemias from newborns' blood spots by tandem mass spectrometry. Clin Chem1996;42(3):349-55. PMID: 8598094.
15. Chace D.H., Hillman S.L., Millington D.S. et al. Rapid diagnosis of maple syrup urine disease in blood spots from newborns by tandem mass spectrometry. Clin Chem 1995;41(1):62-8. PMID: 7813082.
16. Smith W.E., Millington D.S.,
Koeberl D.D., Lesser P.S. Glutaric acidemia, type I, missed by newborn screening in an infant with dystonia following promethazine administration. Pediatrics 2001;107(5):1184-7. PMID: 11331707.
17. Chace D.H., DiPerna J.C., Kalas T.A. et al. Rapid diagnosis of methylmalonic and propionic acidemias: quantitative tandem mass spectrometric analysis of propionylcar-nitine in filter-paper blood specimens obtained from newborns. Clin Chem 2001;47(11):2040-4. PMID: 11673377.
18. Kuhara T., Matsumoto I. Studies on the urinary acidic metabolites from three patients with methylmalonic aciduria. Biomed Mass Spectrom 1980;7(10):424-8. PMID: 6111361.
19. Wang H., Wang X., Li Y. et al. Screening for inherited metabolic diseases using gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) in Sichuan, China. Biomed Chromatogr 2017;31(4).
doi: 10.1002/bmc.3847.
20. Van Hove J.L., Zhang W., Kahler S.G. et al. Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency: diagnosis by acyl-carnitine analysis in blood. Am J Hum Genet 1993;52(5):958-66. PMID: 8488845. PMCID: PMC1682046.
21. Koeberl D.D., Young S.P., Gregersen N. et al. Rare disorders of metabolism with elevated butyryl- and isobutyryl-carnitine detected by tandem mass spectroscopy newborn
screening. Pediatr Res 2003;54(2):219-23. doi: 10.1203/01.PDR.0000074972.36356.89.
22. Matern D., Strauss A.W., Hillman S.L.
et al. Diagnosis of mitochondrial trifunctional protein deficiency in a blood spot from the newborn screening card by tandem mass spectrometry and DNA analysis. Pediatr Res 1999;46(1):45-9. PMID: 10400133.
23. Abdenur J.E., Chamoles NA., Guinle A.E. et al. Diagnosis of isovaleric acidaemia by tandem mass spectrometry: false positive result due to pivaloylcarnitine in a newborn screening programme. J Inherit Metab Dis 1998;21(6):624-30. PMID: 9762597.
24. Chace D.H., Sherwin J.E., Hillman S.L. et al. Use of phenylalanine-to-tyrosine ratio determined by tandem mass spectrometry to improve newborn screening for phenylketon-uria of early discharge specimens collected in the first 24 hours. Clin Chem 1998;44(12):2405-9. PMID: 9836704.
25. Hampe M.H., Panaskar S.N., Yadav A.A., Ingale P.W. Gas chromatography/mass spec-trometry-based urine metabolome study in children for inborn errors of metabolism: An Indian experience. Clin Biochem 2017;50(3):121-6.
doi: 10.1016/j.clinbiochem.2016.10.015.
26. Chen H., Yu C. Urinary Succinylacetone Analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). Methods Mol Biol 2016;1378:281-90.
doi: 10.1007/978-1-4939-3182-8_30.
27. Kubaski F., Mason R.W., Nakatomi A. et al. Newborn screening for mucopolysaccharidoses: a pilot study of measurement of glycosaminoglycans by tandem mass spec-trometry. J Inherit Metab Dis 2017;40(1):151-8.
doi: 10.1007/s10545-016-9981-6.
28. Sluiter W., van den Bosch J.C., Gou-driaan D.A. et al. Rapid ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spec-trometry assay for a characteristic glyco-gen-derived tetrasaccharide in Pompe disease and other glycogen storage diseases. Clin Chem 2012;58(7):1139-47.
doi: 10.1373/clinchem.2011.178319.
29. Dekker N., van Dussen L., Hollak C.E. et al. Elevated plasma glucosylsphingosine in Gaucher disease: relation to phenotype, storage cell markers, and therapeutic response.
Blood 2011;118(16):e118—27. doi: 10.1182/blood-2011-05-352971.
30. Togawa T., Kodama T., Suzuki T. et al. Plasma globotriaosylsphingosine as a bio-marker of Fabry disease. Mol Genet Metab 2010;100(3):257-61. doi: 10.1016/j. ymgme.2010.03.020.
31. Polo G., Burlina A.P., Kolamunnage T.B. et al. Diagnosis of sphingolipidoses: a new simultaneous measurement of lysosphingolipids by LC-MS/MS. Clin Chem Lab Med 2017; 55(3):403-14. doi: 10.1515/cclm-2016-0340.
32. Liu Y., Yi F., Kumar A.B. et al. Multiplex Tandem Mass Spectrometry Enzymatic Activity Assay for Newborn Screening of the Mucopolysaccharidoses and Type 2 Neuronal Ceroid Lipofuscinosis. Clin Chem 2017;63(6):1118-26.
doi: 10.1373/clinchem.2016.269167.
33. Gan-Schreier H., Okun J.G., Kohlmuel-ler D. et al. Measurement of bile acid CoA esters by high-performance liquid chroma-tography-electrospray ionisation tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS).
J Mass Spectrom 2005;40(7):882-9. doi: 10.1002/jms.864.
34. John C., Werner P., Worthmann A. et al. A liquid chromatography-tandem mass spec-trometry-based method for the simultaneous determination of hydroxy sterols and bile acids. J Chromatogr A 2014;1371:184-95. doi: 10.1016/j.chroma.2014.10.064.
35. Bootsma A.H., Overmars H., van Rooij A. et al. Rapid analysis of conjugated bile acids in plasma using electrospray tandem mass spectrometry: application for selective screening of peroxisomal disorders. J Inherit Metab Dis 1999;22(3):307-10. PMID: 10384393.
36. Wu C., Iwamoto T., Igarashi J. et al. Application of a diagnostic methodology by quantification of 26:0 lysophosphatidylcho-line in dried blood spots for Japanese newborn screening of X-linked adrenoleukodys-trophy. Mol Genet Metab Rep 2017;12:115-8.
doi: 10.1016/j.ymgmr.2017.06.004.
37. Hartmann S., Okun J.G., Schmidt C.
et al. Comprehensive detection of disorders of purine and pyrimidine metabolism by HPLC with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Clin Chem 2006;52(6):1127-37. doi: 10.1373/clinchem.2005.058842.
E ra
Статья поступила в редакцию: 20.03.2018. Принята в печать: 10.08.2018. Article was received by the editorial staff: 20.03.2018. Accepted for publication: 10.08.2018.
u
09
