CC BY
96
Е.С. Гвоздева, М.В. Ефимова, Р.А. Карначук, В.Ю. Дорофеев, М.П. Асташкина
РОЛЬ СВЕТА В МОРФОГЕНЕЗЕ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ТРАНСГЕННОГО ТАБАКА С ГЕНОМ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ЧЕЛОВЕКА
Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный контракт № 02.512.11.2035
Показана роль селективного света в морфогенезе клеточных культур Nicotiana tabacum L. in vitro дикой и трансгенных линий с геном интерлейкина-18 человека. Получены суспензионные культуры клеток этих же линий табака.
Наиболее важный фактор внешней среды - свет -регулирует морфогенез растений, определяя продукционную стратегию организмов. Отдельные участки спектра контролируют синтез различных метаболитов, в том числе и вторичных. Прошло почти полвека с тех пор, когда Н.П. Воскресенская показала, что коротковолновый свет (синий) направляет метаболизм в сторону белкового синтеза, а длинноволновый - углеводного [1]. В настоящее время появилось много работ, посвященных влиянию селективного света на образование вторичных метаболитов [2], в том числе и в культуре клеток in vitro [3—6].
В настоящее время активно развивается направление генной инженерии, нацеленное на получение трансгенных растений с повышенным синтезом вторичных метаболитов [7], а также использование растений для получения ценных терапевтических белков [8, 9] ив качестве источников «съедобных» вакцин для возможной иммунизации как человека, так и животных [10]. Для масштабного получения растительной ткани используют клеточные культуры - каллусные и суспензионные.
Однако отсутствуют данные о роли селективного света в морфогенезе клеточной культуры трансгенных растений, тогда как оптимизация условий освещения может значительно снизить стоимость производства биомассы клеточных культур растений, представляющих интерес для получения ценных метаболитов.
Задачей наших исследований было изучение морфогенеза клеточной культуры in vitro трансгенного табака с геном интерлейкина-18 человека на селективном свету.
Трансгенные линии табака Il18№7—1, Il18№7—11 и Il18№28—3 (Nicotiana tabacum L., исходная линия SR1) с геном интелейкина-18 человека получены методом агробактериальной трансформации в Институте цитологии и генетики СО РАН [11]. Данные трансгенные линии гомозиготны и являются потомками третьего поколения (семена растений табака второго поколения, полученные от самоопыления исходных трансформантов, были любезно предоставлены Е.В. Дейнеко -д.б.н., зав. лабораторией гетерозиса растений Института цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирска).
Экспланты помещали в пробирки на агаризованную питательную среду МС с добавлением 2,4-Д. Контрольным вариантом служили листовые экспланты, выращиваемые в условиях абсолютной темноты (t = 27-30 оС, влажность — 70%). В качестве источника света использовали люминесцентные лампы фирмы «Philips»: синий —
ТЬ-О 18Ш/18 (в видимом диапазоне с максимумом излучения 425-450 нм), зеленый — ТЬ-О 18Ш/17 (с максимумом излучения 540-550 нм) и красный свет — ТЬ-О 18Ш/16 (с максимумом излучения 650-670 нм). Фотопериод составлял 16/8 (день/ночь) часов; интенсивность освещения I = 1,9 Вт/м2. Объем клеток вычисляли по формуле Ю.Л. Цельникер [12].
Наиболее интенсивное образование каллуса наблюдалось на красном свету, наименьшее - на синем, по сравнению с контролем в темноте. При длительном культивировании каллуса в темноте и на селективном свету отмечены морфогенные процессы (табл. 1).
Синий свет способствовал зеленению каллуса, при этом каллус табака дикой линии ВЮ имел более интенсивную окраску, чем трансгенная линия 1118№7—11. Позеленение каллуса на синем свету, вероятно, связано с тем, что коротковолновый участок спектра индуцирует биосинтез белка и увеличивает содержание хлорофилла [1]. Необходимо отметить, что позеленение каллуса наблюдалось только на первом пассаже.
С нулевого пассажа на синем свету и в темноте начинают формироваться зачатки сосудистых структур. На втором пассаже данные структуры имелись уже во всех линиях трех вариантов, но наибольшая дифференциация клеток наблюдалась в темновом контроле, а наименьшая - на красном свету. Причем у БЮ новообразований было больше, чем у трансгенной линии 1118№7-11 (табл. 2-4).
Морфометрические исследования клеток каллусной культуры табака, выросших в темноте, показали, что объем клеток исходной линии (ВЮ) нулевого и первого пассажей достоверно меньше, чем у трансгенных линий (1118№7-1, 1118№7-11 и 1118№28-3) (рис. 1, 2).
Объем каллусных клеток нулевого пассажа дикой (ВЮ) и трансгенных линий табака на красном свету был значительно меньше по сравнению с клеточными культурами, адаптированными к синему свету. Клетки родительской линии БЮ и трансгенных культур 1118№7-1, 1118№7-11 и 1118№28-3 отличались по объему в зависимости от пассажа и условий освещения. Объем клеток БЮ нулевого и первого пассажа увеличивался на синем и зеленом свету. Размеры клеток трансгенных линий табака нулевого пассажа на зеленом свету не изменялись по сравнению с темновым контролем, однако объем клеток первого пассажа двух линий трансгенного табака (1118№7-1 и 1118№7-11) значительно увеличивался.
Морфогенные ответы листовых эксплантов табака в процессе каллусообразования на селективном свету
Вариант Линии Структура каллуса
Темнота (контроль) SR1 Белый, рыхлый, с желтоватыми уплотнениями и различными выростами
IL18№7-11 Светлые глобулы, выросты, без уплотнений
Красный свет SR1 Светлый, рыхлый, местами уплотненный, с глобулами
IL18№7-11 Светлый, рыхлый, с белыми уплотнениями, глобулами, крупенчатыми выростами
Синий свет SR1 Светлый, рыхлый, крупенчатые светло-зеленые выросты со временем исчезли
IL18№7-11 Светлый, местами светло-зеленые и темные пятна со временем исчезли
Т а б л и ц а 2
Распределение клеток каллусной ткани табака дикой SR1 и трансгенной линии IL18№7-11, нулевой пассаж
Вариант Линии Форма клеток, % Элементы дифференциации клеток, %
круглые овально- яйцевидные удлиненные
Темнота (контроль) SR1 12 53 36 100
Il18№7-11 25 48 27 95
Красный свет SR1 41 38 21 50
Il18№7-11 32 60 8 10
Синий свет SR1 23 51 26 90
Il18№7-11 20 58 22 80
Т а б л и ц а 3
Распределение клеток каллусной ткани табака дикой 8Ш и трансгенной линии ТЬ18№7-11, второй пассаж
Вариант Линии Форма клеток, % Элементы дифференциации клеток, %
круглые овально-яйцевидные удлиненные
Темнота(контроль) SR1 28 58 14 100
Il18№7-11 18 63 19 100
Красный свет SR1 26 46 28 60
Il18№7-11 32 53 15 20
Синий свет SR1 25 47 28 95
Il18№7-11 23 44 33 80
Т а б л и ц а 4
Распределение клеток каллусной ткани табака дикой 8Ш и трансгенной линии !Ь18№7-11, третий пассаж
Вариант Линии Форма клеток, % Элементы дифференциации клеток, %
круглые овально-яйцевидные удлиненные
Темнота(контроль) SR1 12 46 42 100
Il18№7-11 22 49 28 100
Красный свет SR1 25 45 31 80
Il18№7-11 25 36 40 60
Синий свет SR1 14 47 39 97
Il18№7-11 19 37 44 85
tO
ю
О
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
□ Т □ ЗС □ СС
Il 18№7-1 II 18№7-11
18№28-3
Рис. 1. Объем клеток каллусной ткани табака дикой SR1 и трансгенных Il18№7-1, Il18№7-11 и Il18№28-3 линий, выращенных в темноте (Т), на зеленом (ЗС) и синем свету (СС), нулевой пассаж
Рис. 2. Объем клеток каллусной ткани табака дикой БЮ и трансгенных 1118№7-1, 1118№7-11 и 1118№28-3 линий, выращенных в темноте (Т), на зеленом (ЗС) и синем свету (СС), 1-й пассаж
На синем свету наблюдалось увеличение объема клеток более чем в 2 раза у трансгенной линии 1118№28—3 и снижение объема клеток у 1118№7—11 на нулевом пассаже.
При дальнейшем культивировании на синем свету (1-й пассаж) объем клеток 1118№28—3 увеличивался в три раза, клетки 1118№7— 1 становились мельче, по сравнению с темновым контролем.
На основе каллусных культур, выращенных в темноте, были получены суспензионные культуры родительской SR1 и трансгенных Il18№7—1, Il18№7—11 линий.
Определено минимальное время удвоения клеток суспензионной культуры.
Таким образом, показана зависимость морфогенеза клеточной культуры in vitro трансгенных линий табака с геном интерлейкина-18 человека от селективного света.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воскресенская Н.П., Нечаева Е.П. Действие синего, красного и зеленого света на содержание белка, нуклеиновых кислот и хлорофилла в
молодых растениях ячменя // Физиология растений. 1967. Т. 14, № 2. С. 299-307.
2. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.
3. Корецкая Т.Ф., Запрометов М.Н. Фенольные соединения в культуре ткани чайного растения (Camellia sinensis) и влияние света на их обра-
зование // Физиология растений. 1975. Т. 22, вып. 5. С. 941-946.
4. Makunga N.P., van Staden J., Cress W.A. The effect of light and 2,4-D on anthocyanin production in Oxalis reclinata callus // Plant Growth Regula-
tion. 1997. Vol. 23. P. 153-158.
5. Ouyang J., WangX., Zhao B., Wang Y. Light intensity and spectral quality influencing the callus growth of Cistanche deserticola and biosynthesis of
phenylethanoid glycosides // Plant Science. 2003. Vol. 165. P. 657-661.
6. Shohael A.M., Ali M.B., Yu K. W. et al. Effect of light on oxidative stress, secondary metabolites and induction of antioxidant enzymes in Eleuthero-
coccus senticosus somatic embryos in bioreactor // Process Biochemistry. 2006. Vol. 41. P. 1179-1185.
7. Memelink J., Kijne J.W., van der Heijden R., Verpoorte R. Genetic modification of plant secondary metabolite pathways using transcriptional regula-
tors // Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Plant Cells / Ed.J.-J. Zhong. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2001. P. 103-125.
8. Gutiérrez-Ortega A., Ávila-Moreno F., Jorge Saucedo-Arias L. et al. Expression of a single-chain human interleukin-12 gene in transgenic tobacco
plants and functional studies // Biotechnology and Bioengineering. 2004. Vol. 85, i. 7. P. 734-740.
9. Ma S., Huang Y., Davis A. et al. Production of biologically active human interleukin-4 in transgenic tobacco and potato // Plant Biotechnology Journal.
2005. Vol. 3, i. 3. P. 309-318.
10. Carter J.E., Langridge W.H.R. Plant-based vaccines for protection against infectious and autoimmune diseases // Crit. Rev. Plant Sci. 2002. Vol. 21. P. 93-109.
11. Турчинович А.А., Загорская А.А., Филипенко М.Л. и др. Получение трансгенных растений табака - продуцентов интерлейкина-18 человека // Докл. РАН. 2004. Т. 395, № 5. С. 704-707.
12. Цельникер Ю.Л. Физиологические основы теневыносливости древесных растений. М.: Наука, 1978. С. 212.
Статья поступила в редакцию журнала 4 декабря 2006 г., принята к печати 11 декабря 2006 г.
