CC BY
392
С. Н. Куликов, Ю. А. Тюрин, Д. А. Долбин,
Р. З. Хайруллин
РОЛЬ СТРУКТУРЫ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИТОЗАНА
Хитозан является гетерополимером, поэтому степень полимеризации, количественное соотношение ацетилированных и деацетилированных звеньев, а также характер их расположения вдоль полимерной цепи обуславливают многообразие его химических и биологических свойств. Поиск и установление структуры, соответствующей требуемым свойствам, является одной из главных задач в биотехнологии хитозана.
Хитозан - сополимер Ы-ацетил-Р-глюкозамина и Р-глюкозамина (рис. 1).
Хитозан является частично деацетилированным производным хитина, наиболее распространённого структурного компонента гетеротрофных организмов - бактерий, грибов, членистоногих. Хитин в свою очередь является аналогом целлюлозы - самого распространённого структурного вещества автотрофных организмов - растений. Ежегодно в природе образуется около 1011 тонн хитина, возобновляемого и практически неисчерпаемого источника для получения хитозана.
Антибактериальное и антигрибное действия, иммуномодулирующие свойства, эли-ситорная активность в растениях, способность связывать металлы, образовывать поли-электролитные комплексы с другими веществами уже в наше время позволяют применять хитозан в пищевой, косметической и лёгкой промышленностях, в медицине и ветеринарии, сельском хозяйстве [1]. Нетоксичность, неаллергенность, биосовместимость и биодегради-руемость делают этот биополимер необычайно привлекательным для биотехнологии. На-
личие реакционноспособной аминогруппы в составе глюкозаминных звеньев позволяет получать множество производных хитозана, расширяющих его свойства и сферы применения.
Однако, необходимо учитывать, что свойства хитозана зависят от его химической структуры, которая может сильно варьировать. Основными структурными параметрами для хитозана являются - степень ацетилирования или деацетилирования, характер расположения ацетилированных и деацетилированных остатков вдоль полимерной цепи, молекулярная масса.
Обычно хитозан получают путём щелочного деацетилирования хитина, когда количество деацетилированных звеньев превышает количество ацетилированных. Таким образом степень деацетилирования хитозана широко варьирует - от 50 до практически 100%. Хитозан становится способным растворяться в водных растворах кислот благодаря протонированию свободных аминогрупп. Таким образом, хитозан в присутствии кислот становится заряженным положительно и представляет собою поликатион.
Степень деацетилирования играет важную роль в проявлении хитозаном биологической активности. Было показано, что антигрибную и антибактериальную активности хи-тозан проявлял, когда его свободные группы были протонированы, в то время как хитин, у которого все аминогруппы ацетилированы, а также хитозан при рН 7.0-8.0, когда аминогруппы непротонированы, были инертны. Предполагается, что механизм антибактериального и антигрибного действия хитозана связан с его спобностью связываться с отрицательно заряженными поверхностными структурами клеток. Такое взаимодействие нарушает нормальное функционирование обменных процессов клетки с внешней средой, изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны в результате чего усиливается отток веществ из клетки. Таким образом, для достижения максимальной антибактериальной активности хитозану необходимо иметь максимальное количество свободных аминогрупп, то есть высокую степенью деацетилирования, что и подтверждается многочисленными экспериментальными данными [2].
Адъювантная активность хитозана также снижалась, если количество свободных аминогрупп уменьшалось в пределах от 85 до 42% [3].
Однако в элиситорной активности хитозана в растениях важную роль играют именно ацетилированные остатки, которые отвечают за связь хитозанового полимера со специфическими растительными рецепторами. Поэтому в ряде случаев уменьшение ацетилиро-ванных звеньев ниже определённой доли в составе хитозана влечёт частичную или полную потерю его элиситорных способностей [4].
Степень деацетилирования влияет на скорость ферментативной деполимеризации хитозана, поскольку большинство ферментов гидролизирующих хитозан расщепляют полимерную цепь вблизи ацетилированных остатков глюкозамина [5].
Таким образом, варьирование данного параметра у хитозана позволяет контролировать скорость его гидролиза и высвобождение доставляемого вещества из комплекса, в котором хитозан выступает в качестве доставщика. Уменьшение степени ацетилирования делает хитозан более устойчивым к расщеплению гидролазами, что используется для доставки ДНК [6].
Но необходимо учесть, что степень деацетилирования, определённая для образца хитозана, является величиной усреднённой. Она будет соответствовать реальной только в случае, если ацетилированные звенья будут распределены в полимерной цепи случайным образом. Получение хитозана, в котором расположение ацетилированных остатков будет случайным в большинстве молекул образца, сопряжено с требованием гомогенности процесса деацетилирования хитина.
Однако, а-хитин, самая распространённая его форма, используемая для получения хитозана, обладает высокой степенью кристалличности. Многочисленные островки кристалличности практически недоступны для проникновения молекул щелочи, поэтому они являются источником ацетилированных блоков в составе хитозана, размер которых определяется величиной кристаллических областей. Г омогенное деацетилирование происходит только в аморфных областях. Поэтому хитозан, полученный гетерогенным деацетилирова-
нием, содержит молекулы, сильно отличающиеся как по степени деацетилирования, так и по распределению ацетилиро-ванных остатков вдоль полимерной цепи (рис. 2).
Использование определённой техники растворения, подбор оптимальной температуры, концентрации щелочи, длительности реакции, использование стадийности процесса позволяет осуществить деаце-тилирование в максимально приближённом к гомогенному условиях [7]. Также возможно использование в-хитина, обладающего меньшей кристалличностью.
Молекулярная масса хи-тозана, наряду с его степенью деацетилирования, является
важнейшей характеристикой вещества. Увеличение степени полимеризации хитозана способствует более прочному связыванию его с поверхностью клеток. Этим можно объяснить то, что с увеличением молекулярной массы увеличивается антимикробная и антигрибная активности хитозана.
Однако отдельные работы указывают на то, что максимальной активностью обладают низкомолекулярные образцы и даже олигомеры. Вероятно, небольшие молекулы обладают большей проникающей способностью, что позволяет им проникать в цитоплазму и влиять на физиологические процессы, происходящие внутри клеток [8].
Адъювантная активность хитозана отмечена для образцов с молекулярной массой от 7 до 150 кДа, в то время как низкомолекулярный образец 3,5 кДа был неактивен [3]. Примерно такая же зависимость от молекулярной массы отмечена и в радиопротекторном действии хитозана [9].
Элиситорная активность хитозана в растениях также зависит от степени полимеризации молекул хитозана. Так, низкомолекулярный хитозан был наиболее эффективен при подавлении вируса мягкой мозаики фасоли в растениях фасоли [10]. Однако на некоторых растениях элиситорная активность хитозана увеличивалась с ростом молекулярной массы элистора. Возможно, на растениях высокомолекулярные молекулы хитозана, находясь длительное время на поверхности листьев, постепенно расщепляются выделяемыми растениями ферментами до более мелких фрагментов, которые, обладая большей проникающей
Рис. 2 - Механизм деацетилирования а -хитина: 1 - кристаллический домен; 2 - аморфная область. А и Д - ацетилированные и де-ацетилированные остатки глюкозамина, соответственно
способностью, обеспечивают длительный элиситорный эффект.
Таким образом, биологическая активность хитозана зависит от его молекулярной массы. Однако, как и в случае со степенью деацетилирования, образец хитозана представляет собой смесь молекул с различной степенью полимеризации. Часто применяемая средневязкостная молекулярная масса для характеристики хитозана представляет собой величину усреднённую и не отражающую истинное молекулярно-массовое распределение и степень полидисперсности образца.
Было показано, что для доставки ДНК, наиболее оптимальным было использование узкодисперсных образцов хитозана со степенью полимеризации 15-21. Использование по-лидисперсного образца со средней степенью полимеризации 18 было менее эффективным, поскольку содержащиеся в таком образце слишком мелкие молекулы хитозана не обеспечивали достаточную компактизацию нуклеиновой кислоты и защиту её от деградации ДНКазами, а слишком крупные молекулы делали комплекс трудно диссоциирующим [6]. В итоге, молекул с оптимальной степенью полимеризации в образце оказывалось недостаточным для эффективной доставки ДНК.
Заключение
Таким образом, можно сделать вывод, что образец хитозана в результате деацетили-рования или гидролиза практически всегда представляет собой смесь молекул с разной структурой, что часто не позволяет прямо установить истинное соответствие химического строения и свойства вещества. В одном и том же образце хитозана могут содержаться различные по своей биологической активности компоненты, каждый из которых в чистом виде может обладать гораздо большей активностью по сравнению с исходной смесью (рис. 3).
Рис. 3 - Зависимость биологической активности от физико-химических характеристик хитозана: а - взаимодействие с рецепторами растений [4]; б - противовирусная активность в растениях фасоли [10]; в - антибактериальная активность [2, 8]; г - использование для доставки ДНК [6]; д - радиопротекторная активность [9]; е - адъювантная активность [3]; ж - элиситорная активность в растениях пшеницы [4]; з -область нерастворимости хитина/хитозана
Данная проблема может быть во многом решена при условии молекулярномассовой характеристики применяемых образцов с определением их среднечисловых и среднемассовых молекулярных масс, степени полидисперсности. Важным является получение монодисперсных образцов хитозана. Только подробная характеристика хитозана с определением его степени деацетилирования, характера расположения ацетилированных остатков в полимерной цепи, молекулярно-массового распределения позволит установить истинную роль структуры хитозана в его биологической активности.
Литература
1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. 368 с.
2. Lim C-H., Hudson S.M. Review of ^itosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. V.C43. №2. P.223-269.
3. Алексеева Л.Г., Свирщевская Е.В., Ильина А.В., Лопатин С.А., Шевченко М.А., Варламов В.П. Изучение адъювантных свойств низкомолекулярных хитозанов // Совр. пробл. дерматовенерол. иммунол. врачеб. косметол. 2006. Т.1. С.45-51.
4. Vander P., Varum K.M., Domard A., Eddine El Gueddari N., Moerschbacher B.M. Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in wheat leaves // Plant Physiol. 1998. V.118. №4. P.1353-1359.
5. Ильина А.В., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т.39. №3. С.237-277.
• Koping-HoggardM., Varum K.M., Issa M., Danielsen S., Christensen B.E., Stokke B.T., Artursson P. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers. // Gene Ther. 2004. V.11. №19. P.1441-1452.
6. Lamarque G., Viton C., Domard A. Comparative study of the first heterogeneous deacetylation of alpha- and beta-chitins in a multistep process // Biomacromolecules. 2004. V.5. №3. P.992-1001.
7. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. №3. C.301-306.
8. Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., Банникова Г.Е., Варламов В.П. Лечебнопрофилактические свойства низкомолекулярного хитозана при экспериментальном лучевом поражении. // Радиационная биол. радиоэкология. 2004. Т.44. №5. С.547-549.
9. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №2. C.224-228.
© С. Н. Куликов - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии; Ю. А. Тюрин - канд. мед. наук, зав. лаб. того же ин-та; Д. А. Долбин — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. того же ин-та; Р. З. Хайруллин - асп. каф. технологии синтетического каучука КГТУ.
