CC BY
103
Роль серотонина в регуляции взаимодействия нервной и иммунной систем при рассеянном склерозе
^ М.В. Мельников1, М.В. Пащенков2, А.Н. Бойко1
1 Кафедра неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики Лечебного факультета
ГБОУВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова"МЗ РФ, Москва 2 Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ "ГНЦИнститут иммунологии"ФМБАРоссии, Москва
Проведено комплексное неврологическое и иммунологическое обследование 43 больных ремиттирующим рассеянным склерозом. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale). Концентрацию серотонина в сыворотке крови измеряли методом иммунофер-ментного анализа. Функциональную активность T-хелперов 1-го и 17-го типов оценивали по способности продукции интерферона-у и интерлейкина-17 мононуклеарными клетками периферической крови. Установлено, что продукция цитокинов у больных рассеянным склерозом в стадии обострения достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии и у здоровых доноров. Уровень серотонина был сопоставимым во всех группах. Серотонин в конечной концентрации 10-4 М оказывает ингибирующий эффект на продукцию интерлейкина-17. Ключевые слова: рассеянный склероз, серотонин, T-хелперы 17-го типа, интерлейкин-17.
Введение
Рассеянный склероз (РС) — хроническое воспалительное демиелинизирующее и нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы с аутоиммунным механизмом развития.
Одним из развивающихся направлений в изучении патогенеза РС является исследование нервно-иммунного взаимодействия [11]. Полагают, что ключевая роль в регуляции этого взаимодействия принадлежит нейротрансмиттерам, в частности биогенным аминам, имеющим рецепторы на клетках как нервной, так и иммунной системы [1]. Серотонин является одним из основных нейротрансмиттеров в центральной нервной системе, обладающих иммуномодулирующим эффектом и участвующих в патогенезе экспериментального
Контактная информация: Мельников Михаил Валерьевич, [email protected]
аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) и РС. Установлено, что использование селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) при ЭАЭ подавляет выработку провоспалительных цитокинов (интерлейкина-12 (ИЛ-12), интерферона-у (ИФН-у)), повышает уровень нейротро-фического фактора мозга, противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а также уменьшает выраженность клинических симптомов ЭАЭ [5, 15, 17, 19, 20]. Имеются данные о влиянии СИОЗС и на течение РС. Так, в исследовании С.1. Mitsonis е! а1. было установлено, что применение СИОЗС является эффективным методом профилактики стрессиндуцированных рецидивов РС у женщин [10]. Еще в одном исследовании было продемонстрировано снижение активности РС по данным магнитно-резонансной томографии на фоне применения флуоксетина, который также относится к группе СИОЗС [12].
Результаты исследований
Таблица 1. Клинико-демографические характеристики больных РС и контрольной группы на момент включения в исследование
Показатель Больные РС Контрольная группа (n = 20)
обострение (n = 14) ремиссия (n = 29)
Возраст, годы 33 (28; 42) 31 (26; 47) 26,5 (25; 28)
Мужчины/женщины, абс. 6/8 12/17 9/11
Длительность РС, годы 5 (3,3; 11,5) 6 (2; 9) -
EDSS, баллы 3 (2,6; 3,5) 1,5 (1; 3) -
Примечание. Здесь и в табл. 2: представлено значение медианы, в скобках - 25-й и 75-й процентили.
В целом влияние серотонина на имму-нопатогенез РС не вызывает сомнений. В то же время воздействие серотонина на T-хелперы 1-го и 17-го типов, играющие ключевую патогенетическую роль при РС, недостаточно изучено. Таким образом, целью настоящего исследования явилось изучение возможных ассоциаций между клиническими характеристиками РС, функциональной активностью T-хелперов 1-го и 17-го типов, концентрацией серото-нина в сыворотке крови, а также уточнение влияния серотонина на T-хелперы 1-го и 17-го типов in vitro.
Материал и методы
Пациенты
Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 43 больных (18 мужчин, 25 женщин) в возрасте от 23 до 50 лет с достоверным диагнозом ре-миттирующего РС по критериям McDonald в модификации от 2005 г. [13]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 1 до 15 лет (медиана 4,5 года). Все больные получали препараты, изменяющие течение РС (ПИТРС), первой линии: 25 больных — глатирамера ацетат, 18 больных — ИФН-01Ъ (медиана длительности лечения ПИТРС составила 4 года). У 29 пациентов имел место РС в стадии клинической ремиссии, у 14 — в стадии обострения. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale — расширенная шкала оценки степе-
ни инвалидизации) [6]. На момент забора крови все больные более 3 мес не получали лечение глюкокортикостероидами (14 пациентам, находящимся в стадии обострения, терапия глюкокортикостероидами была проведена после забора крови) и более 6 мес не получали лечение антидепрессантами. Контрольную группу составили 20 условно здоровых доноров (9 мужчин, 11 женщин). Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографические характеристики больных РС и здоровых доноров представлены в табл. 1.
Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пиро-гова" МЗ РФ.
Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови
Для оценки функциональной активности Т-хелперов 1-го и 17-го типов из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с EDTA) выделяли моно-нуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографи-на ("ПанЭко", Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,3) и ресуспендировали в культуральной среде ЯРМ1-1640 ("ПанЭко") с добавлением 2 мМ L-глутамина ("ПанЭко") и 10% фетальной телячьей сыворотки ("ПанЭко"). Затем
(а)
пг/мл 1200
1000
800
600
400
200
0
I
X
I
II I II I II
(б)
пг/мл 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Т
0
I
II I II I
II
□ Больные РС, обострение (n = 14) ■ Больные РС, ремиссия (n = 29) □ Контроль (n = 20) Рис. 1. Продукция ИЛ-17 (а) и ИФН-у (б) МНКПК у больных РС и здоровых доноров in vitro. I — спонтанная продукция, II — продукция, стимулированная amB-CD3- и анти-CD28-антиreлами. Здесь и на рис. 2: горизонтальная линия в боксе — значение медианы, нижняя и верхняя границы бокса — 25-й и 75-й процентили, вертикальные линии — диапазон значений. * p < 0,05, ** p < 0,01.
МНКПК в количестве 8 х 104 в 200 мкл на лунку вносили в 96-луночный круглодон-ный планшет и стимулировали магнитными частицами, покрытыми анти-СБ3- и анти-CD28-антителами (Life Technologies, Норвегия). Образцы инкубировали 72 ч в CO2-инкубаторе, после чего отбирали суперна-тант и замораживали при —70°С. Для оценки влияния серотонина на функциональную активность T-хелперов 1-го и 17-го типов часть образцов МНКПК стимулировали в присутствии серотонина (Sigma, США) в конечных концентрациях 10-4, 10-5 и 10-6 М.
Иммуноферментный анализ
Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и ИФН-у в супернатан-тах клеточной культуры, а также содержание серотонина в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы eBioscience (США), серотонина — фирмы IBL (Австрия). Уровни всех аналитов выражали в пг/мл.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы
Prizm 6. Для оценки различий между двумя независимыми группами применяли и-критерий Манна—Уитни. Статистически значимыми различия считались при р < 0,05.
Результаты
По клиническим и демографическим характеристикам больные РС, находящиеся в стадии обострения и в стадии ремиссии, не различались, хотя степень тяжести РС по шкале EDSS была несколько выше у больных, находящихся в стадии обострения (см. табл. 1).
Согласно результатам ИФА, у больных РС в стадии обострения продукция ИЛ-17 и ИФН-у стимулированными МНКПК была достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии и у здоровых доноров (рис. 1). Содержание серотонина в сыворотке крови было сопоставимым во всех группах (табл. 2). Внесение серотонина в конечной концентрации 10-4 М оказало достоверный ингибирующий эффект на продукцию ИЛ-17, в то время как на продукцию ИФН-у не повлияло (рис. 2). Внесение серотонина в конечных концентрациях 10-5
Г-
*
**
Результаты исследований
(а)
пг/мл 1200 г Г
1000
800
600
400
200
0
Ц
I II I II I
□ Больные РС, обострение (n = 14)
II
(б)
пг/мл 4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
I
II
I
I Больные РС, ремиссия (n = 20)
II I II
□ Контроль (n = 15)
Рис. 2. Влияние серотонина (5-НТ) на продукцию ИЛ-17 (а) и ИФН-у (б) МНКПК у больных РС и здоровых доноров in vitro. I — в отсутствие 5-НТ, II — в присутствии 5-НТ в конечной концентрации 10-4 М. *** p > 0,05.
и 10 6 М не оказало какого-либо эффекта на продукцию цитокинов.
Заключение
В исследованиях последних лет установлено, что T-хелперам 1-го и 17-го типов принадлежит одна из ключевых ролей в патогенезе РС [4, 9, 16]. Полученные нами данные также подтверждают критическую патогенетическую роль T-хелперов 1-го и 17-го типов при РС.
При изучении уровня серотонина в сыворотке крови мы не обнаружили достоверных различий у больных РС и здоровых доноров (см. табл. 2). В то же время по результатам, полученным in vitro, было выявлено инги-бирующее влияние серотонина на продукцию ИЛ-17 стимулированными МНКПК (см. рис. 2), что указывает на противовоспалительный эффект серотонина при РС. Схожие результаты были получены T.H. Yang
Таблица 2. Концентрация серотонина в сыворотке крови у больных РС и здоровых доноров по данным ИФА
et al.: обработка спленоцитов серотонином при коллагениндуцированном артрите (экспериментальная модель ревматоидного артрита) приводила к уменьшению количества Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-17 и ИФН-у, а также к подавлению продукции ИЛ-6, ИЛ-17 и ИФН-у in vitro [18]. Еще в одном исследовании было установлено, что применение арилпиперазина, обладающего высоким сродством к 5-НТ1а-рецепторам, снижает экспрессию генов, кодирующих провоспалительные цитокины ИЛ-6, ИЛ-17 и ИФН-у при ЭАЭ [14].
Влияние серотонина на клетки иммунной системы опосредовано серотониновы-ми рецепторами (5-HT). Существует 7 типов серотониновых рецепторов (5-HTt—5-HT7). 5-HTj- и 5-НТ5-рецепторы подавляют аде-нилатциклазу и снижают уровень внутриклеточного циклического аденозинмо-нофосфата. 5-HT2, 5-HT4, 5-HT6 и 5-HT7, напротив, стимулируют аденилатциклазу
;
■Г
**
Показатель Больные РС Контрольная группа (n = 20)
обострение (n = 14) ремиссия (n = 29)
Серотонин, пг/мл 19,5 (13,8; 27,5) 15,5 (12,8; 16,0) 14,5 (11,8; 23,0)
и повышают уровень циклического адено-зинмонофосфата [2]. По данным одних авторов, влияние серотонина на Т-хелперы опосредовано 5-НТ1-рецепторами, по данным других — 5-HT2- и 5-НТ7-рецепторами [3, 7, 8]. Какими именно рецепторами опосредуется влияние серотонина на Т-хелперы 17-го типа при РС, предстоит уточнить.
В целом данные литературы, а также полученные нами результаты in vitro позво-
ляют предположить противовоспалительный эффект серотонина при РС, который может быть связан с ингибирующим действием на Т-хелперы 17-го типа. В то же время механизмы этого влияния нуждаются в дальнейшем изучении.
С библиографией вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Serotonin as a Regulator of Nervous and Immune System Interaction in Patients with Multiple Sclerosis M.V. Melnikov, M.V. Paschenkov, and A.N. Boiko
43 patients with remittent multiple sclerosis underwent complete neurological and immunological examination. All patients were examined using Expanded Disability Status Scale. Serotonin serum concentration was measured using enzyme immunoassay. Functional activity of Th1 and Th17 was assessed in accordance with IFNy and IL-17 production by peripheral blood mononuclear cells. The study showed that cytokine production was significantly higher in patients with exacerbation of multiple sclerosis as in patients with remission or health volunteers. Serotonin level was comparable in all groups. Serotonin at final concentration 10-4 M inhibited IL-17 production. Key words: multiple sclerosis, serotonin, Th17, IL-17.
Конфликт интересов. Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Книги издательства "Атмосфера"
Ультразвуко вая диагностика
Ультразвуковая диагностика в неонатологии и педиатрии: дифференциально-диагностические критерии: Практическое руководство / Под ред. И.В. Дворяковского, Г.М. Дворяковской. 3-е изд., перераб. и доп.
В новом, переработанном и дополненном издании популярного практического руководства раскрываются широкие возможности ультразвукового исследования отдельных органов и систем у здоровых детей и у детей с различной патологией. Структура издания способствует точной оценке эхографического изображения органа и установлению признаков патологии. В каждой главе сначала перечисляются эхографические признаки, характерные для той или иной патологии, а затем эти признаки систематизируются по виду патологии. На компакт-диске, сопровождающем руководство, представлены иллюстрации, отражающие наиболее сложные диагностические случаи. 192 с. + CD-ROM (170 ил.). Для врачей ультразвуковой диагностики, педиатров, неонатологов.
Приобрести любую книгу, журнал или диск издательства "Атмосфера" можно на сайте atm-press.ru или по тел. (495) 730 63 51
