CC BY
36
Биология
Вестник Нижегор одского университета им. Н.И. Лобачевского, 2007, № 1, с. 119-12 1
УДК 581.1
РОЛЬ ЯЕБОХ-СТАТУСА В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНЗАВИСИМЫХ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ ХЛОРОПЛАСТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННОГО Н2О2
© 2007 г. А.П. Веселов, Л.Н. Курганова, И.В. Балалаева
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского veselov@bio.unn.ru
Поступила в редакцию 22.12.2006
Исследовано влияние экзогенного 1 и 10 мМ Н2О2 на активность глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы изолированных хлоропластов гороха. Н2О2 в выбранных концентрациях не приводит к накоплению продуктов липопероксидации, но активно модулирует работу глутатионзависимых антиоксидантных ферментов, что может быть опосредовано происходящим при этом изменением ге^х-статуса хлоропластов.
Пероксид водорода, наряду с другими активными кислородсодержащими молекулами, рассматривается в качестве одного из первичных индукторов стресс-реакции растительной клетки, а также играет определенную роль в работе сигнал-трансдукционных систем ojtaszek, 1997; Тарчевский, 2002). При этом Н2О2 участвует не только в передаче внешнего сигнала в ядро и модификации транскрипционных процессов, но и, в первую очередь, обеспечивает координацию отдельных клеточных компартментов в целостном ответе клетки (Corpas et а1., 2001).
В работе исследовано влияние пероксида водорода (1 и 10 мМ), экзогенно вносимого в суспензию изолированных хлоропластов гороха, на активность глутатионзависимых пластидных ферментов антиоксидантной защиты - глутатионредуктазы (ГР) и глутатионтрансферазы (ГТ). Работу ГР определяли по убыли НАДФН в реакции
восстановления окисленного глутатиона (Iavata, Tanaka, 1977), ГТ - по скорости образования конъюгата глутатиона и 1-хлор-2,4-
динитробензола (Habig et al., 1974). Степень окислительного воздействия оценивали по содержанию продуктов липопероксидации -диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), а также по соотношению окисленной (GSSG) и восстановленной (GSH) форм глутатиона по методикам, описанным в работе Л.Н. Кургановой и др. (1999). Выбранная экспериментальная система позволяет исключить влияние дифференциальной экспрессии ядерных генов и, соответственно, выявить возможность посттрансляционной регуляции активности данных ферментов. Кроме того, такая система, будучи максимально приближенной к условиям in vivo, включает возможные промежуточные звенья в системе «Н2О2 ® фермент» и наиболее полно отражает реальные процессы в целостной растительной
Время, мин
Рис. 1. Динамика активности ГР в хлоропластах при их обработке 1 мМ (а) и 10 мМ (б) экзогенным Н2О2
:40
1Э0 І 4
■ б J
g 120
& Ё § 11* X X
н о , ' і
3 Ё а юс- о а с 7 -г 1-Л ! I г__ ■ Г а *■
№ ■
ад ■ ■
а ■££ 10 +5 ео
Время, мин
Рис. 2. Динамика активности ГТ в хлоропластах при их обработке 1 мМ (а) и 10 мМ (б) экзогенным Н2О2
клетке.
В ходе исследований показано, что разовое введение в суспензию хлоропластов экзогенного Н2О2 приводило к изменению активности обоих изучавшихся
глутатионзависимых ферментов. Активность ГР снижалась до 70-80% от начального уровня, при этом в случае меньшей концентрации
диеновых конъюгатов, ни накопления малонового диальдегида, являющегося маркером развития деструктивных процессов в липидной компоненте мембран (см. табл.). В то же время введение в суспензию Н2О2 приводило к значительному увеличению соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона (в 2 раза при обработке 1 мМ Н2О2 и
Содержание ДК и МДА в хлопластах при их обработке 1 мМ и 10 мМ экзогенным Н2О2
Таблица
Время после внесения Н2О2, мин Содержание ДК, % от контроля Содержание МДА, % от контроля
1 мМ Н2О2 10 мМ Н2О2 1 мМ Н2О2 10 мМ Н2О2
0 100,0 + 4,2 100,0 + 4,1 100,0 + 3,7 100,0 + 6,9
5 91,5 + 8,0 97,7 + 5,4 102,9 + 5,7 107,5 + 7,1
10 96,4 + 5,2 86,3 + 3,8 111,3 + 4,7 98,0 + 4,4
15 101,0 + 10,0 91,1 + 3,6 110,7 + 6,4 114,8 + 8,5
30 108,2 + 6,6 95,2 + 4,9 113,5 + 5,4 115,8 + 7,1
60 97,5 + 4,7 83,1 + 5,7 93,5 + 12,2 101,5 + 7,9
Примечание. Различия между всеми сравниваемыми вариантами недостоверны (р > 0,05)
снижение отмечали через 15 минут после внесения пероксида, а в случае большей -только при экспозиции свыше 30 минут (рис. 1).
В отличие от ГР, для другого глутатионзависимого фермента -
глутатионтрансферазы - отмечено временное повышение активности до 120% от исходного уровня через 10 минут после внесения в суспензию пероксида (рис. 2). Обработка 10 мМ Н2О2 приводила и к повторному росту активности фермента к 60 минуте экспозиции. К настоящему времени считается доказанной возможность активации транскрипции генов ряда изоформ ГТ пероксидом водорода (Marrs, 1996; Edwards et al., 2000). Тем не менее, выбранная нами экспериментальная система (изолированные хлоропласты) предполагает наличие других регуляторных механизмов.
В качестве возможных путей опосредования регуляторного влияния экзогенного Н2О2 на работу антиоксидантных ферментов были проанализированы накопление продуктов липопероксидации и изменение redox-статуса хлоропластов. В проводившихся опытах при обеих использовавшихся концентрациях пероксида не отмечали ни изменения уровня первичных продуктов липопероксидации -
в 3 раза - при 10 мМ Н2О2) (рис. 3). Глутатион играет роль окислительно-восстановительного буфера, и отношение его окисленной и восстановленной форм (показатель GSSG/GSH) отражает изменения redox-статуса хлоропластов в результате обработки пероксидом водорода (Foyer et al., 2001).
Сопоставление динамики активности ГР и показателя GSSG/GSH свидетельствует, что ингибирование ГР согласуется с повышением степени окисленности пула глутатиона. Снижение активности фермента с некоторой временной задержкой следует за ростом
GSSG/GSH
0,35
0,3 0,25 0,2 0,15
0,1
0,05
0 6 10 1S
0 5 10 15
30
30
60
Время, мин
Рис. 3
форм глутатиона в хлоропластах при их обработке 1 мМ (темные столбцы) и 10 мМ (светлые столбцы)
0
показателя GSSG/GSH, за исключением 5минутного пика индекса GSSG/GSH в случае 10 мМ Н2О2. Данный эффект может являться следствием дефицита при изменении redox-статуса пластид восстановленной формы НАДФН, являющегося коферментом ГР (De Vos et al., 1994; May et al., 1998). Сопоставление временных характеристик быстрого роста показателя GSSG/GSH и активации ГТ также допускает возможность существования redox-регуляции данного фермента на посттрансляционном уровне и, соответственно, участия ГТ в поддержании redox-статуса пластид.
Таким образом, пероксид водорода в концентрации 1 и 10 мМ не оказывает деструктивного окислительного действия на мембраны изолированных хлоропластов и в то же время активно модулирует работу пластидных глутатионзависимых
антиоксидантных ферментов -
глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы. При этом регуляция активности ферментов Н2О2 в отсутствие накопления продуктов липопероксидации может быть опосредована изменением redox-статуса хлоропластов в условиях окислительного стресса.
Список литературы
1. Курганова Л.Н., Веселов А. П., Синицына Ю.В., Еликова Е.А. Продукты перекисного окисления липидов как возможные посредники между воздействием повышенной температуры и развитием стресс-реакции у растений // Физиол. раст. 1999. Т. 46, № 2. С. 218-222.
2. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. М.: Наука, 2002. 294 с.
3. Corpas F.J., Barroso J.B., del Rio L.A. Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells // Tr. Plant Sci. 2001. V. 8, № 4. P. 145-150.
4. De Vos C.H.R., Kraak L.H., Bino R.J. Ageing of tomato seeds involves glutathione oxidation // Physiol. Plant. 1994. V. 92. P. 131-139.
5. Edwards R., Dixon D. P., Walbot V. Plant
glutathione S-transferases: enzymes with multiple
functions in sickness and in health // Tr. Plant Sci. 2000. V. 3, № 6. P. 193-198.
6. Foyer C.H., Theodoulou F.L., Delrot S. The functions of inter- and intracellular glutathione transport systems in plants // Tr. Plant Sci. 2001. V. 6, № 10. P. 486-492.
7. Habig W.H., Pabst M.V., Jacobi W.B. Glutathione S-transferases // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 71307135.
8. Iavata J., Tanaka U. Glutathionereductases «positive» spectro-photometre assays // Colled. Cresh. Chem. Commun. 1977. V. 42, № 3. P. 1086-1089.
9. Marrs K.A. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 127-158.
10. May M.J., Vernoux T., Leaver C., van Montagu M. V., Inze D. Glutathione gomeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 649-667.
11. Wojtaszek P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection // Biochem. J. 1997. V. 322. P. 681-692.
ROLE OF THE REDOX STATUS IN THE REGULATION OF ACTIVITY OF GLUTATHIONE-DEPENDENT ANTIOXIDANT CHLOROPLAST ENZYMES UNDER
THE ACTION OF EXOGENOUS Н2О2
A.P. Veselov, L.N. Kurganova, I. V. Balalaeva
We study the effect of exogenous 1- and 10-mM H202 on the activity of glutathione reductase and glutathione transferase of isolated pea chloroplasts. H202 with selected concentrations does not lead to the accumulation of the lipoperoxidation products, but actively modulates the operation of glutathione-dependent antioxidant enzymes. This can be mediated by the accompanying change of the redox status of the chloroplasts.
