CC BY
172
Роль протеолитических ферментов
при заболеваниях суставов и флуоресцентные
методы определения их активности
Иванова С.В.
Витебский государственный медицинский университет, Беларусь
Ivanova S.V.
Vitebsk State Medical University, Belarus
Role of proteolytic enzymes at joints diseases and fluorescent methods of definition of their activity
Резюме. Учитывая, что нарушения функционирования протеолитического звена играют важную роль при заболеваниях суставов, а методы определения протеолитической активности устарели, необходимы более современные подходы к раскрытию закономерностей регуляции протеолиза на молекулярном и клеточном уровне. Преимущества флуоресцентных методов - информативность, чувствительность, быстрота, экономичность - соответствуют всем требованиям, предъявляемым к современным методам диагностики. Малочисленность флуоресцентных исследований фермент-субстратных взаимодействий и их кинетики вызывает необходимость дополнительного исследования и применения этого метода для изучения протеолитического процесса. Установление взаимосвязи между протеолитической активностью и флуоресцентными показателями сыворотки крови и синовиальной жидкости может быть использовано для оценки протеолитической составляющей при заболеваниях суставов и разработки новых экономичных лабораторных диагностических тестов. Ключевые слова: протеолитическая активность, заболевания суставов, флуоресценция.
Медицинские новости. — 2015. — №9. — С. 20-22. Summary. Considering that functioning infringements of proteolytic link play an important role at joints diseases, аnd methods of definition of proteases activity have become outdated, modern approaches to disclosing of laws of proteolysis regulation at molecular and cellular level are necessary. Advantages of fluorescent methods - sensitivity, speed, cost-affectivity - correspond to all requirements shown to modern methods of diagnostics. Small number of fluorescent researches enzyme-substrate of interactions and them kinetic cause of additional research and application of this method for studying of proteolytic process. Establishment of interrelation between parameters of proteases activity and fluorescence of blood serum and synovial fluid can be used for estimation of proteolytic component at joints diseases and working out of new economic diagnostic laboratory tests. Keywords: proteases activity, joints diseases, fluorescence. Meditsinskie novosti. - 2015. - N9. - P. 20-22.
Протеиназы играют ключевую роль во многих процессах жизнедеятельности и вовлечены в различные патологические процессы, что делает их важным звеном в механизме биологического контроля функций органов и тканей [17, 30, 34, 35]. Важнейшими факторами, регулирующими активность протеолитических ферментов, являются их эндогенные ингибиторы. Конечный эффект действия протеолитической системы зависит от соотношения протеиназ и их ингибиторов. Протеолитические ферменты и ингибиторы при заболеваниях суставов
В число важных патогенетических особенностей ревматоидного воспалительно-деструктивного процесса входят неконтролируемая активация протеолиза на фоне угнетения его естественных ингибиторов, высвобождение биологически активных веществ из активированных клеточных элементов, выраженные иммунологические нарушения с накоплением продуктов расщепления пластического материала [14, 21, 22, 32, 37, 44, 47, 52, 54]. Протеолитические ферменты, их действие на биологические субстраты
составляют основу биохимического механизма повреждения соединительной ткани при ревматических заболеваниях и рассматриваются как ключевые участники суставного разрушения [21, 32, 37]. При артритах в крови и синовиальной жидкости активируются металлопротеиназы (ММП-3, -8, -9, коллагеназы-1, -3), сери-новые (трипсин, химотрипсин, эластаза), цистеиновые (катепсины В, L, К) и др. [23, 25, 26, 32, 37, 44, 47, 52]. Семейство металлопротеиназ рассматривается в качестве основных ферментов системы протеолиза, участвующих в процессе воспаления при артритах [25, 26, 32, 43, 44, 47, 52]. Важная роль в деструктивных процессах при ревматических заболеваниях принадлежит также группе сериновых протеиназ - эластазе (ее повышенный уровень при ревматических заболеваниях приводит к разрушению матрикса хряща и других суставных тканей), трипсину, хи-мотрипсину, калликреину [5, 31, 32, 41, 53]. Трипсин, химотрипсин и калликреин имеют оптимальную активность при физиологических значениях рН и оказывают свое действие на белки крови, соединительную ткань, мембраны других клеток [1, 5, 21,
32, 36]. Ряд авторов считают, что повышение уровня трипсина активирует калликре-ин-кининовую систему [36], способствует превращению накапливающейся при суставном воспалении проколлагеназы в активную форму и тем самым косвенно отвечает за деградацию коллагеновых фибрилл соединительной ткани [32, 45, 50]. Однако диагностическая значимость трипсина и трипсиноподобных протеиназ при заболеваниях суставов до сих пор не установлена.
Регулирующее влияние на степень протеолитической активности при артритах оказывает уровень ингибиторов протеолитических ферментов. Одними из основных ингибиторов протеиназ, расщепляющих элементы хрящевой ткани, являются а2-макроглобулин (а2-МГ) и а1-антипротеазный ингибитор (АПИ). Ингибиторы сериновых протеиназ в сыворотке крови и в синовиальной жидкости выполняют двойственную роль, прямо блокируя функционирование сериновых протеиназ и косвенно уменьшая активность металлопротеиназ, которые активируются сериновыми протеиназами [32,
33, 51]. При ревматических заболеваниях
наблюдалось статистически достоверное повышение уровня сывороточного АПИ, которое нарастало соответственно активности ревматоидного процесса, достигая максимума при третьей степени [21]. Особое внимание при исследовании воспалительных реакций и артритов уделялось макроглобулинам, в том числе и а2-МГ которые не только конкурируют за связывание с протеиназами, но и могут взаимодействовать между собой, а комплекс а2-МГ - протеиназа способствует эндоцитозу различных веществ [8]. До сих пор нет единого мнения об изменениях в содержании а2-МГ в крови при заболеваниях суставов. В одних исследованиях не было выявлено достоверных различий в содержании АПИ и а2-МГ в сыворотке крови, комплексов АПИ-1дА в синовиальной жидкости при реактивном, ревматоидном артритах и системной красной волчанке и связи уровня а2-МГ с воспалительной активностью [9, 10, 24]. Отсутствие значимых изменений в общей концентрации а2-МГ объяснялось повреждением молекулы а2-МГ и усиленным образованием комплексов а2-МГ - В исследовании З. Коларова и соавт. [13] также не было выявлено статистически достоверной разницы в уровне а2-МГ между группами пациентов с ревматоидным артритом, остеоартрозом и донорами. Однако другие авторы обнаружили высоко достоверное снижение концентрации а2-МГ в сыворотке крови у пациентов с забо2 ле-ваниями суставов, особенно выраженное при ревматоидном артрите [22].
Синовиальная жидкость - одна из наиболее важных биологических жидкостей организма, она реагирует на малейшие нарушения функции сустава изменением своего состава, что является важнейшим диагностическим тестом при артрологических заболеваниях. Поскольку синовиальная жидкость является транссудатом крови, то и по своему составу (в том числе и ферментному) синовиальная жидкость в значительной степени сходна с плазмой крови [16, 23, 27, 29]. В норме уровень а2-МГ в синовиальной жидкости составляет менее 5% от сывороточного, а соотношение синовиальная жидкость/ кровь - 0,03-0,04. Уровень АПИ в синовиальной жидкости для здоровых людей составляет 20-25% от сывороточного, а соотношение синовиальная жидкость/ кровь - 0,2-0,25 [18]. При артритах концентрация протеолитических ферментов и их ингибиторов в синовиальной жидкости увеличивалась и играла решающую роль в развитии заболевания [21, 38. 43]. Согласно исследованию О.В. Синяченко [23],
показатели ферментативной активности в синовиальной жидкости пациентов с артритами возрастали при повышении степени тяжести синовита (сравнивались остеоартроз, ревматоидный артрит, подагрический артрит и анкилозирующий спондилоартрит). В то же время концентрация а2-МГ снижалась с нарастанием степени активности и стадии заболевания и была наиболее низкой при ревматоидном артрите. Соотношение синовиальная жидкость/кровь при ревматоидном артрите для АПИ и а2-МГ возрастало - до 0,7 для АПИ и до 0,36-0,45 для а2-МГ [21]. Аналогичные результаты были п2олучены и в исследовании [13]: уровень а2-МГ в сыворотке крови больных ревматоидным артритом был выше, чем в синовиальной жидкости, а соотношение синовиальная жидкость/кровь (0,6) было значительно выше нормального. Увеличение соотношения синовиальная жидкость/сыворотка крови для АПИ и а2-МГ свидетельствует об усиленном проник2новении ингибиторов в синовиальную жидкость при ревматоидном артрите.
Собственная флуоресценция и ее применение для исследования белков и протеолитической активности Исходя из значимости протеолити-ческой системы в развитии заболеваний суставов, важно иметь надлежащие методические подходы к определению показателей протеолиза. Методы определения активности протеиназ можно разделить на две группы: биохимические и иммунологические. Недостатком иммунологических методов является то, что они определяют количество ферментов и ингибиторов без учета их функциональной активности, и эти методы дорогостоящие. Большинство биохимических методов основано на использовании белковых, низкомолекулярных, флуорогенных и радиоактивных субстратов, протеолитическую активность определяют также с помощью титрования активных центров [15]. Недостатком этих методов является то, что они требуют большого объема исследуемого материала и реактивов. Кроме того, эти исследования многоэтапны, что значительно удлиняет время определения и увеличивает вероятность ошибок. Одними из наиболее чувствительных методов определения активности протеиназ считаются флуори-метрические, использующие белковые или синтетические субстраты, меченные флуо-ресцеин-изотиоционатом (ФИТЦ) или другим флуорогенным реагентом. S.S. Twining [55] использовал ФИТЦ-меченый казеин, H. Maeda [42] - флуорескамин изотиоциа-
нат, P.W. Spenser et al. [49] определяли активность а-химотрипсина, трипсина, пепсина и бромелаина, связывая флуорофор 1-анилино-8-нафталенсульфонат (АНС) с белковыми субстратами (казеином, альбумином и др.). Особую группу представляют красители - ингибиторы, эффективно связывающиеся с протеолитическими ферментами. Представители этих ингиби-торов-флуорофоров - профлавин, тионин (ингибиторы трипсина, химотрипсина), акрифлавин (ингибирование пепсина), родамин G6 (ингибирование химотрипсина), этидиум бромид (ингибирование холин-эстеразы) [1, 6]. Однако флуоресцентно-меченые субстраты протеолитических ферментов достаточно дорогие, поэтому эти методы до сих пор не нашли широкого применения.
Для детального изучения протео-литических процессов в организме представляет интерес исследование флуоресценции взаимодействующих при протеолизе белков либо непосредственно в ходе ферментативной реакции, либо в условиях, максимально приближенных к физиологическим. Позволяет решить эту задачу изучение флуоресцентных свойств самих объектов исследования - белков, с использованием ароматических аминокислотных остатков (в основном триптофано-вых) в качестве естественных репортерных групп. Исследования взаимодействий белков с различными веществами на основании их собственной флуоресценции проводились многими авторами [19, 40, 56]. Особое место занимают исследования собственной флуоресценции альбумина, поскольку, помимо транспортной функции, альбумин осуществляет катализ нескольких типов химических превращений, являясь функциональным аналогом некоторых гидролаз, лиаз, изо-мераз и тиол-пероксидаз [39, 57]. Кроме того, альбумин является субстратом для протеиназ, а также и регулятором активности, обычно ингибитором, действующим по смешанному типу [7, 48]. Помимо альбумина, в число наиболее изученных с помощью флуоресцентного метода белков входит трипсин - представитель сериновых протеиназ [20]. Поскольку альбумин является одним из основных белков крови, а трипсин - типичным представителем сериновых протеиназ, играющим значительную роль в патогенезе воспаления, то изучение взаимодействия этих белков имеет большое значение для исследования протеолитических процессов в сыворотке крови и в организме в целом. Протеолитический гидролиз белков сопровождается существенными пере-
№ 9•2015
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
стройками их молекул, что, несомненно, должно отразиться на флуоресценции хромофорных аминокислотных остатков реагирующих веществ. Исследование реакции ферментативного расщепления трипсином альбумина проводилось в работе [46]. Уже через 10 минут после начала протеолитической реакции различные расщепленные фрагменты содержали триптофан, тирозин и фенилаланин. Причем фрагмент, содержащий триптофан, не имел в своем составе ни тирозиновых, ни фенилаланиновых остатков [46]. Наши исследования показали, что протеолитиче-ское расщепление сывороточного альбумина человека трипсином сопровождается снижением интенсивности флуоресценции компонентов реакции [11, 12]. Выявленные корреляционные взаимосвязи между про-теолитической активностью и интенсивностью флуоресценции позволили судить о том, что интенсивность флуоресценции является параметром, достоверно отражающим активность протеолитическо-го распада. Некоторые исследования ферментативных процессов с помощью измерения собственной флуоресценции белков были предприняты в 1960-1970 гг. и ранее. Было установлено, что образование фермент-субстратного комплекса сопровождалось уменьшением интенсивности флуоресценции триптофанилов, а кинетические кривые отражали многостадийный характер ферментативной реакции [4, 28]. Однако подобные исследования были малочисленны и проведены с использованием соответствующего времени оборудования.
Таким образом, унифицированных современных методик для исследования протеолитической активности в настоящее время нет. Отсутствие единообразия в предлагаемых методах определения активности протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и других биологических жидкостях (различные субстраты, их концентрации, реактивы с различной степенью активности, разные буферные растворы и т. д.) затрудняет их использование в клинике. Несмотря на то что некоторые методики модифицируются [2, 3], до сих
пор исследование протеолитической и ингибиторной активности основывается на устаревших методах. Учитывая, что нарушения функционирования протеоли-тической системы являются ключевыми при заболеваниях суставов, очевидна необходимость более детального исследования взаимосвязи протеолитических процессов и флуоресценции с целью разработки новых методов, расширяющих возможности биохимического анализа и ранней диагностики суставной патологии.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Антонов В.К. Химия протеолиза. - М.: Наука, 1991. - 504 с.
2. Бондаренко А.Н. // Клин. лабор. диагностика. -
2004. - №5. - С.11-15.
3. Бондаренко А.Н. // Клин. лабор. диагностика. -
2005. - №5. - С.10-14.
4. Бурштейн ЭА, Суслова Т.Б. // Биофизика. -1964. - №9. - С.48-54.
5. Веремеенко К.Н. [и др.] Протеолиз в норме и при патологии. - Киев: Здоровья, 1988. - 200 с.
6. айнулинаЭ.Т. [и др.] // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2006. - Т.142, №11. - С. 591-593.
7. рызунов Ю.А. [и др.] // Анестезиол. и реанима-тол. - 2004. - №6. - С. 68-74.
8. Зорин Н.А., Зорина В.Н., Зорина Р.М. // Биомед. хим. - 2011. - №1. - С.106-113.
9. Зорина В.Н. [и др.] // Науч. практ. ревматол. -
2006. - № 1. - С.22-27.
10. Зорина В.Н. [и др.] // Клин. медицина. - 2008. -№6. - С.58-61.
11. Иванова С.В,, Кирпиченок ЛН // Весц НАН Беларусг Сер. йял. навук. - 2009. - N»4. - С.82-88.
12. Иванова С.В,, Кирпиченок Л.Н. // Новости мед.-биол. наук. - 2012. - Т.6, №3. - С.61-68.
13. Коларов З. [и др.] // Терапевт. архив. - 2000. -№5. - С.17-19.
14. Корякина Е.В., Белова С.В. // Науч.-практ. ревматология. - 2001. - №1. - С.1-7.
15. Косинец А.Н,, Кирпиченок Л.Н. Протеиназы и их ингибиторы в гнойной хирургии и онкологии. - Витебск: ВГМУ 2003. - 409 с.
16. Матвеева Е.Л,, асанова А.Г,, Спиркина ЕС. // Клин. лабор. диагностика. - 2012. - №4. - С.14-16.
17. Никандров В.Н, Пыжова Н.С. // Известия НАН Беларуси. Сер. мед. Наук. - 2008. - №1. - С.4-22.
18. Павлова В.Н. [и др.]. Хрящ. - М: Медицина, 1988. - 320 с.
19. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. - М.: Наука, 2003. - 189 с.
20. Решетняк Я.К., Бурштейн Э.А. // Биофизика. -1997. - Т.42, - Вып.4. - С.785-795.
21. Руденко В.Г., Руденко Ю.В. // Ревматология. -1990. - №4. - С.42-50.
22. Руденко В.Г., Левицкий А.П. // Врачеб. дело. -1986. - №12. - С.32-35.
23. Синяченко О.В. // Украин. ревматол. журн. -2008. - №2 (32). - С.30-39.
24. Трофименко Н.А. [и др.] // Бюл. сибир. медицины. - 2004.- №4.- С.21- 25.
25. Турна А.А. // Науч. практ. ревматол. - 2010. -№3. - С.59-64.
26. Турна АА [и др.] // Вестник РГМУ. - 2009. -№2. - С.16-18.
27. Цветкова Е.А. // Биофизика. - 2005. - Т.50. -Вып. 2. - С.341-347.
28. Черницкий Е.А. [и др.] // Биофизика. - 1968. -Т.13. - Вып. 4. - С.581-586.
29. Чернякова Ю.М., Сементовская Е.А. // Мед. новости. - 2005. - №2. - С.9-14.
30. Яровая Г.А. // Вопр. мед. химии. - 2001. - Т.47, №1. - С.20-39.
31. BazzichiL. [et al.] // Clin. Exp. Rheumatol. - 2002. -Vol.20, N6. - P.761-766.
32. Firestein G.S. Etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis // Kell's Textbook of Rheumatology / S . Rubby [et al.] - Philadelphia: WB Sounders, 2001. -Part 9. - P.921-966.
33. Firestein G.S. // N. Engl. J. Med. - 2006. - Vol.354, N1. - P.80-82.
34. Han N. [et al.] // Oncol. Lett. - 2011. - Vol.2, N4. -P.599-608.
35. Hansen K.K. [et al.] // Biol. Chem. - 2008. -Vol.389, N8. - P.971-982.
36. Hollenberg M.D. [et al.] // Biol. Chem. - 2008. -Vol.389, N6. - P.643-651.
37. Kaneko M. [et al.] // Rheumatology. - 2001. -Vol.40, N3. - P.247-255.
38. Kilani RT [et al.] // J. Rheumatol. - 2007. - Vol.34, N8. - P.1650-1657.
39. Kagh-Hansen U, Chuang Vcctor TG, OtagiriM. // Biol. Pharm. Bull. - 2002. - Vol.25. - P.695-704.
40. Lakowiczt J.R. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Protein Fluorescence. - New York: Kluwer Academic Publishers, 2002. - 310 p.
41. Liu M. [et al.] // Arthritis Reum. - 2004. - Vol.50, N10. - P.3112-3117.
42. Maeda H. // Anal. Biochem. - 1979. - Vol.92. -P.222-227.
43. MahmoudR.K. [et al.] // Ital. J. Biochem. - 2005. -Vol.54, N4. - P.248-257.
44. Martel-Pelletier J. [et al.] // Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. - 2001. - Vol.15, N5. - P.805-829.
45. Moilanen M. [et al.] // Biochemistry. - 2003. - Vol.42, N18. - P.5414-5420.
46. Morisaka H. [et al.] // Bioscim. Biotechnol. Biochem. -2006. - Vol.70, N9. - P.2154-2159.
47. Murphy G. [et al.] // Arthritis Res. - 2002. - Vol.4, N3. - P.39-49.
48. Raymond WW [et al.] // J. Biol. Chem. - 2003. -Vol.278, N36. - P.34517-34524.
49. Spenser P.W. [et al.] // Anal. Biochem. - 1975. -Vol.64. - P.556-566.
50. Stenman M. [et al.] // Am. J. Pathol. - 2005. -Vol.167, N4. - P.1119—1124.
51. Sweeney S.E., Firestein G.S. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2004. - Vol.36, N3. - P.372-378.
52. Tchetvericov I. [et al.] // Ann. Rheum. Dis. - 2003. -Vol.62, N11. - P.1094-1099.
53. Tremblay G.M. [et al.] // Curr Opin. Investig. Drugs. -2003. - Vol.4, N5. - P.556-565.
54. Turk B. // Nat. Rev. Drug. Discov. - 2006. - Vol.5, N9. - P.785-799.
55. Twining S.S. // Anal. Biochem. - 1984. - Vol.143. -P.30-34.
56. Weljie A.M., VogelH.J. // Protein Eng. - 2000. -Vol.13, N1. - P.59-66.
57. Yang F [et al.] // J. Struct. Biol. - 2007. - Vol.157. -P.348-355.
Поступила 24.06.2015г.
-Журнал «Медицинские новости» в Интернете: www.mednovosti.by
Вы можете получать ЭЛЕКТРОННЫЕ ВЕРСИИ любы* номеров!
а) на сайте www.mednovo5ti.by в разделе «Электронная подписка»;
6} & Интернет-магазине электронных изданий я Киоскер» - www. kiosker.by
