CC BY
15УДК 575.174.015.3:616.831-005.1:616-036.21
Трофимов В.А.
доктор биологических наук, профессор Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва
(г. Саранск, Россия)
Черакшева Д.А.
магистр
Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва
(г. Саранск, Россия)
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНА ACE INS/DEL I>D В ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ И COVID - 19
Аннотация: изучение полиморфизмов гена ACE Alu Ins/Del I>D связана с тем, что ген играет важную роль в генетической предрасположенности к ишемической болезни сердца и др. заболевания. В 2019 году наибольшей проблемой стало заболевание Covid-19. На данный момент есть гипотеза, что ген ACE играет роль в распространение заболевания, что ведет к проблемам с сердечной - сосудистой системой.
Данное исследование показало предрасположенность I/I полиморфизма гена ACE в группе больных с ИИ и Covid-19, а полиморфизм D/D напротив преобладает в группе контроля.
Ключевые слова: ACE Alu Ins/Del I>D, D/D, I/D, II, ишемия, ренин - ангиотензиновая система, Covid -19.
Актуальность
На данный момент ишемический инсульт занимает первое место по смертности. Исследования полиморфизмов гена ACE Alu Ins/Del I>D связана с тем, что ген играет важную роль в генетической предрасположенности
различным заболеваниям. 1/0 полиморфизм в гене АСЕ связан с возникновением ишемического инсульта через его влияние на патогенез атеросклероза и гипертонии.
Белок АСЕ играет важную роль в ренин - ангеотензиновой системе. Было показано, что высокий уровень АПФ ассоциирован с риском развития сосудистого сопротивления и повышенного артериального давления в результате гиперсинтеза Лп§ II (сосудосуживающего агента). Известно также, что Лп§ II является важным регулятором пролиферации, миграции и гипертрофии гладкомышечных клеток сосудов, увеличивая тем самым его ассоциацию с риском возникновения ИБС и ИМ. У молодых людей с высоким кровяным давлением уровень А^ II в плазме крови выше, когда у обоих родителей высокое кровяное давление чем, когда у обоих родителей низкое кровяное давление. Это увеличение связано с более высоким уровнем активности ренина в плазме и концентрацией ангиотензиногена, что позволяет предположить, что генетическая предрасположенность к высокому кровяному давлению может включать нарушения ренин - ангиотензиновой системы. Ряд генов, в том числе кодирующих ренин, ангиотензиноген и ангиотензин I -превращающий фермент (АСЕ), являются возможными кандидатами для объяснения генетической основы высокого кровяного давления. Широко распространен АПФ. Он преобразует А^ I в сосудосуживающий и стимулирующий альдостерон пептид А^ II и инактивирует брадикинин.
Можно ожидать, что оба эффекта приведут к повышению кровяного давления. В клинической практике применяются препараты, которые ингибируют АПФ используются для снижения артериального давления у пациентов с эссенциальной гипертензией. Было показано, что полиморфизм гена вставки / делеции АСЕ влияет на концентрацию АСЕ в сыворотке крови и может влиять на кровяное давление через изменения в А^ II, альдостероне или других вазоактивных веществах. У многих народов носители генотипа 00 имели повышенный уровень АПФ в плазме крови по сравнению с носителями генотипа
II [1], но такой результат проявляется не всегда. Почему это происходит пока не ясно до конца. Полиморфизм гена I/D ACE приводит к повышению уровня ACE, который преобразует Ang I в Ang II, что приводит к повышению уровня Ang II [2].
Несколько исследований продемонстрировали сильную связь между вставкой / делецией ACE (I / D) и COVID-19. Носители ACE - DD имеют более высокие уровни АПФ в крови примерно в два раза по сравнению с лицами ACE - II и связаны с артериальной гипертензией, ОРДС и госпитальной смертностью. Таким образом, делеционный аллель связан с прогрессированием COVID-19 и частотой инфицирования SARS-CoV-2 и смертностью, в то время как генотип ACE - II отрицательно коррелирует с частотой инфицирования и смертностью [3]. Однако метаанализ достоверно ассоциировал соотношение частот аллелей ACE - I /D с увеличением скорости выздоровления, но не со смертностью.
Кроме того, полиморфизмы ACE - I / D могут объяснить клиническое течение COVID-19 среди различных этнических групп населения. Распределение соотношений частот генотипов D/D, I/D и I/I у афроамериканцев (29%, 60% и 11% соответственно), индейцев (19%, 50% и 31% соответственно) и белых (29%, 40%, и 31% соответственно) значительно различались. Частота делеционного аллеля среди афроамериканцев, индейцев и белых (0,59, 0,49 и 0,44 соответственно) также достоверно различалась [4]. Эти результаты могут объяснить различия в сердечно-сосудистых заболеваниях, в частности у афроамериканцев, которые демонстрируют более высокую частоту делеционного аллеля.
РААС в основном отвечает за регулирование артериального давления, объема жидкости и электролитного баланса. Физиологический гомеостаз РААС регулируется балансом ACE и ACE2. ACE преобразует Ang I в Ang II, который оказывает сосудосуживающее, гипоксическое, окислительное, гипертрофическое, фиброзное и воспалительное действие и участвует в развитии различных патологий. ACE2 отвечает за противодействие побочным эффектам
ангиотензина II через его протеолитический продукт, ангиотензин (1-7), который активирует сигнальные пути, которые приводят к расширению сосудов и ингибированию клеточной пролиферации, а также оказывает сильное противовоспалительное, противофиброзирующее и антиоксидантное действие. Поэтому количество этих двух ферментов считается основными эндогенными регуляторами РААС [5].
Несколько наблюдений подтверждают очевидную связь между дисбалансом RAAS и заболеванием COVID-19. Это связано с тем, что ACE2 является основным клеточным рецептором для SARS-CoV-2, и это взаимодействие приводит к истощению и снижению экспрессии ACE2, что приводит к повышению уровня ангиотензина II, что может объяснить вредное повреждение легких, наблюдаемое при инфекции SARS-CoV-2 [6].
Цели исследования: изучение частоты встречаемости полиморфизмов гена ACE у группы здоровых, больных ишемическим инсультом и Covid - 19.
Материалы и методы
Исследуемая популяция
Это исследование, посвященное изучению полиморфизмов гена ACE у группы пациентов с подтвержденным диагнозом ИИ и еще одной группе пациентов с ПЦР - положительной пневмонией SARS-CoV-2, кровь которых была предоставлена факультету биотехнологии и биологию, банку генов, которые хранятся на кафедре генетики и генной инженерии. В общей сложности 105 человек в возрасте старше 18 лет, включая 30 пациентов с SARS-CoV-2, 45 с ИИ и 30 человек в здоровой группе. Эти исследования являются частью бакалаврской и магистерской диссертации.
Анализ экспрессии генов
В среднем 4 мл крови было взято в вакуумные пробирки через антикоагулянты у всех пациентов. Собранную кровь хранили при - 20 °С до фазы выделения ДНК. Процедуру выделения ДНК была выполнена с использованием набора для выделения от компании Синтол (г. Москва) «Экстран - 1». Концентрация и чистота ДНК была определена с помощью прибора Nanodrop ND-2000. И проведено ПЦР исследование в реальном времени с помощью амплификатора QuantStudio 5 (Сингапур) и набора реагентов «SNP-экспресс-SHOT» от комапнии Литех (г. Москва) предназначенная для анализа мутаций (полиморфизмов) в геноме человека. В амплификационной смеси для анализа полиморфизмов содержатся праймеры, необходимые для амплификации участка, содержащего полиморфизм, и два аллель-специфичных гидролизных зонда, содержащих полиморфный сайт. Зонд, содержащий полиморфизм Аллель 1, мечен флуорофором HEX, Аллель 2 - флуорофором FAM. Дискриминация аллеллей осуществляется за счет различной эффективности разрушения Taq-полимеразой полностью и не полностью комплементарного зонда. Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: гомозиголота по Аллелю 1, гетерозигота, гомозигода по Аллелю 2.
Статистический анализ
Для обработки результатов ПЦР анализа гена ACE Alu Ins/Del I>D использовали популяционно - генетический анализ: определили частоту встречаемости аллелей, генотипов и так же рассчитали равновесие по закону Харди - Вайнберга, для установления - сохранено ли генное равновесие в данной популяции по исследованному локусу, или оно нарушено.
Соотношения фактических частот генотипов к теоретически ожидаемым рассчитывали про критерию х2. Статистически значимыми считали значения p = 0,01.
Последним критерием послужило определение отношения шансов (OR).
Для того, чтобы выявить отличия в частотах аллелей и генотипов между контрольной выборкой здоровых доноров, доноров с сердечно - сосудистыми заболеваниями и доноров с SARS-CoV-2, а также для расчета коэффициента отношения шансов (OR - odds ratio) с 95 % интервалом (CI - confidence interval) и p - значения мы воспользовались компьютерной программой, доступной в интернете на сайте http://84.201.145.131/index.php/. Все результаты были представлены в таблице.
Результаты
Целью данного исследования было определить частоту встречаемости аллелей и генотипическое распределение полиморфизма гена ACE в выборке пациентов с ИИ и SARS-CoV-2 по сравнению со здоровыми обследуемыми. Для молекулярно - генетического исследования на наличие полиморфизма ИИ гена ACE были изучены 105 пациентов, среди которых 30 здоровых и 45 с ИБС и 30 с SARS-CoV-2. Определение проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генотипы были определены как DD, II и I/D в соответствии с наличием аллелей D (делеция) и I (вставка). Первоначально выявлен полиморфизм (I/D, rs4646994) гена ACE в 3 выборках - контроль, больные ИИ и больные SARS-CoV-2.
Таблица 1. Частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемых полиморфизмов в группе контроля и группе больных Covid - 19. Так же показатель х2 и OR (отношение шансов)
Генотипы, аллели Covid - 19 Норма X2 OR
n=30 n=30 знач. 95 % CI
I/I 0,400 0,167 18,38 3,33 1,00 - 11,14
I/D 0,500 0,200 4,00 1,27 - 12,58
D/D 0,100 0,633 0,06 0,02 - 0,26
I 0,650 0,267 17,76 5,11 2,34 - 11,14
D 0,350 0,733 0,20 0,09 - 0,43
Результаты ПЦР в реальном времени для проверки наличия полиморфизма гена ACE Alu Ins/Del I>D в образцах периферической крови пациентов обеих групп (контроль и SARS-CoV-2), как показано в таблице и рисунке 1, было обнаружено, что 50 % инфицированных пациентов с SARS-CoV-2 имели полиморфизм I/D, 40 % полиморфизм I/I и 10 % полиморфизм D/D. Контрольная группа показала, что ПЦР образцов крови выявлены полиморфизмы в таком соотношении: I/D - 20 %, I/I - 16,7 % и D/D - 63,3 %.
Сравнение между группой SARS-CoV-2 и контрольной группой в отношении аллельных вариантов гена ACE показало, что аллель I была значительно обнаружена у пациентов с COVID-19 по сравнению с контрольным субъектом (65 % и 26,7 % соответственно), тогда как вариант D был значительно обнаружен у контрольных субъектов по сравнению с пациентами с COVID-19 (73,3 % и 35 % соответственно).
К0ЛТ|ТрП(1ЬИ4Я rpynnj (fc) bn.*w»r^»r fervid
Рис. 1. Диаграмма отображающая распределение частот генотипов в выборках обследуемых
контрольной группы и больных COVГО - 19
■ DO
■ 10 ■ II
80
70 АО 50
30 20 10
■ I
■ I)
Рис. 2. Диаграмма отображающая распределение частот аллелей в выборках обследуемых
контрольной группы и больных COVГО - 19
Теперь рассмотрим выборку пациентов с ишемическим инсультом.
Таблица 2. Частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемых полиморфизмов в группе контроля и группе больных ИИ. Так же показатель х2 и ОЯ (отношение шансов).
Генотипы, аллели ИИ Норма X2 OR
n=45 n=30 знач. 95 % CI
I/I 0,378 0,167 14,46 3,04 0,98 - 9,43
I/D 0,422 0,200 2,92 1,00 - 8,54
D/D 0,200 0,633 0,14 0,05 - 0,41
I 0,589 0,267 15,05 3,94 1,94 - 8,01
D 0,411 0,733 0,25 0,12 - 0,52
Результаты ПЦР в реальном времени для проверки наличия полиморфизма гена ACE Alu Ins/Del I>D в образцах периферической крови пациентов обеих групп (контроль и ИИ), как показано в таблице и рисунке 2, было обнаружено, что 42,2 % инфицированных пациентов с ИБС имели полиморфизм I/D, 37,8 % полиморфизм I/I и 20 % полиморфизм D/D.
Контрольная группа показала, что ПЦР образцов крови выявлены полиморфизмы в таком соотношении: I/D - 20 %, I/I - 16,7 % и D/D - 63,3 %.
Сравнение между группой ИБС и контрольной группой в отношении аллельных вариантов гена ACE показало, что вариант аллели I была значительно обнаружена у пациентов с ИБС по сравнению с контрольными субъектами (58,9% и 26,7 % соответственно), тогда как вариант D был значительно обнаружен у контрольных субъектов по сравнению с пациентами с ИБС (73,3 % и 41,1 % соответственно).
Рис. 3. Диаграмма отображающая распределение частот генотипов в выборках обследуемых
контрольной группы и больных ИИ
Рис. 4. Диаграмма отображающая распределение частот аллелей в выборках обследуемых
контрольной группы и больных ИИ
Обсуждения
Это исследование было проведено, чтобы продемонстрировать связь между полиморфизмами гена ACE, риском инфекции COVID-19 и риском развития ИИ. Было обнаружено, что 50% и 42,2%инфицированных пациентов с SARS-CoV-2 и ИИ имели полиморфизм ACE I / D, 40% и 37,8%имели полиморфизм ACE I / I, 10% и 20% имели полиморфизм ACE D / D. С одной стороны, варианты I / D и I/I был значительно обнаружены у пациентов с COVID-19 и ИИ по сравнению с контрольными субъектами (50% и 40% - Covid-19, 42,2% и 37,8% у ИИ соответственно у контрольной группы 20% и 16,7 %), тогда как вариант D / D был значительно обнаружен у контрольных субъектов по сравнению с пациентами с COVID-19 и ИИ (63,3% - контроль, 10% и 20% -COVID-19 и ИИ, соответственно). Различные мета-анализы подтверждают или опровергают связь между наличием DD - генотипа и развитием той или иной патологии, а наличие II генотипа преимущественно ассоциируется с позитивным прогнозом. Но есть определенное количество исследований типа «случай -контроль», результаты которых подобные полученных нами.
Похожие результаты были получены индийскими учеными для мужчин при исследовании риска возникновения ишемического инсульта среди лиц среднего возраста.
Преобладание II - генотипа в группе больных гипертонией было зафиксировано китайскими учеными для достаточно локализованной популяции тайваньцев. Распределение генотипов для больных АГ имел вид: II - 32 %, ГО -48 %, ВВ - 20 %; II - 18 %, ГО - 54 %, ВВ - 28 % - для контрольной группы.
Пакистанские ученые продемонстрировали статистически достоверную преимущество генотипа II (ОЯ = 6,755; О 3-14,9) [7] при нефротическом синдроме у детей - патологии, которая, по многим литературным источникам, ассоциируется преимущественно с наличием ВЭ-аллели.
Полиморфизм I / Э тесно связан со многими наиболее серьезными и распространенными заболеваниями легких, включая ХОБЛ, легочную гипертензию, астму, острое повреждение легких, рак легких, саркоидоз легких, и недавно было показано, что он влияет на течение заболевания СОУГО-19, а также на восприимчивость к инфекции SARS-CoV-2.
Механизм этого явления остается неясным. Возможно, имеет значение локализованность вышеупомянутых этнических групп, а значит, и меньшее влияние внешнего генетического материала, который «разбавляет» сбалансированный время генетический фон популяции и изменяет результаты исследования. Кроме того, известно, чтоА^ II индуцирует А^ [8]. Возможно, лица, имеющие меньший уровень А^ II и, соответственно, генотип II, сложнее образуют коллатерали кровеносные русла. Поэтому атеросклеротическое поражения сосудов, имеет место у больных с ишемическим инсульт в нашем исследовании, легче реализуется в острое нарушение мозгового кровообращения.
Гиперактивность ренин - ангиотензин является важным фактором эндотелиальной дисфункции. Ее вовлечение в патогенез сердечно - сосудистых заболеваний подтверждается применением ингибиторов АСЕ в лечении
артериальной гипертензии, сердечной недостаточности и цереброваскулярных патологий. Ген АПФ экспрессируется различными тканями организма, включая эндотелий легких и сосудов. Белок, производится эндотелием легких, превращает ангиотензин I в ангиотензин II, который попадает в кровеносное русло и регулируется ренина. Однако существует локальная РАС для многих тканей, включая мозг. В этой системе АСЕ может обратно регулироваться ангиотензина I и II [9].
Роль тканевой РАС до конца не выяснена, известно о ее участии в пролиферации клеток и функционировании митохондрий. Возможно, повышенный уровень ангиотензина II, что имеет место у носителей аллеля D, играет протективную роль в тканевой РАС, воздействуя на улучшение микроциркуляции нервной ткани, потому что среди лиц популяционного контроля генотип DD чаще встречался у лиц старшего возраста. В любом случае необходимо дальнейшее изучение значений генетических изменений белков РААС для развития нарушений мозгового кровообращения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Wiam H. Impact of I/D polymorphism of angiotensin-converting enzyme (ACE) gene on myocardial infarction susceptibility among young Moroccan patients [Электронный ресурс]. https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC5740925/ дата обращения 13.03.2023.
2. Mohamed R. Risk Assessment Using the Association Between Renin-Angiotensin Genes Polymorphisms and Coronary Artery Disease [Электронный ресурс]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33907634/ дата обращения 14.03.2023.
3. The Relation between ACE Gene Polymorphism and the Severity of COVID-19 Infection [Электронный ресурс]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PM C9833908/ дата обращения 10.04.2023.
4. Differences in frequency of the deletion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene in different ethnic groups [Электронный ресурс]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11437027/ дата обращения 13.04.2023.
5. The Renin-Angiotensin System: A Key Role in SARS-CoV-2-Induced COVID- 19 [Электронный ресурс]. https: //www. ncbi.nlm. nih. gov/pmc/articles/PM C8622307/ дата обращения 20.04.2023.
6. Expressions and significances of the angiotensin-converting enzyme 2 gene, the receptor of SARS-CoV-2 for COVID-19 [Электронный ресурс]. https: //www. ncbi. nlm. nih. gov/pmc/articles/PMC7224351/ дата обращения 22.04.2023.
7. Shahid S. Association of the ACE-II genotype with the risk of nephroticsyndrome in Pakistani children [Электронный ресурс]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22033511/ дата обращения 20.03.2023.
8. Cuneyt K. B. Angiotensin Il-indused process of angiogenesis is mediated by spleen tyrosine kinase via VEGF receptor phosphorylation [Электронный ресурс]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21642504/, дата обращения 25.04.2023
9. Цымбалюк В. И. Исследования связи полиморфизма генов ACE, AGT и FGB с риском раннего развития ишемического инсульта атеротромботического подтипа лиц, проживающих на территории Украины // Международный неврологический журнал. 2016. № 8 (86). С. 20-26.
Trofimov V.A.
Doctor of Biological Sciences, Professor N.P. Ogarev Mordovian State University (Saransk, Russia)
Cheraksheva D.A.
Master
N.P. Ogarev Mordovian State University (Saransk, Russia)
THE ROLE OF ACE INS/DEL I>D GENE POLYMORPHISMS IN ISCHEMIC STROKE AND COVID - 19
Abstract: the study of polymorphisms of the ACE Alu Ins/Del I>D gene is associated with the fact that the gene plays an important role in the genetic predisposition to coronary heart disease and other diseases. In 2019, the biggest problem was the Covid - 19 disease. At the moment, there is a hypothesis that the ACE gene plays a role in the spread of the disease, which leads to problems with the cardiovascular system.
This study showed the predisposition of ACE gene I/I polymorphism in the group of patients with AI and Covid-19, and D/D polymorphism, on the contrary, prevails in the control group.
Keywords: ACE Alu Ins/Del I>D, D/D, I/D, II, ischemia, renin - angiotensin system, Covid
