CC BY
106
УДК 616.831-008.9 -092.9 Френкель Ю.Д.
РОЛЬ NO-СИНТАЗ У МЕХАН1ЗМАХ ПОРУШЕНЬ ОКИСНЮВАЛЬНОГО МЕТАБОЛ1ЗМУ У ТКАНИН1 ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЗА УМОВ XPOHI4HOÏ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОÏ ППОМЕЛАТОНШЕМИ
МиколаТвсыкий нацiональний у^вер^тет iM. В.О. Сухомлинського, м. МиколаТв
У експеримент!' на 25 блих щурах досл'джено роль функцонального стану NO-синтаз (NOS) у механзмах порушень окиснювального метабол'зму у тканин головного мозку при хрон1чн1й г'томелатошнеми, яку в'дтворювали шляхом цтодобового освтлення тварин у дозi 1500 лк протягом 55 di6. Виявлено, що за цих умов функцонування нейрональноУ NOS обмежуе р'тень утворення супероксидного анон-радикала дихальним ланцюгом м'тохондрш i активац1ю пероксидного окиснення лШд'т (ПОЛ) у тканин великих пвкуль головного мозку. У той же час, функцонування ¡ндуцибельно'У NOS сприяе гперпродукцУУ супероксида, активацИ ПОЛ, що супроводжуеться зниженням антиоксидантного потенц1алу, активностi супероксиддисмутази. Застосування L-аргiнiну за умов експерименту обмежуе активац1ю ПОЛ, пдвищуе активнють каталази у тканин великих пвкуль головного мозку.
Ключовi слова: гiпомелатонiнемiя, оксид азоту, NO-синтази, оксидативний стрес, головний мозок.
Стаття е фрагментом плановоï НДР МиколаТвського нацонального ун1верситету ¡м.. В.О. Сухомлинського „Вплив мелатон1ну на функцп систем оргашзму" (№ держреестрацп 0106U002994).
Вщтворення ппомелатоншеми шляхом цтодобового осв^лення щурiв у дозi 1500 люкс, за
нашими попередшми даними, супроводжуеться прогресуючим збтьшенням продукци О2 НАДФН-оксидазними комплексами: мiкросом та лейкоци^в (починаючи з 30 доби експерименту) та дихальним ланцюгом мтохондрш (на 55 добу експерименту), актива^ею пероксидного окиснення лт^в (ПОЛ) (на 55 добу експерименту), прогресуючим зниженням активносл антиоксидантних (АО) ферменпв: СОД i каталази (починаючи з 10 доби дослщу), глутатюнпероксидази (на 55 добу експерименту) [7].
В останн роки показана здатнють мелатоншу пригшчувати активнють шдуцибельноГ NO-синтази (iNOS) [13] та збтьшувати активнють нейрональноУ (nNOS) [11]. Саме з активнютю iNOS найчаспше пов'язують ^^ацш окиснювального стресу у тканин головного мозку за умов його ппокси, шеми / реперфузи, запалення [3, 6].
Проте NO-залежн мехаызми порушення втьнорадикальних окиснювальних процеав за умов ппомелатоншеми залишаються нез'ясованими.
Мета роботи
Вивчення ролi функцюнального стану NO-синтаз (NOS) у мехашзмах порушень окиснювального метаболiзму у тканиш головного мозку за умов хроычноТ експериментальноТ ппомелатоншеми.
Матерiали та методи
Дослщження були проведен на 25 бтих щурах лши Вютар масою 180-220 г у таких серiях дослiдiв: у першш - необхiднi показники вивчали у штактних тварин (контрольна серiя), у другiй -пiсля вщтворення хроычноТ гiпомелатонiнемiï; у третiй, четвертш i п'ятiй серiях - на тлГ хро^чноГ гiпомелатонiнемiï тваринам вводили вщповщно селективний iнгiбiтор nNOS - 7-ытрошдазол (7-NI), селективний iнгiбiтор iNOS - амшогуанщин, субстрат NOS - L-аргшш.
Хронiчну гiпомелатонiнемiю моделювали шляхом цтодобового освптення (1500 лк) щурiв термiном 55-ти дiб [7]. Зазначен вище сполуки вводили щоденно протягом останшх 7 дiб освiтлення тварин внутршньоочеревинно: 7-NI - 30 мг/кг [9], амшогуанщин - 20 мг/кг [10] та L-аргшш - 500 мг/кг [1]. Евтаназш тварин виконували методом дислокаци' шийних хреб^в пiд ефiрним наркозом. Об'ектом дослщження були велик пiвкулi головного мозку.
Утворення супероксидного анюн-радикала (О2 ) у гомогенат тканини головного мозку оцшювали при проведеннi тесту з штросишм тетразолiем з шдукторами у виглядi НАДН, НАДФН i
шрогеналу для оцiнки продукцГ' О2 вiдповiдно мiтохондрiальним i мiкросомальним електронно-траспортними ланцюгами (ЕТЛ), а також НАДФН-оксидазним комплексом лейкоци^в [8].
Рiвень ПОЛ у тканинi головного мозку оцшювали за утворенням у реакци тюбарб^урово' кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забарвленого триметiнового комплексу до i пюля 1,5-годинно' iнкубацiï [4]. АктивнГсть АО системи оцшювали за приростом концентраци ТБК-активних продук^в за час швторагодинно! iнкубацiï у залiзоаскорбатному буферному розчиы, а також за активнiстю АО ферметчв - супероксиддисмутази (СОД) та каталази [4].
Отриман данi пщдавали статистичнiй о6ро6цГ. Для перевiрки розподту на нормальнiсть було застосовано розрахунок критерш Шапiро-Вiлка. Якщо данi вщповщали нормальному розподГлу, то для 1х порГвняння використовували t-критерiй Ст'юдента для незалежних ви6Грок. У випадку, коли
ряди даних не пщлягали нормальному розподту, статистичну обробку здшснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-В^ш. Статистичш розрахунки проводили з використанням програм '^а^^оА: 6.0".
Результати дослiдження та 1х обговорення
Введення 7-NI на тлi цiлодобового освiтлення тварин протягом 55-ти дiб пiдвищуe продукцiю у
тканиш головного мозку О 2 мiтохондрiальним ЕТЛ - вiдповiдно в 2,4 рази (р<0,001) та на 20,4% (р<0,01) у порiвняннi з даними першо'Г та друго'1 серш (див. табл.).
Таблиця
Вплив ÎHai6imopie i субстрату NOS на показники вльнорадикального окиснення й АО системи в mKaHUHi головного мозку
за умов хронiчноï гiпомелатонiнемiï (M+m, n=25)
Показники Серп дослав
lнтактнiтварини Гiпом6латонiн6мiя (55 Ai5)
Контроль + 7-NI + амiно-гуанiдин + L-аргiнiн
Продук^я О 2 , нмоль/г с мiкросомальним ЕТЛ мiтохондрiальним ЕТЛ НАДФН-оксидазою лейкоци^в 11,75±0,80 9,17±1,21 1,17±0,08 18,02±0,88* 18,62±0,98* 1,74±0,08* 18,52±1,34* 22,41±0,56 */** 1,94±0,17* 15,04±0,93 */** 11,42±0,95** 1,49±0,07 */** 17,62±1,57* 16,02±1,38* 1,71 ±0,15*
Концентрацiя ТБК-реактан"пв, мкмоль/кг до ^куба^Т пГсля шкубацп прирют 30,9±6,1 43,2±4,82 12,3±1,4 61,8±0,6* 86,0±0,4* 24,2±0,1* 66,8±1,2 */** 93,4±1,1 */** 26,6±0,3 */** 51,2±1,6 */** 71,0±1,4 */** 19,8±0,4 */** 55,8±1,7 */** 79,6±1,4 */** 23,8±0,4 *
СОД, од. акт. 0,52±0,04 0,24±0,02* 0,15±0,03 */** 0,38±0,05** 0,27±0,05*
Каталаза, мккатал/кг 5,22±0,19 3,28±0,17* 3,02±0,23* 4,58±0,17 */** 4,07±0,19 */**
Примiтка: * - р<0,05 у порiвняннi з даними iнтактних щурв; **- р<0,05 у порiвняннi з даними другоТсерп.
Проте внесення 7-NI не призводить до достовiрних змш вироблення О 2 НАДФН-оксидазними системами мiкросом i лейкоци^в.
За умов пригшчення nNOS у тканиш мозку пщвищуеться концентра^я ТБК-реактан^в до шкубацп - на 8,1% (p<0,01), пюля шкубацп - на 8,6% (p<0,001) у порiвняннi з даними друго1 серп. Прирiст концентрацп ТБК-реактантiв за час шкубацп у залiзоаскорбатному буферному розчинi також збтьшуеться (на 9,9%, p<0,001) у порiвняннi з даними другоТ серп. Активнють СОД -знижуеться - на 37,5% (p<0,05), активнiсть каталази - ютотно не змiнюeться.
Отриманi нами даш вказують на той факт, що за умов експерименту функцюнальна активнють nNOS у тканиш мозку обмежуе процес активацп ПОЛ та пщтримуе АО потенцiал.
Введення амшогуанщину на тлi цiлодобового освiтлення тварин протягом 55-ти дiб обмежуе
продукцш О 2 у тканинi головного мозку щурiв мiкросомальним ЕТЛ - на 16,5% (p<0,05), мiтохондрiальним ЕТЛ - на 38,7% (р<0,001), НАДфН-оксидазним комплексом лейкоцитiв - на 14,4% (p<0,05) у порiвняннi з даними другоТ серп. Концентрацiя ТБК-реактантiв знижуеться: до шкубацп - на 17,2% (p<0,001), пюля шкубацп - на 17,4% (p<0,001). Прирiст концентрацп ТБК-реактантiв за час iнкубацiï у залiзоаскорбатному буферному розчинi також зменшуеться (на 18,2%, p<0,001). Активнiсть СОД i каталази - пщвищуеться - вщповщно на 58,3% (p<0,05) та 39,6% (p<0,001).
Отриманi нами данi вказують на той факт, що продук^я О2 мiкросомальним, мiтохондрiальним ЕТЛ i НАДФН-оксидазою лейкоцитiв, штенсивнють ПОЛ, зниження АО потенцiалу та активност АО ферментiв у тканиш головного мозку щурiв за умов хрошчноГ експериментальноГ ппомелатоншемп пов'язанi з функцюнальною активнiстю iNoS.
Введення L-аргшшу на тлi цiлодобового освiтлення тварин протягом 55-ти дiб достовiрно не
впливае на вироблення О 2 зазначеними ЕТЛ у тканиш головного мозку щурiв у порiвняннi з даними друго' серiï. Проте за цих умов знижуеться концентра^я ТБК-реактан^в до шкубацп - на 9,7% (p<0,02), пiсля iнкубацiï - на 7,4% (p<0,01) у порiвняннi з даними друго' серiï. Прирiст концентрацп ТБК-реактан^в у залiзоаскорбатному буферному розчиш при цьому достовiрно не змшюеться. Активнiсть каталази пiдвищуеться - на 24,1% (p<0,02), активнiсть СОД - достовiрно не змiнюеться.
Таким чином, отримаш нами результати пiдтверджують уявлення про неоднозначну роль NO у розвитку нейродеструкцп ("NO-парадокс"), який, очевидно, пов'язаний з вщмшностями функцюнальноГ компартментизацГГ конститутивних та iндуцибельноï NO-генеруючих систем [2].
NO, що утворюеться у великш кГлькостГ iNOS (за умов вщсутносп пригнГчуючого впливу мелатонiну), здатний брати участь у ланцюгових втьнорадикальних процесах, в ходГ яких поряд з продовженням i обривом ланцюпв можуть здiйснюватися i реакцп розмноження активних центрiв
[5]. У реакцп NO з О 2 утворюеться високоактивна прооксидантна сполука - пероксиштрит, яка
приеднуючи протон, розпадаеться протягом секунди, надаючи сильний окисний вплив на pi3Hi внутрiшньоклiтиннi мiшенi [12].
Висновки
1. За умов хрошчноТ експериментальноТ ппомелатоншеми функцiонування nNOS обмежуе рiвень утворення супероксидного анюн-радикала мiтохондрiальним ЕТЛ i активацш пероксидного окиснення лiпiдiв у тканиш великих твкуль головного мозку щурiв. Застосування селективного iнгiбiтору nNOS 7-штрошдазолу за цих умов значно пщвищуе продукцiю супероксидного анюн-радикала мiтохондрiальним еТл, сприяе активацiТ лтопероксидаци, пригнiчуе антиоксидантний потенцiал, знижуе активнють СОД.
2. За умов хрошчноТ' експериментальноТ ппомелатоншеми функцюнування iNOS викликае гiперпродукцiю супероксидного анiон-радикала, активацiю пероксидного окиснення лт^в у тканинi великих швкуль головного мозку, що супроводжуеться зниженням антиоксидантного потенцiалу, активностi супероксиддисмутази. Введення селективного iнгiбiтору iNOS амшогуанщину обмежуе вказаш порушення.
3. Застосування L-аргшшу за умов хрошчноТ експериментальноТ ппомелатоншеми обмежуе активацш пероксидного окиснення лт^фв, пiдвищуе активнiсть каталази у тканиш великих швкуль головного мозку.
Лiтература
1. Дробшська О. Вплив L-аргiнiну на ураження в слизовш оболонцi шлунка, спричинеш серотонiном / О. Дробшська, Л. Остапченко, О. Цирюк [та ш.] // Вiсн. Львiв. ун-ту. Сер. бiол. - 2004. - Вип. 38. - С . 201-204.
2. Костенко В.О. Мехашзми ауторегуляцп утворення оксиду азоту в органiзмi ссав^в та Тх порушення при розвитку патологiчних процесiв /
B.О. Костенко, Н.В. Соловйова, О.В. Коваленко [та ш.] // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вiсн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2011. - Т.11, №3. - C. 150-154.
3. Куровська В.О. Роль оксиду азоту в iшемiчних i iшемiчно-реперфузiйних ушкодженнях головного мозку / В.О. Куровська, В.П. Пшак,
C.С. Ткачук // Буковинськ. мед. вюн. - 2008. - Т. 12, №4. - С. 143-149.
4. Методи кшшчних та експериментальних дослщжень в медицин / [ Л.В. Беркало, О.В. Бобович, Н.О. Боброва та ш.] ; за ред. 1.П.Кайдашева. - Полтава, 2003. - 320 с.
5. Осипов А.Н. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов / А.Н. Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров // // Усп. биол. хим. - 2007. - Т. 47. - С. 259-292.
6. Проблема оксида азота в неврологии / [В.А. Малахов, А.Н. Завгородняя, В.С Лычко и др.]. - Сумы : Изд-во СумГПУ им. А.С. Макаренко, 2009. - 242 с.
7. Френкель Ю.Д. Прооксидантно-антиоксидантная система головного мозга крыс при гипо- и гипермелатонинемиях / Ю.Д.Френкель,
0.И.Цебржинский // Высокие технологии. фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине. - Т.
1. - [сб. ст.] - науч. ред. А.П. Кудинов, Б.В. Крылов. - СПб, 2011. - С. 203-208.
8. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофотометрическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом / О.И. Цебржинский // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2002. - Т. 2, №1. - C.96-97.
9. Laude K. NO produced by endothelial NO synthase is a mediator of delayed preconditioning-induced endothelial protection / K. Laude, J. Favre, C. Thuillez [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 2003. - V. 284, №6. - P. H2053-H2060.
10. Takeuchi K. Role of endogenous nitric oxide (NO) and NO synthases in healing of indomethacin-induced intestinal ulcers in rats / K. Takeuchi, R. Hatazawa, M. Tanigami [et al.] // Life Sci. - 2007. - V. 80, №4. - P. 329-336.
11. Sarti P. New evidence for cross talk between melatonin and mitochondria mediated by a circadian-compatible interaction with nitric oxide / P. Sarti, M.C. Magnifico, F. Altieri [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - V. 14, №6. - P. 11259-11276.
12. Szabó S. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics / C. Szabó, H. Ischiropoulos, R. Radi // Nature Reviews. - 2007. - V. 6. - P. 662-680.
13. Vilar A. Melatonin suppresses nitric oxide production in glial cultures by pro-inflammatory cytokines through p38 MAPK inhibition / A. Vilar, L. de Lemos, I. Patraca [et al.] // Free Radic. Res. - 2014. - V.48, №2. - P. 119-128.
Реферат
РОЛЬ NO-СИНТАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ НАРУШЕНИЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОМЕЛАТОНИНЕМИИ Френкель Ю.Д.
Ключевые слова: гипомелатонинемия, оксид азота, NO-синтазы, оксидативный стресс, головной мозг.
В эксперименте на 25 белых крысах исследована роль функционального состояния NO-синтаз (NOS) в механизмах нарушений окислительного метаболизма в ткани головного мозга при хронической гипомелатонинемии, воспроизведенной путем круглосуточного освещения животных в дозе 1500 лк в течение 55 суток. Выявлено, что в этих условиях функционирование нейрональной NOS ограничивает уровень образования супероксидного анион-радикала дыхательной цепью митохондрий и активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ткани больших полушарий головного мозга. В то же время, функционирование индуцибельной NOS способствует гиперпродукции супероксида, активации ПОЛ, что сопровождается снижением антиоксидантного потенциала, активности супероксиддисмутазы. Применение L-аргинина в условиях эксперимента ограничивает активацию ПОЛ, повышает активность каталазы в ткани больших полушарий головного мозга.
Summary
ROLE OF NO-SYNTHASES IN THE MECHANISM OF OXIDATIVE METABOLIC DISTURBANCES IN CEREBRAL TISSUES UNDER CHRONIC MODELED HYPOMELATONINEMIA Frenkel Yu.D.
Key words: hypomelatoninemia, nitric oxide, NO-synthases, oxidative stress, cerebrum.
The experiment carried out 25 white rats was designed to study the role of the functional state of NO-synthases (NOS) in the mechanisms of disorders of oxidative metabolism in brain tissue under chronic modeled hypomelatoninemia (animals were exposed to steady illumination at a dose of 1500 lux for 55 days). We have found out in these conditions the functioning of neuronal NOS level limits the formation of superoxide anion radical by the respiratory chain of mitochondria as well as the activation of lipid
peroxidation (LPO) in cerebral tissues. At the same time, the functioning of inducible NOS causes superoxide hyperproduction, LPO activation that is accompanied by the decrease in antioxidant capacity, superoxide dismutase activity. The use of L-arginine in the modeled conditions limits the activation of LPO, increases the activity of catalase in cerebral tissues.
