CC BY
7УДК 577.21
А.В. Колубако, Е.А. Николайчик
РОЛЬ NDR1 В РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ NICOTIANA BENTHAMIANA НА ЗАРАЖЕНИЕ БАКТЕРИЯМИ PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM
Белорусский государственный университет Республика Беларусь, 220030, г. Минск, пр. Независимости, 4; e-mail: kolubakoav@yandex.by
Изучение роли компонентов сигнальных цепей растений - процесс довольно сложный и длительный. При помощи методики вирус-индуцированного сайленсинга генов изучалась роль белка NDR1 в индукции защитного ответа растений Nicotiana benthamiana на внедрение патогена Pectobacterium carotovorum. Характер ответа растений на инфильтрацию суспензиями клеток различных штаммов P. carotovorum предполагает, что белок NDR1, а, следовательно, и R-белок этого пути активации иммунитета, не участвуют в распознавании эффектора DspE, в то же время данные свидетельствуют в пользу наличия другого (-их) эффектора (-ов) ССТТ Р. carotovorum, участвующего (-их) в развитии заболевания у растений семейства Пасленовые.
Ключевые слова: система секреции третьего типа, эффекторы, NDR1, иммунитет растений
Введение
Молекулярные механизмы иммунных реакций растений в ответ на внедрение патогенов до сих пор до конца не выяснены. В исследованиях на эту тему предпочтение отдается очень ограниченному кругу растений, среди которых, пожалуй, самым изученным является резуховидка Таля (Arabidopsis ^аИ-апа). Иммунная сигнализация у разных видов растений отличается и имеет свои особенности, однако общая схема взаимодействий по большому счету остается неизменной. Согласно гипотезе стража [1], различного рода изменения, происходящие в клетках или межклеточном пространстве растений, вызванные внедрением патогенов, детектируются рецепторами растений и вызывают соответствующие иммунные реакции. Однако патогены научились манипулировать иммунитетом растений при помощи различных эффекторов, вводимых прямо в клетку хозяина при помощи различных систем секреции, чаще всего системы III типа (ССТТ). В свою очередь, на такие действия патогенов растения могут реагировать активацией белков устойчивости (Я-белков) и запуском эффектор-индуцирован-ного иммунитета.
А. ^аНапа обладает двумя семействами цитоплазматических R-белков: TIR-NB-LRR и СС-КБ-ЬКЯ. R-белки этих семейств реагируют на доставляемые с помощью системы
секреции третьего типа эффекторы патогенов, среди которых лучше всего изучены многочисленные эффекторы Pseudomonas syringae.
RPS4, типичный представитель семейства TIR-NB-LRR, распознает эффекторы, действующие на транскрипционные факторы WRKY [2], и передает сигнал с участием посредника EDS1 (enhanced disease susceptibility), что ведет клетки к аутофагии [3]. RPM1 и RPS2 (семейство СС-NB-LRR) в клетках растений в норме связаны с белком RIN4 (RPM1 interacting protein 4), их негативным регулятором, а также с белком NDR1 (non race-specific disease resistance 1), являющимся позитивным регулятором системной приобретенной устойчивости (SAR). Воздействие соответствующих белков ави-рулентности вызывает либо фосфорилиро-вание RIN4 и активацию RPM1 с последующей аутофагией, либо протеолиз RIN4 (в случае с RPS2) и титрование участка RIN4 белком NDR1, в результате чего снимается супрессия R-белка RPS2 и активируется RPS2-опосредованная устойчивость и независимая от аутофагии смерть клеток [4]. На начальных этапах ответа пути TIR-NB-LRR и СС-NB-LRR могут конвергировать после активации EDS1 и NDR1 соответственно на уровне RAR1 и SGT1. Эти события приводят к генерации активных форм кислорода
и запуску реакции гиперчувствительности, а также к активации MAP-киназного сигнального каскада. Однако после активации EDS1 события могут развиваться по пути активации салицилатзависимых генов, регулирующихся в том числе MAP-киназным каскадом. Эти события стимулируют транслокацию белка NPR1 (non-expressor of PR1) в ядро, где он взаимодействует с транскрипционными факторами TGA, в результате чего запускается экспрессия PR-генов и защитный ответ [5].
Основными бактериальными патогенами семейства Пасленовые являются бактерии рода Pectobacterium, вызывающие мокрые гнили клубней при хранении и заболевание вегетирующих растений «черная ножка». Механизмы распознавания растениями этого патогена изучены значительно слабее. На данный момент единственным известным эффектором ССТТ бактерий Р. carotovorum является белок DspE - гомолог эффектора DspA/E Erwinia amylovora [6]. Инактивация этого эффектора в клетках пектобактерий ведет к уменьшению интенсивности реакции гиперчувствительности, а также к изменению уровней экспрессии защитных генов у растений-хозяев семейства Solanaceae [7]. Ранее в нашей лаборатории было проведено исследование, целью которого являлся поиск в протеоме растений семейства пасленовых последовательностей-кандидатов на роль трансмембранных рецепторных киназ LRR-RLK, потенциально взаимодействующих с эффектором DspE P. carotovorum. Такие RLK были найдены и идентифицированы как RLK2 и RLK5 [8, 9]. При взаимодействии киназ RLK2 и RLK5 с эффектором
DspE патогена P carotovorum происходят изменения в работе сигнальной цепи и запуск реакции гиперчувствительности в области первичного контакта с патогеном, а так как пектобактерии являются некротрофами, такая реакция растения приводит к успешной его колонизации [10].
В нашей лаборатории ранее показано участие киназ SIPK и WIPK в детекции пектобактерий [11], а среди других компонентов сигнальных цепей исследованы SGT1 и EDS1. Проведенные ранее эксперименты по сайленсин-гу гена EDS1 в растениях N. benthamiana с последующим заражением этих растений штаммами P carotovorum (дикого типа и дефектными по различным компонентам ССТТ) не дали отличных от контролей результатов, а значит R-белки типа TIR-NB-LRR не участвуют в активации защитного ответа у данного вида пасленовых. В связи с этим было решено проверить влияние компонента того же уровня другого пути активации иммунного ответа, действующего через СС-КБ-ЬЯК а именно белка NDR1.
Материалы и методы
В исследовании использовались растения табака N. benthamiana, выращенные при 20 °С и 16-часовом световом дне. Штаммы пектобактерий P. carotovorum JN42, Р. carotovorum VKE и Р. carotovorum ТА5, а также агробактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101 культивировали на среде LB при 28 °С. Конструкции, использованные для проведения вирус-индуцированного сайленсинга, а также характеристики штаммов бактерий указаны в таблице.
Характеристика использованных штаммов и плазмид
Штамм/плазмида Характеристика Источник/ссылка
P. carotovorum JN42 r- CmR (Tn9) RifR производный от природного изолята P. carotovorum 3-2 Коллекция кафедры молекулярной биологии БГУ
Р. carotovorum TA5 JN42 hrpL::QSp/Sm [12]
P. carotovorum VKE JN42 dspE::pJP5603 [7]
A. tumefaciens GV3101 RifR, GenR, vir+ Dinesh-Kumar et al., 2005 Arabidopsis Biological Resource Center
p1039 кДНК РНК1 TRV (pTRVl) Dinesh-Kumar et al., 2005 Arabidopsis Biological Resource Center
Окончание таблицы
Штамм/плазмида Характеристика Источник/ссылка
p1044 кДНК РНК2 TRV (pTRV2::GFP) Dinesh-Kumar et al., 2005 Arabidopsis Biological Resource Center
p1046 кДНК РНК2 TRV (pTRV2::mS) Dinesh-Kumar et al., 2005 Arabidopsis Biological Resource Center
p1052 кДНК РНК2 TRV (pTRV2::SGT1) Коллекция кафедры молекулярной биологии БГУ
pTRV2::NDR1 кДНК РНК2 TRV (pTRV2::NDR1) Коллекция кафедры молекулярной биологии БГУ
Вирус-индуцированный сайленсинг осуществлялся по методике [13]. После трансформации растения помещались в климатическую камеру с 16-часовым световым днем и температурой 24 °С. Заражение растений и процедура учета результатов по 5-бальной шкале описаны в [14]. Оценка значимости различий в реакциях растений на введение патогенов производилась при помощи критерия Крускала-Уоллиса в программе Statistica (версия 6.0.668.0). Для статистической обработки результатов заражения оценивали реакцию не менее 6 растений в каждой группе.
Результаты и обсуждение
Самым простым способом выяснения функции элемента системы является его инактивация. Этот подход используется и для выяснения механизма защитного ответа растений. Наиболее быстрым и простым способом инактивации генов растений является вирус-индуцированный сайленсинг (ВИСГ),
что и обусловило его выбор в настоящей работе для инактивации генов компонентов сигнальных цепочек.
В качестве положительных контролей сай-ленсинга использовались конструкции, содержащие ген фитоиндесатуразы PDS, фермента, участвующего в биосинтезе каротиноидов (сайленсинг PDS приводит к утрате растением пигментации), и SGT1, компонента сигнальной цепи растения, фенотип сайленсинга которого - зауженные и удлиненные деформированные листья. Первые признаки сай-ленсинга гена PDS начали проявляться через неделю после трансформации, SGT1 - через две недели. Через 30 дней у этих растений наблюдался ярко выраженный фенотип (рис. 1), стабильно сохранявшийся в дальнейшем на протяжении более четырех недель.
Для выяснения роли гена NDR1 растений во взаимодействии с патогеном по истечении 35 суток с момента индукции ВИСГ производилась инфильтрация растений сус-
pTRV2::P£»S
pTRV2::SGT1
Контроль
Рис. 1. Индукция сайленсинга генов PDS и SGT1 в растениях N. benthamiana после инфильтрации суспензией клеток A. tumefaciens GV3101 с соответствующими конструкциями в сравнении с контролем -
неинфильтрованным растением (справа)
пензиями бактерий различных штаммов Р. саю^отт, а именно Р. сат^отт Ш42 (штамм дикого типа), Р. carotovorum ТА5 (штамм с мутацией в гене ключевого компонента системы секреции третьего типа, в результате которой данная система секреции не формируется) и Р. carotovorum VKE (штамм, мутантный по гену единственного известного на данный момент эффектора DspE той же системы секреции). В качестве негативных контролей использовались растения, инфильтрованные 10 мМ MgSO4 и нетронутые растения.
У контрольных растений наблюдались следующие реакции (рис. 2): на внедрение патогена Р. сат^отт JN42 растения отвечали индукцией реакции гиперчувствительности по всей зоне инфильтрации, а в ответ на проникновение штаммов Р. сат-^отт ТА5 и Р. сат^отт VKE реакции гиперчувствительности не наблюдалось или она была очень слабой. Такой ответ на контакт с клетками Р. сат^отт характерен
для растений семейства Пасленовые. Инфильтрация 10 мМ MgSO4 видимой реакции не давала.
Иная картина наблюдалась у растений с сайленсингом гена NDR1. Здесь, как и у контрольных растений, видна сильная индукция реакции гиперчувствительности в ответ на штамм дикого типа Р. caroto-vorum JN42, в некоторых случаях наблюдалось увядание или мацерация листа. В ответ на проникновение штамма Р. сато vorum ТА5 (с полностью инактивированной системой секреции третьего типа) растения с сайленсингом целевого гена реагировали сильнее в сравнении с контрольными. Здесь реакция гиперчувствительности охватывала до 70% зоны инфильтрации. Штамм Р. сат-tovorum VKE индуцировал очень слабую реакцию гиперчувствительности в растениях или не индуцировал ее вовсе, как и у растений без сайленсинга гена . Инфильтрация
10 мМ MgSO4 также видимой реакции не давала.
■о
Ч о
С*
P. carotovorum JN42
P. carotovorum ТА5
P. carotovorum VKE
Рис. 2. Типичная реакция контрольных растений (верхний ряд) и растений с сайленсингом гена NDR1 (нижний ряд) N. benthamiana на инфильтрацию суспензиями клеток различных штаммов P. carotovorum плотностью 1,5-108 клеток/мл. Фотографии сделаны через 24 часа после инфильтрации
Таким образом, реакция контрольных и опытных растений оказалась очень похожей при использовании для заражения штаммов дикого типа (интенсивная реакция гиперчувствительности) и ^р£-мутанта (практически полное отсутствие реакции), тогда как четкие отличия наблюдались только при использовании штамма ТА5, причем значимость различий в последнем случае подтверждается при статистической обработке (рис. 3). Повторные опыты показали воспроизводимость этих результатов.
Стоит отметить, что в экспериментах на Л. thaliana инактивация ЫБЯ! влекла за собой уменьшение реакции гиперчувствительности в ответ на патоген [15]. Усиление же экспрессии этого гена повышало устойчивость к патогену путем увеличения интенсивности сверхчувствительности, что отлично работает, поскольку патоген Р. syringae является био-трофом, то есть извлекает питательные вещества непосредственно из живых клеток, а отмирание ткани (а также индукция защитных генов в месте колонизации, а также в прилежащей области) ведет, соответственно, к гибели патогена [16, 17]. В нашем эксперименте реакция гиперчувствительности в растениях с сайленсингом только
усиливалась, как в ответ на контакт с клет-
ками P. carotovorum штамма дикого типа (наблюдалась мацерация и увядание листьев), так и дефектными по всей системе секреции третьего типа. В данном случае, в связи с тем, что P. carotovorum является некротрофным патогеном и получает только выгоду (питание) от некроза листа, можно заключить, что растения при снижении уровня экспрессии NDR1 становятся более чувствительными к патогену.
Учитывая полученные данные, а именно отсутствие выраженной реакции на внедрение штамма P carotovorum VKE, можно заключить, что DspE, единственный известный эффектор системы секреции третьего типа P. carotovorum, не взаимодействует с NDR1 ни напрямую, ни опосредованно. Однако инактивация всей системы секреции повышает чувствительность к заражению растений с сайлен-сингом NDR1, в связи с чем можно предположить, что в контроле индукции реакции гиперчувствительности, опосредованном NDR1, участвует другой(-ие) эффектор(ы) той же системы секреции.
Ген NDR1 кодирует сходный с интегринами белок, который взаимодействует in vivo с RIN4, в норме отвечающим за инактивиро-ванное состояние цитоплазматических R-бел-
S
s я
а <ц
а п * ё
fr
О
о я
а «
В ü
i ё
,3 к
К е
JN42
JN42 (к)
TA5
TA5* (к)
VKE
VKE (к)
Рис. 3. Интенсивность реакции гиперчувствительности при контакте бактерий разных штаммов Р carotovorum с растениями N. benthamiana, подвергнутыми сайленсингу ЫБЯ] и с контрольными (к) (р = 0,0238)
ков [4]. Показано, что NDR1 дважды заякорен в мембране и может образовывать гомо-димеры, что предположительно усиливает защитный ответ после детекции эффектора. Цитоплазматическая часть NDR1 связана с компонентами иммунитета, запускающими MAP-киназный сигнальный каскад, ведущий к индукции ETI (эффектор-индуцированного иммунитета), а, следовательно, и к запуску реакции гиперчувствительности. Внецито-плазматический домен NDR1 контактирует с клеточной стенкой [11], а значит, белок NDR1 может выступать в качестве сенсора целостности клеточной стенки, что особенно актуально при распознавании разрушающих стенки растительных клеток патогенов, к числу которых относится и P carotovorum. Дополнительный эффектор (или эффекторы) патогена, о наличии которого свидетельствует настоящая работа, может препятствовать детекции растением нарушения целостности клеточной стенки и блокировать активацию защитной реакции.
Заключение
^ши эксперименты впервые демонстрируют участие NDR1 N. benthamiana в детекции P. carotovorum, а также являются первым свидетельством в пользу наличия у этих бактерий как минимум еще одного эффектора системы секреции III типа помимо описанного ранее DspE. Поскольку базовые механизмы детекции патогенов различными растениями семейства Пасленовые очень похожи, представленные здесь результаты, помимо фундаментальной значимости, могут способствовать созданию устойчивых к бактериозам сортов хозяйственно ценных представителей семейства.
Список использованных источников
1. Jones, J.D.G. The plant immune system / J.D.G. Jones, J.L. Dangl // Nature. - 200б. - Vol. 444, № 7117. - P. 323-329.
2. A Plant Immune Receptor Detects Pathogen Effectors that Target WRKY Transcription Factors / P.F. Sarris [et al.] // Cell. - 2015. -Vol. 1б1, № 5. - P. 1089-1100.
3. Sohn, K.H. The Pseudomonas syringae effector protein, AvrRPS4, requires in planta processing and the KRVY domain to function /
K.H. Sohn, Y. Zhang, J.D.G. Jones // The Plant Journal. - 2009. - Vol. 57, № 6. - P. 10791091.
4. Day, B. NDR1 Interaction with RIN4 Mediates the Differential Activation of Multiple Disease Resistance Pathways in Arabidopsis /
B. Day, D. Dahlbeck, B.J. Staskawicz // The Plant Cell. - 2006. - Vol. 18, № 10. - P. 2782-2791.
5. Joshi, R.K. Functional characterization and signal transduction ability of nucleotide-binding site-leucine-rich repeat resistance genes in plants / R.K. Joshi, S. Nayak // Genetics and molecular research: GMR. - 2011. - Vol. 10, № 4. - P. 2637-2652.
6. Николайчик, Е.А. Фитопатоген Pecto-bacterium carotovorum использует аппарат секреции III типа для блокирования системного защитного ответа растения-хозяина / Е.А. Николайчик, Л.Л. Хомская, Е.И. Иг-натенко // Труды Белорусского государственного университета. - 2009. - № 4. -
C.189-196.
7. Транслокация белка DspE фитопатоген-ными бактериями Erwinia carotovora subsp. atroseptica в клетки Nicotiana tabacum и его необходимость для индукции реакции гиперчувствительности / Е.А. Николайчик [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2005. - Т. 49, № 5. - С. 81-85.
8. Роль рецепторподобной трансмембранной киназы растений семейства Пасленовых во взаимодействии с фитопатогеном Pectobacterium carotovorum / Е.А. Николайчик [и др.] // Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2012. - Т. 56. - С. 106-112.
9. Бадалян, О.А. Рецептороподобная киназа RLK2 растений семейства пасленовых участвует в детекции некротрофно-го патогена Pectobacterium carotovorum / О.А. Бадалян, Е.В. Кулик // Сборник работ 69-й научной конференции студентов и аспирантов Белорусского государственного университета. - 2013. - Т. 1. - С. 3-6.
10. Бадалян, О.А. Рецепторподобные ки-назы RLK2 и RLK5 Nicotiana benthamiana участвуют в регуляции экспрессии генов ключевых компонентов иммунной системы растения при контакте с Pectobacterium carotovorum / О.А. Бадалян, Е.А. Николайчик // Известия национальной академии наук Беларуси. - 2014. - Т. 4. - С. 75-80.
11. Бадалян, О.А. Влияние сайленсин-га генов MAP-киназ SIPK и WIPK растений Nicotiana benthamiana на активацию системной устойчивости при инфицировании бактериями Pectobacterium carotovorum / О.А. Бадалян, Е.А. Николайчик // Известия национальной академии наук Беларуси. -2014. - № 3. - С. 70-73.
12. The use of alternative sigma factor HrpL to improve expression of the type III secretion machinery of Erwinia carotovora subsp. atro-septica / T.V. Ovchinnikova [et al.] // Biotechnology in Agriculture and the Food Industry. -2004. - P. 141-148.
13. Liu, Y. Virus-induced gene silencing in tomato / Y. Liu, M. Schiff, S.P. Dinesh-Kumar // The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. - 2002. - Vol. 31, № 6. -P. 777-786.
14.Бадалян, О.А. Участие MAP-киназ WIPK и SIPK растений Nicotiana benthamiana в детекции фитопатогена Pectobacterium carotovorum / О.А. Бадалян, Е.А. Николайчик // Доклады НАН Беларуси. - 2013. - Т. 57, № 6. - С. 75-81.
15. Shapiro, A.D. The Role of NDR1 in Avirulence Gene-Directed Signaling and Control of Programmed Cell Death in Arabidopsis / A.D. Shapiro, C. Zhang // Plant Physiology. -2001. - Vol. 127, № 3. - P. 1089-1101.
16. Overexpression of the plasma membrane-localized NDR1 protein results in enhanced bacterial disease resistance in Arabidopsis thaliana / P. Coppinger [et al.] // The Plant Journal. - 2004. - Vol. 40, № 2. - P. 225-237.
17.Katagiri, F. The Arabidopsis Thaliana-Pseudomonas Syringae Interaction / F. Katagiri, R. Thilm-ony, S.Y. He // The Arabidopsis Book / American Society of Plant Biologists. - 2002. - Vol. 1.
A.V. Kolubako, Y.A. Nikolaichik
ROLE OF NDR1 IN THE REACTION OF NICOTIANA BENTHAMIANA PLANTS TO PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM INFECTION
Belarusian State University Minsk BY-220030, the Republic of Belarus
Studying the role of plant signal chains' components is a rather complicated and lengthy process. Using the virus-induced gene silencing technique, the role of NDR1 protein in the induction of the protective response of N. benthamiana plants during P. carotovorum infection was studied. The way plants respond to infiltration by cell suspensions of various P. carotovorum strains suggests that the protein NDR1 and, therefore, the R-protein of the same pathway of immunity activation, does not participate in effector DspE recognition while the data support the presence of the other effector(s) of the TTSS P carotovorum participating in the disease development in plants from the Solanaceae family.
Key words: type three secretion system, effectors, NDR1, plant immunity
Дата поступления статьи: 1 августа 2017 г.
