CC BY
30
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИСПЫТАНИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ
УДК 577.125.53:618.36:578.825.12
Н.А. Ишутина
РОЛЬ НАРУШЕНИЙ СОСТАВА ФОСФОЛИПИДОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПЕРИОД ГЕСТАЦИИ
ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания», Благовещенск, Россия
Исследовали фосфолипиды и фосфолипазу А2у беременных c цитомегаловирусной инфекцией. Обострение заболевания сопровождается деструктивными явлениями, в основе которых лежит активация фосфолипазы А2 и модификация фосфолипидной матрицы: уменьшение фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина (в среднем на 16-17 %, p < 0,001), повышениелизофосфатидилхолина (более 51 %, p < O,00l). Данные изменения могут явиться фактором нарушения деформируемости клеток, гемолиза эритроцитов, увеличения микровязкости крови и быть причиной развития внутриутробной гипоксии плода. Ключевые слова: фосфолипиды, фосфолипаза А2, беременность, цитомегаловирусная инфекция
ROLE OF COMPOSITIONAL DISORDERS IN PHOSPHOLIPIDS IN THE PATHOGENESIS OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION IN THE GESTATION PERIOD
N.A. Ishutina
Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, Blagoveshchensk, Russia
We studied the composition of phospholipids and phospholipase A2 in 96 pregnant women c cytomegalovirus infection (titer of IgG antibodies to cytomegalovirus 1: 1600). It was found that the aggravation of CMV infection in pregnant women is accompanied with membrane-destructive phenomena, which are based on the activation of phospholipase A2 and the modification of the phospholipid matrix exhibits decrease of phosphatidylethanolamine (I trimester - by 24%, II trimester - by 16 %, III trimester - by 9 % (p < 0,001)); phosphatidylcholine (I trimester - by 14 %, II trimester - by 16 %, III trimester - 23 % (p < 0,001)); phosphatidylserine (I trimester - by 46 % (p < 0,001), II trimester - by 33 % (p < 0,01), III trimester - by 101 % (p < 0,001)). Increasing the concentration of sphingomyelin (I trimester - by 16 %, II and III trimesters - by 9 %; p < 0,001), lysophosphatidylcholine (I trimester - by 71 %, II trimester - 59 %, III trimester - by 51 % (p < 0,001)) compared with healthy women. Identified changes may be the significant factor in violation of the deformability of cells, red blood cell hemolysis, increased microviscosity blood, and therefore is the cause of fetal hypoxia.
Key words: phospholipids, phospholipase A2, pregnancy, cytomegalovirus infection
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что перекисное окисление липидов (ПОЛ) вносит весомый вклад в патогенез вирусной инфекции во время беременности [3, 7]. Интенсификация процессов пероксидации липидов сопровождается значительным изменением состава и степени окис-ленности мембранных фосфолипидов и жирных кислот [2, 6, 7], что способствует снижению активности фосфолипидзависимых энзиматических систем, а в конечном итоге приводит к нарушению целостности липидного бислоя клеточных мембран [8]. В условиях активного течения ПОЛ наиболее резко уменьшается количество фосфолипидов, имеющих в своем составе полиненасыщенные жирные кислоты - фосфотиди-лэтаноламин (Ре), фосфотидилинозитол (Р1) [1]. Избирательная делипидизация мембран вызывает рост отношения холестерин/фосфолипиды, изменения физико-химических свойств мембран и увеличение их микровязкости [8]. В связи с вышеизложенным целью данного исследования явилось изучение роли нарушений состава фосфолипидов мембраны эритро-
цитов в патогенезе цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) в период гестации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили мембрана эритроцитов 96 беременных с обострением хронической ЦМВИ (титр антител к цитомегаловирусу (ЦМВ) 1 : 1600) в разные сроки гестации, составивших основную группу. В качестве контрольной группы обследовано 90 практически здоровых женщин на тех же сроках гестации.
Определяли количественный состав фосфоли-пидов, результаты выражали в процентах от общей суммы. Липиды экстагировали по методу Ро1сЪа [10]. Готовые экстракты разделяли на индивидуальные фракции фосфолипидов на пластинках с тонким слоем силикагеля (Шое1ш, Германия). Двухмерную тонкослойную хроматографию и идентификацию индивидуальных фракций фосфолипидов осуществляли по методу Кирхнера [4]. Количественное определение фракций проводилось спектрофотометрически.
Содержание фосфолипазы А2 в периферической крови беременных с ЦМВИ определяли методом ИФА с помощью реактивов фирмы «Cayman chemical» (США).
У женщин симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение ЦМВИ - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65 %, а также ДНК ЦМВ. Верификация ЦМВ, определение типоспецифи-ческих антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА, выявление ДНК ЦМВ - методами ПЦР
Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками от 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 226.
Все расчеты проводились с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения проводили по критерию Колмогорова - Смирнова. Анализируемые в статье
данные имели нормальное распределение, поэтому проводился расчет средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (ш). Проверку гипотезы о статистической значимости различных двух выборок проводили с помощью ^критерия Стьюдента и считали значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе результатов исследования было установлено нарушение количественного состава фосфолипидов у женщин с обострением ЦМВИ (табл. 1).
Так, в мембране эритроцитов женщин основной группы концентрация Ре в I триместре снижалась на 24 % (р < 0,001), на 16 % - во II триместре (р < 0,001) и на 9 % - в III триместре (р < 0,001), по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (табл. 1).
Выявленное снижение доли легкоокисляемого ненасыщенного Ре у женщин основной группы явилось следствием активации процессов ПОЛ.
Аналогичная динамика изменений наблюдалась и для другого структурного фосфолипида - фосфа-тидилхолина (Рс). Его концентрация уменьшалась в мембране эритроцитов беременных основной группы в I триместре на 14 % (р < 0,001), во II триместре - на
Таблица 1
Состав фосфолипидов мембраны эритроцитов и содержание фосфолипазы А2 плазмы периферической крови
у беременных с ЦМВИ (М ± m)
Показатель Группа
I триместр II триместр III триместр
Фосфатидилэтаноламин (Pe), %
Контрольная 21,10 ± 1,0 20,60 ± 0,60 23,40 ± 0,60
Основная 18,22 ± 0,76; p < 0,001 17,39 ± 0,51; p < 0,001 21,39 ± 0,21; p < 0,001
Фосфатидилхолин (Pc), %
Контрольная (n = 32) 30,90 ± 0,80 32,20 ± 1,30 33,10 ± 0,80
Основная (n = 30) 26,57 ± 0,32; p < 0,001 27,15 ± 0,44; p < 0,001 25,58 ± 0,26; p < 0,001
Сфингомиелин (Sph), %
Контрольная (n = 32) 20,20 ± 0,80 20,60 ± 0,60 22,50 ± 0,50
Основная (n = 30) 23,47 ± 0,36; p < 0,001 22,53 ± 0,32; p < 0,01 24,63 ± 0,19; p < 0,001
Лизофосфатидилхолин (Lpc), %
Контрольная (n = 32) 4,0 ± 0,70 5,30 ± 0,60 7,20 ± 1,20
Основная (n = 30) 6,85 ± 0,47; p < 0,001 8,44 ± 0,25; p < 0,001 10,89 ± 0,12; p < 0,001
Фосфатидилинозитол (Pi), %
Контрольная (n = 32) 12,80 ± 0,50 12,30 ± 0,40 9,80 ± 0,30
Основная (n = 30) 11,29 ± 0,44; p < 0,05 11,47 ± 0,35 8,71 ± 0,11; p < 0,01
Фосфатидилсерин (Ps), %
Контрольная (n = 32) 7,80 ± 0,65 9,60 ± 0,80 4,0 ± 0,20
Основная (n = 30) 11,39 ± 0,31; p < 0,001 12,78 ± 0,55; p < 0,01 8,05 ± 0,37; p < 0,001
Фосфолипаза Аг, нг/мл
Контрольная (n = 32) 0,29 ± 0,07 0,38 ± 0,06 0,45 ± 0,08
Основная (n = 30) 0,46 ± 0,08; p < 0,001 0,51 ± 0,05; p < 0,001 0,72 ± 0,06; p < 0,001
Примечание. р - уровень значимости различий между показателями контрольной группы.
16 % (p < 0,001) и в III триместре - на 23 % (p < 0,001), по сравнению с показателем контрольной группы (табл. 1).
Причины изменения содержания Pc разнообразны и могут быть обусловлены нарушением его синтеза de novo, расходованием в энергетических процессах и антиокислительных функциях [9]. Влияние на уровень Pc также может оказывать активность эндогенных фосфолипаз. Обеднение эритроцитов Pc, формирующим внешнюю оболочку липидного матрикса клетки, свидетельствует о дезинтеграции мембранных структур, завершающихся их деструкцией.
В ранее опубликованной работе [3] мы показали, что процессы ПОЛ в условиях ЦМВИ при беременности находятся на достаточно высоком уровне. Если активность ПОЛ превышает физиологические потребности, то под влиянием «окислительного стресса» развивается мембранная патология. При сильных и стрессовых реакциях, когда активируется ПОЛ с фосфорилированием, индуцируется аутока-талитическая деструкция мембран и хроматина. Основными повреждающими факторами становятся неэстерефицированные жирные кислоты, которые накапливаются вследствие избыточного гидролиза фосфолипидов, а также лизофосфолипиды и продукты ПОЛ. В мембранах повышается содержание фосфолипидов с насыщенными жирными кислотами, жидкостность мембран уменьшается [9].
Одним из механизмов регуляции фосфолипидно-го состава, а значит, целостности структуры биологических мембран, является активация липолитических ферментов, главным образом, фосфолипазы А2. Изучение активности данного фермента у женщин основной группы показало увеличение содержания фосфолипазы А2 на протяжении всего периода гестации (табл. 1). Под влиянием фосфолипазы А2 образуются довольно токсичные жирные кислоты (арахидоновая кислота) и еще более агрессивные лизоформы. Накопление лизофосфатидилхолина (Lpc) в мембране эритроцитов приводит к заметным нарушениям формы клетки и стабильности мембран вплоть до гемолиза эритроцитов [9]. Доказательством данного суждения служило выявленное повышение содержания Lpc в мембране эритроцитов женщин основной группы в I триместре на 71 % (p < 0,001), во II триместре - на 59 % (p < 0,001) и в III триместре - на 51 % (p < 0,001), по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (табл. 1). Увеличение содержания Lpc, обладающего мембранотоксическим действием, способствует разрыхлению гидрофобной области липидного слоя мембраны эритроцитов.
К выявленным изменениям состава фосфоли-пидов у беременных с ЦМВИ относится повышение процентного содержания сфингомиелина (Sph) в I триместре на 16 % (p < 0,001), во II и в III триместрах -на 9 % (p < 0,001), по сравнению с контролем (табл. 1).
При определении минорных фракций фосфоли-пидов обращала на себя внимание выявленная тенденция к увеличению содержания Pi на протяжении всего периода гестации, по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (табл. 1). Согласно
литературным данным, снижение содержания Pi в структуре мембран может происходить вследствие его большего расходования в качестве предшественника вторичного мессенджера внутриклеточных процессов - диацилглицерола [1], а также деградации в результате усиления ПОЛ полиненасыщенных жирных кислот, которыми богат данный фосфолипид [5].
Изучая содержание фосфатидилсерина (Ps) в мембране эритроцитов женщин основной группы, мы выявили повышение концентрации данного фосфолипида в I триместре на 46 % (p < 0,001), во II триместре - на 33 % (p < 0,01) и в III триместре - на 101 % (p < 0,001), по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (табл. 1).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что обострение хронической ЦМВИ в период беременности сопровождается активацией процессов ПОЛ, увеличением содержания фосфолипазы А2, изменением состава фосфолипид-ных компонентов и их структурной организацией и проявляется снижением содержания Pe, Pe, Pi при увеличении концентрации Lpc, Sph, Ps. Выявленные изменения в мембране эритроцитов могут явиться существенным фактором нарушения деформируемости клеток, гемолиза эритроцитов, увеличения микровязкости крови, а следовательно, могут быть причиной развития внутриутробной гипоксии плода. Нарушение фосфолипидного состава мембраны эритроцитов у беременных вносит определенный вклад в патогенез ЦМВИ.
ЛИТЕРАТУРА REFERENCES
1. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембранология. - Петрозаводск: Изд-во КарНЦ РАН, 2006. - 226 с.
Boldyrev AA, Kyajvyaryajnen EI, Ilyukha VA (2006). Biomembranology [Biomembranologija], 226.
2. Ишутина Н.А. Антиокислительная активность олеиновой кислоты у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - № 1. -С. 25-28.
Ishutina NA (2013). Antioxidant activity of oleic acid in pregnant women with herpes virus infection [Antiokislitel'naja aktivnost' oleinovoj kisloty u bere-mennyh s gerpes-virusnoj infekciej]. Bjul. VSNC SO RAMN, 1, 25-28.
3. Ишутина Н.А., Дорофиенко Н.Н. Пероксидация липидов при беременности, осложненной цитомега-ловирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2014. - № 54. - С. 66-69.
Ishutina NA, Dorofienko NN (2014). Lipid peroxidation at the pregnancy complicated by cytomegalovirus infection [Peroksidatsiya lipidov pri beremennosti, os-lozhnennoy tsitomegalovirusnoy infektsiey]. Bjulleten' fiziologii i patologii dyhanija, 54, 66-69.
4. Тонкослойная хроматография / пер с англ. Ю. Кирхер. - М.: Мир, 1981. - С. 52-115.
Kirkhner Y (transl.) (1981). Thin layer chromatography [Tonkoslojnaja hromatografija], 52-115.
5. Коновалова Т.Т., Смирнова И.П. Роль липидов в структурно-функциональной организации клеточных мембран при атеросклерозе и их коррекция у больных ишемической болезнью сердца // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2005. - Т. 55, № 6. - С. 8-14.
Konovalova TT, Smirnova IP (2005). The role of lipids in the structural and functional organization of cell membranes at atherosclerosis and their correction in patients with coronary heart disease [Rol' lipidov v struk-turno-funkcional'noj organizacii kletochnyh membran pri ateroskleroze i ih korrekcija u bol'nyh ishemicheskoj bolezn'ju serdca]. Sibirskij medicinskij zhurnal (Tomsk), 55 (6), 8-14.
6. Литвицкий П.Ф. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при его регионарной ишемии и последующем возобновлении коронарного кровотока // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2002. - № 2. - С. 2-12.
Litvitskiy PF (2002). Pathogenic and adaptive changes in heart at the regional ischemia and further resumption of coronary blood flow [Patogennye i adaptivnye izmenenija v serdce pri ego regionarnoj ishemii i posledujushhem vozobnovlenii koronarnogo krovotoka]. Patologicheskaja fiziologija i jeksperimental'naja terapija, 2, 2-12.
7. Луценко М.Т., Довжикова И.В., Соловьева А.С., Андриевская И.А., Ишутина Н.А. Фетоплацентарная система при герпесной инфекции. - Благовещенск, 2003. - 200 с.
Lutsenko MT, Dovzhikova IV, Solovyova AS, An-drievskaya IA, Ishutina NA (2003). Fetoplacental system at herpes infection [Fetoplacentarnaja sistema pri gerpesnoj infekcii], 200.
8. Реброва Т.Ю., Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А. Особенности фосфолипидного состава мембран эритроцитов в условиях постинфарктного кардиосклероза // Сибирский медицинский журнал (Томск). -2011. - Т. 26, № 1-1. - С. 131-133.
Rebrova TY, Kondratyeva DS, Afanasyev SA (2011). Features of phospholipid composition of erythrocyte membranes at postinfarction cardiosclerosis [Osobennos-ti fosfolipidnogo sostava membran jeritrocitov v uslovijah postinfarktnogo kardioskleroza]. Sibirskij medicinskij zhurnal (Tomsk), 26 (1-1), 131-133.
9. Туркина Т.И., Семыкин С.Ю., Капустина Т.Ю. Мартыновский Д.В., Мутовин Г.Р. Метаболические аспекты патологии эритроцитарных мембран у детей, больных муковисцидозом // Педиатрия. - 2010. -Т. 89, № 4. - С. 36-39.
Turkina TI, Semykin SY, Kapustina TY, Martynovs-kiy DV, Mutovin GR (2010). Metabolic aspects of pathology of erythrocyte membranes in children with cystic fibrosis [Metabolicheskie aspekty patologii jeritrocitarnyh membran u detej, bol'nyh mukoviscidozom]. Pediatrija, 89 (4), 36-39.
10. Folch J, Lees M, Sloane GH (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animals tissues. Biology Chemistry, 226, 497-509.
Сведения об авторах Information about the authors
Ишутина Наталия Александровна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания (675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22; тел.: 8 (4162) 77-28-16 (рабочий); e-mail: [email protected])
Ishutina Nataliya Alexandrovna - Doctor of Biological Sciences, Leading Research Officer of the Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration (675000, Blagoveshchensk, ul. Kalinina, 22; tel.: +7 (4162) 77-28-16; e-mail: [email protected])
