CC BY
48
© МАЛИНОВСКАЯ Н.А., САЛМИНА А.Б., КАРАЧЕВА А.А., САЛМИН В.В., ЛОПАТИНАО.Л., СОКОЛОВИЧА.Г., СТЕПАНЕНКОА.В., ПЕРЬЯНОВАО.В., ЗЫКОВАЛ.Д. - 2007
РОЛЬ НАД+-ГЛИКОГИДРОЛАЗЫ В МОДУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ ПРИ ПЕРИТОНИТЕ
Н.А. Малиновская, А.Б. Салмина, А.А. Карачева, В.В. Салмин, О.Л. Лопатина, А.Г. Соколович,
А.В. Степаненко, О.В. Перьянова, Л.Д. Зыкова
(Красноярская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. И.П. Артюхов, кафедра биохимии с курсами медицинском, фармацевтической и токсикологической химии, зав. — д.м.н., проф. А.Б. Салмина, кафедра биологии с курсомфармакогнозии, зав. — д.б.н., проф. Т.Я. Орлянская, кафедра хирургических болезней № 2, зав. — д.м.н., проф. А.Г. Соколович, кафедра микробиологии.зав. — к.б.н., доц. О.В. Перьянова, кафедра патологической анатомии, зав. — д.м.н., проф. Л.Д. Зыкова; ГОУ ВПО СФУ, ректор — д.б.н., проф. Е.А. Ваганов, кафедра квантовой электроники, зав. — д.ф-м.н., проф. А.С. Проворов, Красноярск)
Резюме. Цель исследования — изучить роль НАД+-гликогидролазы в модуляции функциональной активности макрофагов при остром экспериментальном перитоните. Получены данные, свидетельствующие о возрастании активности АДФ-рибозилциклазы и функциональной активности макрофагов при перитоните, что сопровождается увеличением числа CD38+ макрофагов и изменением субклеточной локализации фермента. Обсуждается роль CD38-ассоци-щюванных механизмов в регуляции функциональной активности макрофагов при воспалении.
Ключевые слова: перитонит, перитонеальные макрофаги, функциональная активность, метаболизм НАД+, CD38/ НАД+-гликогидролаза.
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) играет роль переносчика электронов, функционируя в качестве кофермента, является важным компонентом и регулятором сигнальных путей, модулирует пролиферацию, апоптоз и функционирование клеток иммунной системы, изменяет стабильность клеточных мембран, участвует в ионном гомеостазе, репарации ДНК. НАД+ может служить субстратом для синтеза внутриклеточных регуляторных молекул. Среди ферментов, контролирующих уровень НАД+, наибольшее внимание уделяется полиАДФ-рибозилполимеразам (РАКР8), ДДФ-рибозилтрансферазам (АЯТ8) и СВ38/НДД+-гликогид-ролазе [9,10].
CD38/НДД+-гликогидролаза — трансмембранный гликопротеид II типа (45 кВа), проявляющий бифункциональную — ДДФ-рибозилциклазную и циклоДДФ-рибозилгидролазную — активность. ДДФ-рибозилцик-лазная активность зависит от множества факторов: пластичности конформации и локализации фермента (ци-топлазматическая мембрана, цитозоль), структуры каталитического центра и внутриклеточного уровня ДТФ и НДД+/НДДН клетки [10].
Циклическая ДДФ-рибоза, продукт метаболизма НДД+, является мощным кальций-мобилизующим вторичным посредником, высвобождающим его из внутриклеточных депо путем активации внутриклеточных рианодиновых рецепторов [4].
Известно, что СВ38 экспрессируется на метаболически активных моноцитах. Дифференцировка моноцитов до макрофагов ведет к снижению экспрессии СВ38. Это снижение экспрессии коррелирует с уменьшением активности НДД+-гликогидролазы, что служит индикатором подавления функциональной активности СВ38 в течение процесса дифференцировки [6].
Ключевым фактором, определяющим функциональную активность макрофагов, является НДД(Ф)Н-оксидаза, трансмембранный белковый комплекс, активность которого регулируется уровнем внутриклеточного кальция, состоянием белков цитоскелета и другими факторами [1,5].
Цель настоящего исследования — изучить роль НДД+-гликогидролазы в модуляции функциональной
активности перитонеальных макрофагов мышей при остром экспериментальном перитоните.
Материалы и методы
Объект исследования — белые беспородные мыши-самцы массой 18-20 г, содержащиеся в стандартных условиях вивария, с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Испытуемые животные были распределены на 2 группы: 1) контрольная (n=15); 2) экспериментальная (n=15).
Экспериментальная модель перитонита выполнялась по методике M. Thakker и соавт. [7] с модификациями: инъекции производились анестезированным животным при соблюдении правил асептики, интраперитонеально вводили 1 мл суточной бульонной культуры инактивированного теплом St. aureus (штамм 209Р) без отмывания от среды при бактериальной концентрации 5х1010 /мл.
Выделение макрофагов осуществляли через 48 часов после моделирования перитонита, мыши умерщвлялись цервикальной дислокацией спинного мозга в шейном отделе. Извлечение перитонеальных макрофагов (ПМ) осуществляли в асептических условиях путем перфузии брюшной полости охлажденным раствором Хенкса. ПМ отделяли от других клеток культивированием полученной клеточной взвеси в чашках Петри с использованием инакти-вированной человеческой сыворотки.
Детекцию экспрессии CD38 проводили с помощью им-муноцитохимического анализа с использованием моно-клональных антител к CD38 (Caltag Laboratories, США) по стандартной методике. Оценка ферментативной активности АДФ-рибозилциклазы осуществлялась флуориметри-ческим методом согласно R.M. Graeff и соавт. [3].
Функциональная активность макрофагов, оцениваемая по кинетике аутофлуоресценции, определялась спектро-флуориметрически по оригинальной методике. Модуляция макрофагальной активности осуществлялась непосредственно перед регистрацией кинетики аутофлуоресценции субстратом CD38 — никотинамидадениндинуклеотидом (10 мкМ и 1 мМ).
Статистический анализ полученных результатов включал методы описательной статистики и проверки статистических гипотез с использованием программы StatPlus 2006 Professional 3.9.0.0 и пакета анализа MS Excel 2002. В пределах каждой выборки определяли нормальность распределения, дисперсию, среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью Т-теста (гетеро- или гомоскедастического) или теста Манна-Уитни. Проводились линейные корреляции Пирсона (r) или ранговые корреляции Спирмена (R). Все результаты представлены в виде M±m, где М — среднее значение, m — ошибка среднего, p — уровень значимости.
Результаты и обсуждение
Иммуноцитохимическая детекция CD38 в чистой популяции перитонеальных макрофагов (свыше 90%
клеток макрофагальной природы) выявила иммунопо-зитивный материал с примембранной и цитоплазмати-ческой локализацией (рис. 1). Количество CD38-эксп-рессирующих макрофагов в контрольной группе животных составило 3,3+0,73% (п=15), тогда как в опытной группе было достоверно (р< 0,001) выше — 12,9+1,23% (п=15, рис. 1). Интересно, что в контрольной группе животных чаще наблюдалась примембранная локализация антигена CD38, тогда как при перитоните в 100% случаев была обнаружена диффузная цитоплазматичес-кая локализация этого антигена.
№
Рис. 1. Экспрессия CD38 на макрофагах (10х45). CD38-позитивные клетки с примембранной (а) и диффузной цитоплазматической (б) локализацией антигена: а - контроль, б -перитонит.
Обнаружено, что АДФ-рибозилциклазная активность CD38 в контрольной группе (0,004+0,0006 ед/мкг ткани/мин), была значимо (р= 0,05, п=8) ниже, чем в экспериментальной (0,020+0,0018 ед/мкг ткани/мин). Выявлена сильная отрицательная (г= -0,84) корреляция между экспрессией и АДФ-рибозилциклазной активностью CD38 в контрольной группе.
Развитие острого экспериментального перитонита сопровождалось 10-кратным увеличением функциональной активности макрофагов (0,014+0,0008 отн. ед. — в контрольной, 0,142+0,0073 отн. ед. — в экспериментальной группе; р< 0,001, п=7).
Рис. 2. Воздействие внеклеточного НАД+ на функциональную активность (отн. ед.) перитонеальных макрофагов мышей.
При применении субстрата НАД+-гликогидролазы — НАД+ выявлено, что значимые однонаправленные изменения функциональной активности макрофагов у животных контрольной и экспериментальной групп вызвали обе концентрации НАД+ (рис. 2). В контрольной группе воздействие 10 мкМ НАД+ вызвало повышение функциональной активности макрофагов до 0,137+0,0157 отн. ед., 1 мМ НАД+ - до 0,237+0,0287 отн. ед. (р<0,001, п=7). Обнаружено достоверное влияние (р < 0,05, п=7 для 10 мкМ НАД+ и р<0,01, п=7 для 1 мМ) НАД+ на активность макрофагов в экспериментальной группе (10 мкМ: 0,356+0,0686 отн. ед., 1 мМ: 0,277+0,0336 отн. ед.).
Полученные результаты свидетельствуют о роли CD38/НДД+-гликогидролазы в регуляции функциональной активности макрофагов при воспалении. Наши данные дают право говорить об однонаправленном повышении экспрессии CD38, усилении активности ДДФ-рибозилциклазы и функциональной активности макрофагов. При этом наблюдалось не только повышение количества CD38-экспрессирующих клеток, но и изменение субклеточной локализации CD38.
Известно, что часть клеток, экспрессирующих CD38 на поверхности цитоплазматической мембраны, обладает способностью метаболизировать НДД+ и транспортировать цДДФ-рибозу внутрь клетки [8]. Кроме того, возможно перемещение CD38 внутрь клетки (НДД+-индуцированная интернализация), следующее за мембранной олигомеризацией [2]. Наблюдаемое нами изменение субклеточной локализации CD38 при воспалении, вероятно, способствует усилению ДДФ-рибозилциклазной активности, поставляя цДДФ-рибо-зу ближе к мишеням — рианодиновым рецепторам, минуя этап транспортировки цДДФ-рибозы внутрь клетки.
Результаты свидетельствуют о влиянии внеклеточного НДД+ на активацию макрофагов в контрольной и экспериментальной группах, причем в экспериментальной группе наблюдается эффект насыщения. Этот эффект, вероятно, связан со снижением чувствительности к НДД+ активных макрофагов (при воспалении) в сравнении с интактными.
Таким образом, при перитоните однонаправлено усиливаются экспрессия CD38, ДДФ-рибозилциклаз-ная активность и функциональная активность макрофагов. Полученные нами данные свидетельствуют о важности CD38-опосредованной внутриклеточной сигнализации в регуляции функциональной активности макрофагов в норме и при воспалении.
THE ROLE OF NAD+-GLYCOHYDROLASE IN MODULATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF MICE PERITONEAL MACROPHAGES IN PERITONITIS
N.A. Malinovskaya, A.B. Salmina, A.A. Karacheva, V.V. Salmin, O.L. Lopatina, A.G. Sokolovich, A.V. Stepanenko, O.V. Peryanova, L.D. Zykova (Krasnoyarsk State Medical Academy)
We studied the role of NAD+-glycohydrolase in modulation of functional activity of macrophages in acute experimental peritonitis. Our main finding proves increasing activity of ADP-ribosyl cyclase and macrophages functional activity in peritonitis. We detected elevation of CD38+ macrophages and changes in cellular distribution of the enzyme in inflammatory zone. The role of CD38-associated mechanisms in regulation of macrophages activity in inflammation is discussed.
ЛИТЕРАТУРА
1. BabiorB.M. NADPH Oxidase: An Update // Blood. - 1999.
- Vol. 93, № 5. - P. 1464-1476.
2. De Flora A., Guida L., Franco L., Zocchi E. The CD38/cy-clic ADP-ribose system: A topological paradox // Int. J. Bio-chem. Cell. Biol. - 1997. - Vol. 29, № 10. - P.1149-1166.
3. Graeff R.M., Walseth T.F., Fryxell K. et al. Enzymatic synthesis and characterizations of cyclic GDP-ribose: A procedure for distinguishing enzymes with ADP-ribosyl cyclase activity // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269, № 48. -P.30260-30267.
4. LeeH.C, GraeffR, Walseth T.F. Cyclic ADP-ribose and its metabolic enzymes // Biochemie. - 1995. - Vol. 77, № 5.
- P.345-355.
5. Ly J.D., Lawen A. Transplasma membrane electron transport: enzymes involved and biological function // Redox Report - 2003. - Vol. 8, № 1. - P3-21.
6. Pfister M., Ogilvie A., Da Silva C.P. et al. NAD degradation
and regulation of CD38 expression by human monocytes/ macrophages // Eur. J. Biochem. — 2001. — Vol. 268. — P.5601-5608.
7. Thakker M., Park J.S., Carey V., Lee. J.C. Staphylococcus aureus Serotype 5 Capsular Polysaccharide Is Antiphagocytic and Enhances Bacterial Virulence in a Murine Bacteremia Model // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, № 11. -P.5183-5189.
8. Verderio C., Bruzzone S., Zocchi E. et al. Evidence of a role for cyclic ADP-ribose in calcium signalling and neurotrans-mitter release in cultured astrocytes // J. Neurochem. — 2001. - Vol. 78. - P.646-657.
9. ZieglerM. New functions of a long-known molecule: Emerging roles of NAD in cellular signaling // Eur. J. Biochem. -2000. - Vol. 267 № 6. - P.1550-1564.
10. Zocchi E, Usai C., Guida L. et al. Ligand-induced internalization of CD38 results in intracellular Ca2+ mobilization: role of NAD+ transport across cell membranes // FASEB J. - 1999. - Vol. 13. - P.273-283.
© ИГУМЕНЬЩЕВА В.В., ЮШКОВ Г.Г., ДАБАЕВ Н.Ж., ГУЩИНА А.А., АНДРОПОВА С.Н. - 2007
МАТЕРИАЛЫ К ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ДИЦИКЛОПЕНТАДИЕНА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА
В.В. Игуменьщева, Г.Г. Юшков, Н.Ж. Дабаев, А.А. Гущина, С.Н. Андропова (НИИ биофизики Ангарской государственной технической академии, директор — д.б.н. Ю.Н. Катульский)
Резюме. В статье представлены материалы исследований дициклопентадиена на лабораторных животных в целях выявления особенностей механизма его токсического действия для дальнейшего использования в научном обосновании гигиенических нормативов в объектах окружающей среды. Выявлены основные звенья биохимических повреждений на
fiовне баланса с проявлениями функциональных сдвигов на гигиенически значимых величинах доз и концентраций. тчевые слова: дициклопентадиен, токсикологические исследования.
Возможность вредного влияния химических веществ на здоровье человека с каждым днем становится все более очевидным предметом научных и даже политических дискуссий во всем мире, что стимулирует принятие новых законов, инструкций, указаний и рекомендаций, предусматривающих, в том числе, приемы сбора, анализа и оценки токсикологической информации для принятия решений о потенциальной и реальной опасности антропогенных загрязнений окружающей среды.
Попытка дополнить сегодняшние тенденции является актуальной и соответствует современной концепции развития профилактической токсикологии. В этой связи вопросы токсикологии отдельных соединений и их групп имеют отчетливый теоретический и практический интерес.
Дициклопентадиен (ДЦПД) является представителем циклических углеводородов; молекулярная масса 132,20. Существует в виде эндо- и экзо- изомеров. Промышленный продукт — эндо -изомер; бесцветные кристаллы с резким запахом; температура плавления — 32,50С, температура кипения — 172,80С; растворим в органических растворителях; растворимость в воде 2,5%. В нефтехимическом производстве ДЦПД получают из жидких продуктов пиролиза нефти и, учитывая значительные масштабы переработки бензинов, сырьевая база ДЦПД может достигать десятков и сотен тонн в год. Экспериментальными исследованиями установлено, что ДЦПД является высокотоксическим соединением для человека и животных [11-13]. Вместе с тем остаются неизученными некоторые обстоятельства, касающиеся биохимических механизмов токсического действия ДЦПД, выделения ведущего фактора в поражениях внутренних органов и систем, метаболизма в организме человека и животных [12]. Знание этих
механизмов способствовало бы решению проблемы патогенетической терапии, профилактики и диагностики отравлений этим веществом.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось продолжение экспериментальных работ в области изучения биохимических механизмов токсического действия циклических углеводородов, тем более что возможность неблагоприятного действия ДЦПД не исключается, т.к. он имеет перспективу широкого использования в химической и фармацевтической промышленности и контакт с ним очевиден. В частности, на основе ДЦПД синтезируются каркасные углеводороды ряда адаманта, применяющиеся для синтеза лекарств, пестицидов, красителей и др. [2,10].
Материалы и методы Для достижения поставленной цели при изучении общетоксического действия на животных использовали следующие показатели и методы; биохимические — определение активности ферментов крови (пероксидазы и катала-зы), определение электролитного баланса ионов натрия и калия в плазме и эритроцитах крови [1], определение содержания щелочной фосфатазы и общих липидов в плазме крови [4], гематологические — морфологический анализ периферической крови (содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов) [2,3].
Для установления параметров острой токсичности в 4-х часовых ингаляциях исследовали действие 8 концентраций ДЦПД на крысах-самцах массой 300 г. Ежедневно в течение 2-х недель регистрировали состояние животных и динамику их гибели. Статистическая обработка выполнена с помощью критерия Мана-Уитни в программе 81а11в11еа.
Результаты и обсуждение Поголовная гибель животных наблюдалась уже при воздействии ДЦПД в концентрации (^100 3810 мг/м3), среднесмертельная концентрация (^50 2750 мг/м3). Расчет проводили методом В.Б. Прозоровского. Гибель животных в основном наступала в течение 1 суток, реже на 2 и 3 сутки после воздействия. В картине острого отравления ДЦПД превалирующим явилось действия на
