CC BY
17
Раздел - молекулярная медицина
Роль молекулярно-генетического исследования при колоректальном раке (описание клинического случая)
Телышева Е.Н., Станоевич У.С., Снигирева Г.П.
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, г. Москва 117997, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86
Аннотация
В статье представлены результаты молекулярно-генетического исследования, проведенного на образцах ДНК опухолевой ткани и ДНК, выделенной из плазмы крови, больной с колоректальным раком. Показана прогностическая роль выявленных изменений в генах, участвующих в патогенезе колоректального рака.
Ключевые слова: колоректальный рак, молекулярно-генетические исследования, прогностические онкомаркеры, свободно-циркулирующая ДНК, NGS
Авторы
Телышева Екатерина Николаевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Станоевич Углеша Спасоевич - д.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела хирургии и хирургических технологий ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Снигирева Галина Петровна - д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Контактное лицо: Снигирева Г.П., тел.:+74953349288
e-mail: sni_gal@mail.ru
Role of molecular genetic studies in colorectal cancer (clinical case report)
Telysheva E.N., Stanoevich U., Snigireva G.P.
Federal state budgetary institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR) 117997 Moscow, Profsoyuznaya, 86
Abstract
The article presents results of a molecular-genetic study carried out on DNA samples of tumor tissue and DNA isolated from blood plasma of the patient with colorectal cancer. Prognostic role of the revealed changes in genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer is shown.
Keywords: colorectal cancer, molecular-genetic studies, prognostic tumor markers, cell-free DNA, NGS
Введение
Широкий спектр молекулярно-генетических нарушений, лежащих в основе канцерогенеза при колоректальном раке (КРР), определяет высокую пластичность клеток опухоли и их чувствительность к лекарственным препаратам и лучевой терапии. Детальное понимание регуляции отдельных звеньев сигнальных каскадов в клетках опухоли является одним из перспективных путей для разработки новых эффективных подходов к лекарственной терапии.
В последние годы молекулярно-генетические исследования становятся важной составляющей повседневного лечения онкологических больных. Наиболее примечательным результатом исследований в области клинической онкологии стало открытие мутаций, повышающих чувствительность к противоопухолевым препаратам.
Несмотря на существование множества различных маркеров, определяющих малигнизацию и опухолевую прогрессию, на сегодняшний день всего лишь несколько опухолевых биомаркеров изучены достаточно для того, чтобы применять их в клинической практике. Для эффективной оптимизации и индивидуализации лечения разнообразных онкологических заболеваний, в том числе и КРР, требуются новые молекулярно-генетические маркеры, а также простые не инвазивные методы, позволяющие идентифицировать мутации в генах-маркерах, приоритетных для индивидуализации лекарственной терапии. Один из таких методов - "жидкостная биопсия", основанная на исследовании выделенной из плазмы крови свободно-циркулирующей ДНК (сцДНК), которая может стать ценным инструментом исследования для диагностики, мониторинга и прогноза онкологических заболеваний [4, 5, 7].
Целью данного исследования было изучение мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе колоректального рака в ткани опухоли и в свободно-циркулирующей ДНК плазмы крови.
Материалы и методы
Исследование одобрено Этическим комитетом РНЦРР МЗ РФ и осуществлялось после подписания добровольного информированного согласия.
Больная М. с диагнозом «Рак поперечной ободочной кишки» T3N26M^, множественное билобарное поражение печени». В июле 2012 года в связи с угрозой непроходимости проведена операция в объеме резекции поперечно-ободочной кишки. Гистологическое заключение: умеренно-дифференцированная аденокарцинома. Опухоль инфильтрирует слизистую, подслизистую, мышечную оболочку и врастает в брыжейку. Прорастания серозной оболочки не обнаружено. Не обнаружено ангиолимфатической и периневральной инвазии. В 11 из 15 удаленных лимфоузлов обнаружены метастазы аденокрциномы.
В послеоперационном периоде проведено 4 курса адъювантной полихимиотерапии (ПХТ) по схеме FOLFOX, на фоне которой отмечена незначительная регрессия метастазов печени, в связи с чем проведено еще 4 курса химиотерапии по аналогичной схеме. При контрольном обследовании после 8 курсов ПХТ выявлено прогрессирование заболевания в виде появления метастазов в легких. Была назначена вторая линия ПХТ по схеме XELIRI + бевацизумаб, на фоне которой после 4-х курсов химиотерапии отмечена частичная регрессия метастазов печени и стабилизация метастазов легких. До прогрессирования (отмечен продолженный рост метастазов печени и легких) было проведено 10 курсов второй линии ПХТ. В качестве третьей линии ПХТ проведен 1 курс по схеме митомицин + бевацизумаб, однако состояние больной ухудшалось, нарастала картина печеночной недостаточности, на фоне которой через 20 месяцев от начала лечения больная скончалась.
Молекулярно-генетическое исследование было проведено на образцах ДНК, выделенных из опухолевого материала, хранящегося в формалин-фиксированных парафиновых блоках (FFPE), и содержащего не менее 60% опухолевых клеток, а также на образцах плазмы крови, взятой до и на 5-й день после хирургического лечения.
ДНК из опухолевой ткани выделяли коммерческими наборами DNA FFPE kit ("Qiagen", США) на колонках по стандартному протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем; из плазмы крови ДНК выделяли коммерческими наборами QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit ("Qiagen", США) на колонках по стандартному протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем.
Образец ДНК ткани опухоли был проанализирован методом мутационно-специфической ПЦР в режиме "реального времени" на наличие мутаций в генах RAS-каскада, а также методом высокопроизводительного секвенирования «нового поколения» (NGS) для анализа мутационного статуса генов, участвующих в патогенезе КРР. Всего было проанализировано 24 гена: KRAS, NRAS, BRAF, APC, TP53, SMAD2, SMAD4, FBXW7, PIK3CA, CTNNB1, TCF7L2, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, ATM, TGF-BR2, AKT1, DCC, DMD, CDC27,
CASP8, MAP2K4, MAP?. Образцы ДНК плазмы крови были также проанализированы методом NGS.
Для пробоподготовки библиотек из ДНК для анализа методом NGS использовали коммерческие наборы: GeneRead DNASeq Targeted Panel v2 Human Colorectal Cancer ("Qiagen", США); NEBNext Ultra DNA library Prep kit for Illumina (New England BioLabs"); NEBNext Multiplex Oligos for Illumina ("New England BioLabs"). Процесс пробоподготовки библиотек для анализа проводили по стандартному протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем.
Результаты и обсуждение
В ДНК ткани первичной опухоли обследованной больной М. методом мутационно-специфической ПЦР в режиме "реального времени" была выявлена мутация в 13-м кодоне 2-го экзона гена KRAS - p.G13D. Гены BRAF и NRAS характеризовались диким типом аллелей. Методом NGS были дополнительно выявлены изменения еще в четырех генах - SMAD4 (p.D537G), TP53 (p.R342*), APC (p.L1488FfsTer26) и ATM (p.S934N) . Все пять описанных мутаций были выявлены также и в образце сцДНК плазмы крови, взятой до операции, а в образце сцДНК плазмы крови после хирургического лечения были обнаружены только три варианта - мутации в генах KRAS (p.G13D), SMAD4 (p.D537G) и TP53 (p.R342*).
Ген KRAS является одним из наиболее важных онкогенов при КРР, участвующих в активации сигнального пути EGFR (RAS/RAF/МАРК), тесно связанным с пролиферацией опухолевых клеток. Доказано, что активация гена KRAS за счет мутации приводит к потере эффекта ингибирования EGFR моноклональными антителами. Мутации в гене KRAS ассоциированы с отсутствием положительного эффекта при анти-EGFR-терапии или даже с ухудшением состояния пациента, в то время как при отсутствии мутаций в гене KRAS замедляется прогрессия заболевания и увеличивается общая продолжительность жизни больного [8]. Согласно клиническим рекомендациям (ASCO, 2008), все пациенты с
метастатическим КРР, которым планируется терапия таргетными препаратами, направленными против EGFR, должны проходить тестирование на выявление мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS [6].
Ген SMAD4 также имеет потенциальное значение для прогнозирования ответа пациента на таргетную терапию. Существуют доказательства, что пониженные уровни экспрессии как белка, так и гена SMAD4, связаны с плохим клиническим прогнозом, а также с плохим ответом на терапию 5-фторурацилом, что свидетельствует о возможной роли гена SMAD4 как опухолевого супрессора [1]. Спорадические мутации в гене SMAD4, по данным разных исследований, которые, к сожалению, не многочисленны, присутствуют в 2,1-20% случаев КРР. Мутации в данном гене обычно являются поздним событием в патогенезе КРР и происходят в сочетании с другими нарушениями [9]. Мутация p.D537G присутствует в базах данных по онкологическим соматическим мутациям - COSMIC и cBioPortal. Клиническое и функциональное значение данного варианта для онкогенеза пока окончательно не подтверждено. Однако в базах есть мутация p.D537Y, изменения при которой происходят в той же точке последовательности, что и при p.D537G. Известно, что мутация p.D537Y является онкогенной, что позволяет предположить, что и мутация p.D537G является онкогенной.
Ген TP53 является опухолевым супрессором и часто мутирует в самых различных типах опухолей. Дикий тип гена TP53 действует как негативный регулятор роста опухолевых клеток. Существует множество доказательств, что большинство мутантных белков p53 являются гетерогенными онкогенными белками с множеством различных приобретенных функций и, следовательно, потенциальными терапевтическими мишенями [10]. Различные типы мутаций гена TP53 играют ключевую роль в определении таких признаков КРР, как глубина инвазии, метастатические локусы и даже прогноз заболевания. Вариант p.R342* -нонсенс-мутация, приводящая к появлению стоп-кодона и укороченного белка. Данная мутация указана в базах данных COSMIC и cBioPortal, как патогенная и вероятно
онкогенная, соответственно. Данный вариант является одной из "горячих точек" - мутаций, встречающихся наиболее часто при различных типах опухолей.
Ген APC, как и ген ТР53, является одним из ключевых опухолевых супрессоров и негативным регулятором проонкогенного WNT/p-катенинового сигнального пути; играет важную роль в таких процессах, как клеточная адгезия и миграция, формирование веретена и сегрегация хромосом в процессе деления клеток. Нарушение регуляции данных процессов, которое обусловлено мутациями в гене APC, непосредственно связано с инициацией и прогрессией рака толстой кишки [2]. Вариант p.L1488FfsTer26 - инсерция со сдвигом рамки считывания. Данный вариант описан в базе данных COSMIC, однако его клиническое и функциональное значение для канцерогенеза на сегодняшний день неизвестно. В базе данных cBioPortal мутация p.L1488FfsTer26 отсутствует, однако описаны варианты p.L1488FfsTer19 и p.L1488FfsTer23, которые отмечены как вероятно онкогенные при КРР.
Ген ATM играет важную роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, которые могут быть индуцированы ионизирующим излучением, химиотерапевтическими препаратами или окислительным стрессом, а также возникают во время нормальных физиологических событий, таких как мейотическая рекомбинация. Ген ATM кодирует связанную с PI3K серин/треониновую протеинкиназу, которая помогает поддерживать целостность генома [3]. Вариант S934N - миссенс-мутация, приводящая к замене серина на аспарагин в белковой цепочке. Данное изменение не описано в базах данных. Однако по результатам предсказательной программы PolyPhen данный вариант является доброкачественным и не влияет на функции белка.
Заключение
При анализе образца опухолевой ткани больной М. были выявлены молекулярно-генетические нарушения, характерные для патогенеза КРР. В 5 из 24 проанализированных генов методом NGS были выявлены мутации, приводящие к изменению структуры и
функции белков (онкогенов или опухолевых супрессоров) или их регуляторных элементов. Данные гены имеют потенциальное значение для предсказания ответа опухоли на таргетную терапию, а также для прогнозирования течения заболевания.
В качестве субстрата для анализа мутационного статуса, как показало данное исследование, можно использовать также сцДНК, выделенную из плазмы крови. Пять описанных мутаций были выявлены при анализе сцДНК плазмы крови, взятой до операции. Три из пяти соматических изменений были подтверждены также и в образце сцДНК плазмы крови, взятой на 5-й день после хирургического лечения. По факту наличия или отсутствия мутаций после проведенного лечения можно судить о степени агрессивности опухолевого процесса и о возможном прогрессировании заболевания. Анализ сцДНК плазмы крови, взятой после операции, также может играть роль дополнительного диагностического маркера, свидетельствующего о степени радикальности проведенной хирургической операции. Можно предположить, что у больных с выявленными мутациями очаги опухоли и метастазов были удалены не полностью или имелись метастазы, которые не были диагностированы ранее. Клиническая картина заболевания пациентки М. соответствует данным молекулярно-генетического анализа.
Список литературы
1. Кит О. И. , Водолажский Д. И. Молекулярная биология колоректального рака в клинической практике. Молекулярная биология. 2015. Т. 49. № 4. С. 531-540.
2. Armaghany T., Wilson J. D., Chu Q., Mills G. Genetic Alterations in Colorectal Cancer Gastrointest Cancer Res. 2012. V. 5. P. 19-27.
3. Choi M., Kipps T., Kurzrock R ATM Mutations in Cancer: Therapeutic Implications. Mol. Cancer Ther. 2016. V. 15. No. 8. P. 1781-1791.
4. Fleischhacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer - a survey. Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1775. No. 1. P. 181-232.
5. González-Masiá J. A., García-Olmo D., García-Olmo D. C. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology. Oncotargets and therapy. 2013. V. 6. P.819-832. doi: 10.2147/OTT.S44668.
6. Javle M., Hsueh C.T. Updates in Gastrointestinal Oncology - insights from the 2008 44th annual meeting of the American Society of Clinical Oncology. J Hematol Oncol. 2009. V. 2. P. 9. doi: 10.1186/1756-8722-2-9.
7. Ma M., Zhu H., Zhang C., et al. "Liquid biopsy" - ctDNA detection with great potential and challenges. Ann. Transl. Med. 2015. V. 3. No. 16: 235.
8. NCCN Guidelines Version 2.2017. Colon Cancer. Clinical Practice Guidelines in Oncology.
9. Sarshekeh A.M., Advani S., Overman J. M., et al. Association of SMAD4 mutation with patient demographics, tumor characteristics, and clinical outcomes in colorectal cancer. PLoS ONE. 2017. V. 12. No. 3. e0173345. doi: 10.1371/journal.pone.0173345. eCollection.
10. Soussi T., Wiman K. G. TP53: an oncogene in disguise. Cell Death Differ. 2015. V. 22. No. 8. P. 1239-1249.
