CC BY
27
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 578.427 ГРНТИ 34.25.29
РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ИЗУЧЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫХ ИНФЕКЦИЙ АНТАРКТИЧЕСКОГО КОНТИНЕНТА
А.Л. Панин1, В.Б. Сбойчаков1, А.Е. Гончаров2'3, Ш.Б. Тешебаев4, Л.А. Краева1, А.Б. Белов1, Д.Ю. Власов5
1Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург Россия, 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6
2Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова
Россия, 191015, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д.41
3Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины
Россия 197198 г. Санкт-Петербург, Большой проспект П.С., 13
4Научно-исследовательский институт Арктики и Антарктики
Россия, 199397, г. Санкт-Петербург, ул. Беринга, д. 38
5Санкт-Петербургский государственный университет
Россия, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7-9
Впервые представлены результаты изучения микробиоты в объектах окружающей среды, в тушках погибших птиц и в погадках пернатых хищников с уточнением видового состава, определение происхождения выделенных штаммов бактерий (местного или привнесенного происхождения) при помощи молекулярно-генетическихметодов исследований в период сезонных работ Российской антарктической экспедиции (РАЭ). Проведен целенаправленный поиск психрофилов (иерсиний) и других представителей энтеробактерий, потенциально имеющих эпидемиологическое значение. Изучен механизм сохранения условно-патогенных бактерий при их симбиотическом взаимодействии в цианобактериальных матах (ЦБМ), обычных лишь в экстремальных условиях. Показана приуроченность матов на территориях орнитогенного и антропогенного загрязнения, где создаются условия появления возбудителей природно-очаговых инфекций.
Ключевые слова: молекулярно-генетические исследования бактерий прибрежной Антарктиды, цианобак-териальные маты, иерсинии.
ROLE OF MOLECULAR AND GENETIC RESEARCH IN THE STUDY OF TICK-BORNE INFECTIONS AGENTS ON THE ANTARCTIC CONTINENT
A.L. Panin, V.B. Sboychakov, A.E. Goncharov, S.B. Teshebayev, L.A. Kraeva, A.B. Belov, D.Yu. Vlasov
1 Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg Russia, 194044, St. Petersburg, ul. Akademika Lebedeva, 6 2Mechnikov Northwest State Medical University Russia, 191050, St. Petersburg, ul. Kirochnaya, d. 41 3Research Studies Institute for Experimental Medicine Russia, 197198, St. Petersburg, Bol'shoy Prospekt P.S., 13 4Arctic and Antarctic Research Studies Institute Russia, 199397, St. Petersburg, ul. Beringa, d. 38 5St. Petersburg State University
Russia, 199034, St. Petersburg, Universitetskaya nab. d. 7-9
© А.Л. Панин, В.Б. Сбойчаков, А.Е. Гончаров, Ш.Б. Тешебаев, Л.А. Краева, А.Б. Белов, Д.Ю. Власов, 2016
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2016. № 4 (22)
The studies of the microbiota in the environment, in dead birds and their waste products with the analyses of microbial structure, determination of the origin of the bacterial strains were conducted for the first time by molecular and genetic research methods during the seasonal work of the Russian Antarctic Expedition (RAE). The main attention was given to the search of psychrophilic microorganisms (Yersinia) and other members of the Enterobacteriaceae with potential epidemiological significance. The mechanism of preservation of pathogenic bacteria in cyanobacteriemic mats (CBM) was studied. The authors show the confinedness of CBM connected with the areas of ornithogenic and anthropogenic pollution where there are the favourable conditions for focal infections agents.
Keywords: molecular and genetic studies of bacteria in coastal Antarctica, microbial mats, Yersinia.
Целью исследований, проводимых достаточно длительное время в период сезонных работ Российской антарктической экспедиции (РАЭ), являлось помимо изучения микробиоты в объектах окружающей среды, в тушках погибших птиц и в погадках пернатых хищников, уточнение видового состава, определение происхождения выделенных штаммов бактерий - местного или привнесенного происхождения. Учитывая ограниченные возможности в экспедиции, проводили поиск только психро-филов (иерсиний) и других энтеробактерий, потенциально имеющих эпидемиологическое значение. Изолированные условия Антарктиды дают уникальные возможности для изучения микробиоты, в том числе возбудителей природно-очаговых инфекционных болезней.
Отбор проб, их «полевой» этап анализа проводили по общепринятым методикам в бактериологической лаборатории научно-экспедиционного судна «Академик Фёдоров» в период сезонных работ 56 РАЭ и в стационарных условиях в Санкт-Петербурге. Из объектов внешней среды отбирали первичную почву (грунт), воду, тушки погибших взрослых и птенцов пингвинов, помёт птиц, погадки хищных пернатых (поморников), водные и сухопутные цианобактериальные маты (ЦБМ), а также близлежащую почву и воду, в которой они располагались. Посевы осуществляли при +26 оС 24-48 час на среде с бромтимоловым синим (СБТС) и среде Эндо. При обнаружении в пробах грамотрицательных палочек ставили тест на наличие у выделенных штаммов фермента оксидазы. Часть материала подвергалась «холодовому обогащению» в пептонно-калиевой среде при +4 оС с высевом на СБТС на 2-3 и 5-7 сутки. Перед посевом на среду Эндо и при исследовании загрязненных проб проводили щелочную обработку материала в течение 1-1,5 мин смесью 0,75 % КОН и 0,5 % КаС1 в полистироловых планшетах.
В стационарных условиях культуры подвергали биохимическому типированию с
помощью тест-систем MIKRO-LA-TEST. ПЦР-диагностику выполняли на амплификаторе Терцик MC-2+. Использовались технологии MALDI-TOF/MS и секвенирование амплифи-цированных фрагментов генов. Исследования проводили на приборе Bruker Daltonics. Результаты выдавались в виде масс-спектров и числовых значений. Вид бактерий автоматически определяли с помощью компьютерной программы на основании сверки полученных сигналов с имеющейся базой данных.
Для идентификации микроорганизмов, не идентифицированных при помощи MALDI-TOF/MS, было проведено секвенирование ам-плифицированных фрагментов генов 16S rDNA с использованием специфических прай-меров.
Результаты. Всего в ходе микробиологических работ 56 РАЭ было изолировано 198 штаммов бактерий. При выделении психрофи-лов получено значительное количество бактерий рода Pseudomonas: флуоресцирующие виды - P. putida, P. chlororaphis, P. oryzihabitans, P. fluorescens, P. luteola и нефлуоресцирующие виды - без видовой дифференциации -Pseudomonas spp.
Изолировано 8 штаммов иерсиний: 5 -Y. enterocolitica, 2 - Y. kristensenii и 1 -Y. aldovae. Часто встречались виды Burkholderia cepacia, а также другие условно-патогенные бактерии: Photorhabdus asym-biotica, Eikinella corroides, Kingella denitri-ficans, Achromobacter xylosus, Obesumbacterium proteus, Stenotrophomonas maltophilia. Реже изолировались: Alcaligenes faecalis, Acineto-bacter (A. lwoffii, A. haemolyticus), Brevun-dimonas vesicularis, Sutonella indologenes, Ochrobacterium anthropi, Comamonas terrigena, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloaceae, Citrobacter freundii, Oligella ureolytica, Tatumella plyseos, Serratia (S. marcescens, S. ficana, S. plymuthica, S. liquefaciens).
После проведения первичной идентификации классическими методами остались не-
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
опознанными 30 штаммов, которые в дальнейшем были изучены при помощи технологии MALDI-TOF/MS:. Идентифицированы 17 штаммов Serratia двух видов: S. liquefaciens и S. grimesii; 3 штамма Citrobacter freundii, 10 штаммов Lactobacillus.
Последовательности генов 16S rDNA у двух штаммов оказались на 95-97 % гомологичными c соответствующей последовательностью штамма Psychrobacter faecalis UCL-NF 1590 (GenBank № HQ698588.1). Полученные последовательности были депонированы в GenBank под номерами KJ398192 и KJ398193 соответственно.
Выделенный вид Psychrobacter faecalis является возбудителем госпитальной инфекции и вызывает пневмонию у больных с му-ковисцидозом. В то же время последовательность 16S-rDNA данного штамма, а также последовательности выделенных нами изоля-тов тесно кластеризуются с соответствующей последовательностью штамма Psychrobacter faecalis DSM 14664, идентифицированного в пробах фекалий пингвинов и Psychrobacter faecalis hiss 34 из глубоководных морских отложений. Имеющиеся различия среди полученных образцов сиквенсов с доступными референтными последовательностями позволяют предположить, что выделенные культуры психробактеров являются эндемичными для Антарктики, что в доступной литературе не было отмечено. Причем один штамм получен из почвы колонии пингвинов Адели на острове Хасуэлл, в 2,5 км от научной станции «Мирный», второй - из материала от кальмаров, которыми могут питаться пингвины. Можно предположить наличие трофической цепочки в циркуляции данных условно-патогенных бактерий.
Обсуждение. Антарктика является довольно изолированным от остального мира региональным местообитанием микробиоты. Благодаря этому теплокровные виды животных, обитающих в данных условиях, не имеют контакта с обладающими медицинским значением сообществами микроорганизмов, не развиваются вместе с ними, что приводит к отсутствию эффективной иммунной защиты от их воздействия. Доказательством таких случаев являются зафиксированные немногочисленные случаи массовой гибели диких живот-
ных, причиной которых однозначно являются инфекционные заболевания.
Важным фактором, который может закрепить нахождение и распространение возбудителей природно-очаговых инфекций на территории Антарктики, является характерная особенность местной фауны, позволяющей противостоять экстремальным природно-климатическим условиям среды - наличие большого количества видов птиц и водных млекопитающих, живущих весьма плотными популяциями. Это обстоятельство позволяет им выживать, но дополнительно повышает вероятность передачи возбудителей инфекционных заболеваний внутри сообществ.
Следующей особенностью, лимитирующей развитие микробиоты континента, является относительно невысокая влажность и крайне низкая температура. Они оказывают негативное воздействие на представителей автохтонной микробиоты и препятствуют распространению привнесенных в данный регион микроорганизмов. Однако и в условиях холодных пустынь с постоянными сильнейшими стоковыми ветрами имеются механизмы защиты местной микробиоты. Таким весьма эффективным приспособлением являются ЦБМ, которые регулярно встречаются в так называемых оазисах, свободных от снежно-ледового покрытия летом и занимающих всего 2 % территории Антарктиды. По нашим наблюдениям, маты наиболее многочисленны в районах гнездования пернатых и вокруг поселений. Кроме водных, особый интерес представляют сухопутные ЦБМ, которые располагаются в низинах местности, по ходу пересыхающих ручьев и мелких озер, что на период короткого лета обеспечивает им достаточную влажность. Они хорошо закреплены на грунте, подстилающая неживая часть матов ими же и формируется. ЦБМ аккумулируют микробиоту и различные вещества из подстилающего грунта и воздуха. По их физико-химической характеристике, наличию и количеству микроорганизмов, в них обитающих, нами предложено давать характеристику орнитогенному и антропогенному загрязнению местности и территории научных станций и полевых баз РАЭ.
Глобальное изменение климата в сторону потепления с увеличением влажности и чрезмерное присутствие человека в особенно
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2016. № 4 (22)
ранимой местности оазисов, где процессы биологического самоочищения слаборазвиты, может привести к увеличению риска переноса возбудителей инфекций и к угрозе их появления.
Так, за последние годы количество людей на VI континенте значительно увеличилось. По данным Международной ассоциации антарктических туристических операторов и Совета управляющих национальных антарктических программ, за 2013-2014 гг. Антарктиду посетило 37 405 туристов и 4462 полярника. Причем они в основном посещали Антарктический полуостров и близлежащие острова, где природно-климатические условия более мягкие по сравнению с территорией остального материка, и район моря Росса. В данных регионах расположились десятки полярных объектов. На берегу моря Росса размещена одна из двух научных станций США - Мак-Мердо, которая представлена крупнейшим поселением, транспортным узлом и исследовательским центром Антарктики. Она обслуживает также научные объекты и исследовательские программы других государств. На этих территориях с большой долей вероятности могла иметь место интродукция новых патогенных организмов по аналогии внедрения инвазивных растений. Также необходимо уделять внимание профилактике антропогенного распространения потенциально патогенных микроорганизмов между прибрежными объектами и внутри континента.
Необходимо учитывать развитие у зимовщиков синдрома полярного напряжения в условиях хронического действия экстремаль-
ных климатогеографических факторов высоких широт, ускоряющего процесс истощения адаптивных резервов организма и приводящего к развитию каскада дезадаптивных расстройств. Развиваются полярная тканевая гипоксия, иммунная недостаточность, гиперкоагуляция крови, полиэндокринные рассройства, нарушение электромагнитного гомеостаза, регенераторно-пластическая недостаточность, психоэмоциональное напряжение и метеопатия. Эти факторы создают возможность развития инфекционной патологии при контакте даже с условно-патогенными бактериями.
Наряду с антропогенным источником интродукции микроорганизмов необходимо учитывать возможность их орнитогенного распространения. Это мигрирующие на длительные расстояния от Антарктики до других регионов гигантские буревестники, альбатросы, длиннохвостые крачки, полярные поморники и доминиканские чайки. Значение последних двух видов наиболее опасно, поскольку эти птицы тяготеют к обществу человека. Морские слоны и антарктические котики также относятся к мигрирующим видам животных, среди которых пока не зафиксированы случаи их массовой гибели.
Однако в Антарктике довольно сложно выстроить логическую эпидемиологическую цепочку и связать такие события воедино. Такие мероприятия не проводились вообще или осуществлялись в недостаточном объеме. Поэтому так важно использовать и развивать молекулярно-генетические исследования для выяснения источников инфекций на Антарктическом континенте.
