CC BY
89
Роль многоцветной проточной цитофлуориметрии в диагностике миелодиспластических синдромов
Ю.О. Давыдова, И.В. Гальцева, А.В. Кохно, Е.Н. Паровичникова
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4
Контакты: Юлия Олеговна Давыдова [email protected]
Миелодиспластические синдромы (МДС) — гетерогенная группа клональных заболеваний системы кроветворения, характеризуемых цитопениями, признаками дисмиелопоэза, высокой частотой аномалий кариотипа и риском трансформации в острые миелоидные лейкозы. Диагностика МДС требует комплексного подхода, но даже при выполнении цитологического, цитохимического, цитогенетического, молекулярно-генетического и гистологического исследований не всегда удается подтвердить диагноз. Многоцветная проточная цитофлуориметрия (МПЦ) — высокотехнологичный метод, часто применяемый в диагностике различных гематологических заболеваний. В течение последних лет активно проводится стандартизация МПЦ для оценки диспла-зии во всех ростках кроветворения при МДС. Многими исследовательскими группами были продемонстрированы высокие показатели чувствительности и специфичности этого метода, что свидетельствует о необходимости интеграции МПЦ в диагностические протоколы МДС.
Ключевые слова: миелодиспластические синдромы, проточная цитофлуориметрия, иммунофенотипирование, лабораторная диагностика
Для цитирования: Давыдова Ю.О., Гальцева И.В., Кохно А.В., Паровичникова Е.Н. Роль многоцветной проточной цитофлуориметрии в диагностике миелодиспластических синдромов. Онкогематология 2018;13(1)63—72.
DOI: 10.17650/1818-8346-2018-13-1-63-72
Multicolor How cytometry as a diagnostic tool in myelodysplastic syndromes
Yu.O. Davydova, I. V. Galtseva, A. V. Kokhno, E.N. Parovichnikova
National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyi Zykovskiy proezd, 125167Moscow, Russia
Myelodysplastic syndromes (MDS) are heterogeneous group of clonal hematological neoplasms characterized by cytopenias, sighs of dysplasia and high risk of transformation in acute myeloid leukemia. Diagnostics of MDS requires a comprehensive approach, but even when performing cytological, cytogenetic, molecular and histological studies, it is not always possible to establish a diagnosis. Multicolor flow cytometry (MFC) is a high-tech method, increasingly used in the diagnosis of various hematologic diseases. Over the last years, MFC is standardized for assessing of dysplasia in all cell compartments of the bone marrow. Many research groups have demonstrated high sensitivity and specificity of this diagnostic approach, which indicates the necessity of integration of flow cytometric study into diagnostic protocols of MDS.
Key words: myelodysplastic syndromes, flow cytometry, immunophenotyping, diagnostic tools
For citation: Davydova Yu.O., Galtseva I. V., Kokhno A. V., Parovichnikova E.N. Multicolor flow cytometry as a diagnostic tool in myelodysplastic syndromes. Onkogematologiya = Oncohematology 2018:13(1)63—72.
cv
ев
cv
Введение
Миелодиспластические синдромы (МДС) представляют собой гетерогенную группу клональных заболеваний системы крови, характеризуемых цитопениями, признаками дисмиелопоэза, высокой частотой аномалий кариотипа и риском трансформации в острые миелоидные лейкозы. Существуют рекомендации Европейского общества LeukemiaNet по выбору стандартных диагностических процедур и терапевтических подходов для взрослых больных с первичным МДС. Ведущими симптомами являются цитопении, к которым относятся анемия (при уровне гемоглобина <100 г/л), нейтропения (когда абсолютное число ней-трофилов <1,5 х 109/л) и тромбоцитопения (при ко-
личестве тромбоцитов <100 х 109/л). Базовые методы диагностики этих заболеваний — цитологическое, цитохимическое, гистологическое и цитогенетическое исследования костного мозга (КМ) [1].
К цитологическому критерию МДС относится дисплазия в более чем 10 % клеток одной или нескольких линий гемопоэза (эритрокариоциты, нейтрофилы и/или мегакариоциты). Однако признаки дисплазии встречаются и при многих других заболеваниях (например, хронических миелопролиферативных заболеваниях — МПЗ), при реактивных состояниях и вирусных инфекциях (гепатиты В и С, вирус Эпштейна—Барр, парвовирус В19), а также при лечении химиотерапев-тическими препаратами. Дизэритропоэз возникает
ев
- при мегалобластных анемиях, аутоиммунных, а также ^ некоторых наследственных заболеваниях, например
врожденной дизэритропоэтической анемии [2, 3]. 1- Цитогенетическое исследование КМ проводится
ej в обязательном порядке и имеет диагностический, прогностический и терапевтический аспекты. Однако цитогенетические аномалии встречаются только у 40— 50 % пациентов с МДС. К наиболее частным абер-о рациям относят del (5q), моносомию 7 или del (7q), 5 трисомию 8 и del (20q). Потеря Y-хромосомы также S обнаруживается нередко, однако эта аномалия часто jjj является возрастным феноменом и не всегда указыва-® ет на наличие клонального заболевания [4, 5]. z Гистологическое исследование трепанобиоптата по-
зволяет оценить клеточность КМ, состояние стромы, п наличие фиброза, морфологические признаки диспла-Е зии, количество и локализацию клеток с бластной морфологией (при иммуногистохимическом исследо-со вании). Гиперклеточность КМ с дефицитом зрелых о форм клеток в крови свидетельствует о неэффектив-¡^ ности гемопоэза при МДС, но встречается также при реактивных состояниях, МПЗ и анемическом синдроме. 2Е Сложными в диагностическом плане являются МДС с гипоплазией КМ, которая характеризуется клеточ-^ ностью, составляющей <20 % кроветворной ткани в ла-2 кунах трепанобиоптата КМ. В этом случае необходимо проводить дифференциальную диагностику с апласти -ш ческой анемией, гипопластическим вариантом остро-о го миелоидного лейкоза [6].
* Таким образом, диагностика МДС требует ком-
е плексного подхода, и даже при выполнении цитологического, цитохимического, цитогенетического и гистологического исследований может потребоваться дополнительный диагностический критерий, особенно при отсутствии цитогенетических аномалий и/или когда выявляется гипоплазия КМ [7]. Дифференциальная диагностика МДС с другими заболеваниями, протекающими с миелодисплазией, требует полного и тщательного обследования пациента, динамического наблюдения и повторных обследований [8, 9]. Многоцветная проточная цитофлуориметрия (МПЦ) клеток КМ введена в 2007 г. как дополнительный критерий при диагностике МДС [10].
В марте 2008 г. в Амстердаме состоялся первый международный семинар по стандартизации МПЦ в диагностике МДС. В нем принимали участие представители 18 университетов из Европы, работающих в рамках Европейского общества LeukemiaNet, а также эксперты из США и Японии [11]. В ходе последующих семинаров были пересмотрены и дополнены диагностические цитометрические критерии МДС [12—14].
Необходимо отметить, что не существует универсального цитометрического критерия, который бы позволял определить наличие МДС. Необходимо оценивать множество параметров в основных ком-партментах КМ: зрелом миелоидном (нейтрофилы, моноциты), эритроидном ростках и компартменте
ранних миелоидных и В-клеточных предшественников. Эти цитометрические стратегии базируются на интерпретации экспрессии поверхностных маркеров кластеров дифференцировки (CD). К ним относят повышенную или сниженную по отношению к референсным значениям интенсивность экспрессии антигенов, асинхронную экспрессию антигенов и экспрессию лимфоидных маркеров на миелобласт-ных клетках. Немаловажное значение имеет подсчет доли клеток, составляющих определенные клеточные компартменты (особенно для миелоидных и В-кле-точных предшественников) [15].
Скрининговая мини-панель для цитометрической диагностики миелодиспластического синдрома
В скрининговых целях согласно рекомендациям LeukemiaNet может быть использована панель, состоящая из минимального количества моноклональных антител (МКА) и позволяющая оценить 4 параметра. Данная шкала называется Ogata score, это первая разработанная система диагностики МДС методом МПЦ [16]. К параметрам Ogata score относятся:
1) доля СD34+ миелоидных клеток-предшественниц от всех CD45+ клеток КМ (в норме до 2 %);
2) доля СD34+ В-клеточных предшественников от всех СD34+ клеток (в норме не менее 5 %);
3) отношение экспрессии CD45 на лимфоцитах к СD34+ миелоидным предшественникам;
4) отношение параметра бокового светорассеяния (SSC) на нейтрофилах к лимфоцитам (рис. 1).
При отклонениях в 2 и более параметрах предполагается наличие МДС. Описанная шкала была использована в проспективном исследовании, где изучали 134 образца КМ пациентов с МДС низкого риска и 106 контрольных образцов КМ в 2 центрах — в Японии и Италии. Диагностическая чувствительность составила 65 % и 89 %, а специфичность — 98 % и 90 % для когорт пациентов из Японии и Италии соответственно.
Для клинического применения чувствительность этой шкалы недостаточна, и есть несколько аспектов, которые следует учитывать. Во-первых, в результате разведения периферической кровью образца КМ может быть недооценено количество миелоидных предшественников, кроме того, у некоторых пациентов с МДС на миелобластах антиген CD34 не экспресси-руется, что является иммунофенотипической аберрацией. Количество CD34+ В-клеточных предшественников варьирует в зависимости от возраста и может снижаться при реактивных состояниях. Необходимо также учитывать, что референсные интервалы для экспрессии CD45 на миелобластах и показателя SSC могут немного отличаться в зависимости от используемых флюорохромов и настроек приборов [17]. Для того чтобы результаты МПЦ были применимы в клинических целях, необходимо использовать расширенную панель МКА, которая бы позволяла исследовать
Рис. 1. Пример определения цитометрических параметров по шкале Ogata score в костном мозге здорового донора (а) и примеры аномалий у лиц с миелодиспластическим синдромом (б): 1 — доля CD34+ миелоидных клеток-предшественниц от всех CD45+ клеток (выделено красным); 2 — доля CD34+ В-клеточных предшественников (выделено синим) от всех CD34+ клеток; 3 — отношение экспрессии CD45 на лимфоцитах (выделено черным) к CD34+ миелобластам; 4 — отношение параметра бокового светорассеяния (SSC) на нейтрофилах (выделено голубым) к лимфоцитам (фото авторов)
Fig. 1. An example of cytometric parameters by Ogata score scale in the bone marrow of a healthy donor (a) and examples of anomalies in MDS patients (b): 1 — the proportion of CD34+ myeloid progenitor cells from all CD45+ cells (red); 2 — the proportion of CD34+ B-cell progenitors (blue) from all CD34+ cells; 3 — the ratio of CD45 expression on lymphocytes (black) to CD34+ myeloblasts; 4 — the ratio of the lateral light scattering parameter (SSC) on neutrophils (in blue) to lymphocytes (photo submitted by the authors)
cv
CS
cv
параметры, рекомендованные LeukemiaNet, представленные в табл. 1 [12, 13].
Далее нами будут рассмотрены иммунофеноти-пические аномалии, наиболее часто встречающиеся в различных клеточных компартментах.
Цитометрический анализ
незрелых миелоидных предшественников
Подсчет количества незрелых миелоидных предшественников крайне важен, поскольку является основной частью всех прогностических шкал. Обычно отмечается хорошая корреляция между количеством бластных клеток, подсчитанных цитологическим методом, и МПЦ. Иногда можно выявить заниженное количество незрелых предшественников в ходе цито-метрического анализа вследствие разведения КМ периферической кровью, и наоборот [18].
Для точного подсчета количества миелоидных клеток-предшественниц недостаточно использования только маркера CD45, так как в регионе CD45dimSSClow расположены также В-клеточные предшественники, монобласты, базофилы, эритробласты, плазмоцито-идные дендритные предшественники, а также гипо-гранулярные нейтрофилы при МДС. Это требует введения в анализ дополнительных МКА к антигенам CD34, CD117, CD19, CD123 и HLA-DR [13].
Важен не только подсчет миелоидных предшественников, но и изучение их иммунофенотипа. Часто при МДС снижается или отсутствует экспрессия CD34, CD117, CD45, CD38 и/или HLA-DR, хотя экспрессия CD34 и CD117 на аномальных клетках может быть также повышена, также возможна гомогенность распре-
деления этих антигенов [13]. В некоторых исследованиях отмечаются аномальное отсутствие CD13 и/или CD33, асинхронная экспрессия «зрелых» маркеров CD11b и CD15 на ранних CD34+ клетках [12, 19]. Также обнаруживается экспрессия лимфоидных маркеров на миелоидных предшественниках, однако частота их встречаемости варьирует в широких пределах: CD5 определяется только в 1,6—7 % случаев МДС, CD7 — в 3,5-30 %, CD2 - в 14 %, CD56 - в 35 %. При оценке аномальной экспрессии лимфоидных антигенов следует учитывать, что CD2, CD7 и CD56 присутствуют и на нормальных CD34+ предшественниках, но таких клеток немного [17, 20-24].
Цитометрический анализ гранулоцитарного ростка
Цитологические признаки дисплазии гранулоцитарного ростка выявляют у 60 % пациентов с МДС. К наиболее значимым морфологическим изменениям относят гипогрануляцию нейтрофилов, нарушение сегментации их ядер и повышение доли ранних форм гранулоцитов. Для идентификации нейтрофилов методом МПЦ в основном применяют сочетание маркера CD45 и параметра SSC, однако рекомендуется проводить еще и анализ антигенов CD64 и CD33 для более четкого разграничения гипогранулярных гранулоци-тов и моноцитов [25].
Метод МПЦ позволяет определить гранулярность нейтрофилов по соотношению параметра бокового светорассеяния SSC нейтрофилов к SSC лимфоцитов, получая индекс гранулярности. Когда по данным цитологического исследования количество гипогрануляр-ных нейтрофилов составляет менее 10 % (что является
а
Таблица 1. Параметры, рекомендованные для цитометрического исследования миелодиспластического синдрома Table 1. Cytometric parameters recommended for MDS
cv
CS
cv
Компартмент костного мозга Параметры Parameters
CD34+ миелоидные клетки-предшественницы CD34+ myeloid progenitor cells Доля от CD45+ клеток Proportion of CD45+ cells Экспрессия CD45, CD34, CD117, HLA-DR, CD13, CD33, CD38 Expression of CD45, CD34, CD117, HLA-DR, CD13, CD33, CD38 Асинхронная экспрессия CD11b, CD15 Asynchronous expression of CD11b, CD15 Нелинейная экспрессия CD5, CD7, CD19, CD56 Nonlinear expression of CD5, CD7, CD19, CD56
CD34+ В-клеточные предшественники CD34+ B-cell progenitors Доля от всех CD34+ клеток (с использованием CD19 и/или CD10) The proportion of all CD34+ cells (using CD19 and/or CD10)
Нейтрофилы Neutrophils Доля от CD45+ клеток Proportion of CD45+ cells Соотношение SSC нейтрофилов к SSC лимфоцитов The ratio of SSC neutrophils to SSC lymphocytes «Паттерны созревания» CD13 и CD11b; CD16 и CD11b; CD13 и CD16; CD15 и CD10 "Maturation patterns" of CD13 and CD11b; CD16 and CD11b; CD13 and CD16; CD15 and CD10
Моноциты Monocytes Доля от CD45+ клеток Proportion of CD45+ cells «Паттерны созревания» HLA-DR и CD11b; CD36 и CD14 «Maturation patterns» of HLA-DR and CD11b; CD36 and CD14 Экспрессии CD13 и CD33 CD13 and CD33 expression Экспрессия CD56 CD56 expression
Эритрокариоциты Erythrocaryocytes Доля от ядросодержащих клеток КМ The proportion of nucleated BM cells «Паттерны созревания» CD71 и CD235a "Maturation patterns" of CD71 and CD235a Экспрессия CD71 CD71 expression Экспрессия CD36 CD36 expression Доля CD117-позитивных предшественников Proportion of CD117-positive progenitors
критерием диагностики МДС согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения), данные МПЦ могут быть более информативными. Определение индекса гранулярности имеет высокую специфичность, а его снижение наиболее часто происходит именно при МДС [25].
К другим признакам дисплазии гранулоцитарного ростка относят изменение так называемых паттернов созревания (соотношение экспрессии 2 антигенов, которое меняется в зависимости от стадии созревания клетки). Наиболее часто при анализе гранулоцитов уделяют внимание 2 паттернам: CD16 и CD11b, CD13 и CD16 [15]. Впервые изменение паттерна CD16 и CD11b в КМ у пациентов с МДС по сравнению с группой здоровых доноров было описано в исследовании B.H. Davis и соавт. в 1997 г. У лиц с МДС отмечалось повышение доли гранулоцитов с низкой экспрессией CD16 и/или CD11b [26]. Другим значимым паттерном является соотношение CD13 и CD16. По мере созревания ней-трофилов появляется и нарастает экспрессия CD16,
в то время как экспрессия CD13 сначала снижается, а затем от стадии метамиелоцитов до сегментоядерных нейтрофилов вновь повышается. У пациентов с МДС количество клеток, иммунофенотипически соответствующих миелоцитам и метамиелоцитам, повышено, а число зрелых CD13+CD16+ нейтрофилов снижено (рис. 2). Ошибки при интерпретации данных о паттернах могут возникать в случае включения в гейт нейтрофилов эозинофилов, которые не экспрессируют CD16; нейтрофилы, претерпевающие апоптоз, также теряют CD16. Доказано, что у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией экспрессия CD16 на зрелых нейтрофилах отсутствует, так как этот антиген имеет гликозилфосфатидилинозитольный якорь; кроме того, у некоторых людей имеется генетический полиморфизм антигена CD16, что может ложно интерпретироваться как аномальное отсутствие данного маркера [15].
Еще один признак МДС — повышенная экспрессия антигена CD56 на нейтрофилах. При МДС данная аномалия встречается в 20—30 % случаев, при МПЗ — менее
->CD16
->CD16
Рис. 2. Паттерны созревания нейтрофилов CD13 и CD16; CD11b и CD16 при анализе костного мозга здорового донора (а) и лиц с миелодиспла-стическим сндромом (б и в). Стрелками указано повышение доли незрелых гранулоцитов по сравнению с донором (фото авторов) Fig. 2. Patterns of neutrophils maturation CD13 and CD16; CD11b and CD16 in the bone marrow of a healthy donor (а) and MDS patients (б and в). The arrows indicate an increase in the proportion of immature granulocytes in comparison with donor (photo submitted by the authors)
cv
CS
cv
чем в 20 %, но при идиопатическом миелофиброзе — до 37 % [27, 28]. Однако описано повышение экспрессии данного маркера на нейтрофилах при активации, а также на 10—25 % незрелых гранулоцитов при регенерации КМ [29]. Низкая экспрессия CD56 отмечается у пациентов после химиотерапии и трансплантации аллогенных стволовых клеток, и доля гранулоцитов, экспрессирующих CD56, составляет <10 % [28]. Таким образом, экспрессия молекулы адгезии CD56 на ней-трофилах может быть как признаком аномалии в данном компартменте, так и следствием воздействия полихимиотерапии или других причин.
Одним из цитометрических признаков дисграну-лоцитопоэза служит снижение экспрессии антигена CD10 (в норме экспрессируется на самых зрелых нейтрофилах). Частота встречаемости этого признака широко варьирует в разных исследованиях — от 11 % до 74 % в зависимости от применяемого референсного значения [30—32]. Сниженная экспрессия CD10 ассоциирована с повышенной восприимчивостью к инфекциям, так как этот белок играет важную роль в хемотаксисе и координации провоспалительных реакций. Снижение CD10 на нейтрофилах отмечено при аутоиммунной нейтропении [33], а также у пациентов с ВИЧ-инфекцией и расценивается как признак реактивного дисгранулоцитопоэза [34].
Более редкими аномалиями при МДС являются изменения в экспрессии антигенов CD33 и CD64,
появление HLA-DR, CD36 и CD14 на нейтрофилах. При МДС описывают в основном снижение экспрессии CD33 и CD64 на гранулоцитах, однако следует относиться к этим признакам с осторожностью, так как их экспрессия вариабельна и связана с генетическим полиморфизмом. Экспрессия CD36 повышается на нейтрофилах при апоптозе, а HLA-DR начинает экспрессироваться после применения гранулоцитар-ного колониестимулирующего ростового фактора [14, 15]. Экспрессия CD14 гранулоцитами выявлена у пациентов с 5q-синдромом [35].
Цитометрический анализ моноцитов
Цитологическая оценка дисплазии в моноцитах при верификации МДС не проводится. Однако при дифференциальной диагностике МДС с моноцитозом <1 х 109/л и хроническим миеломоноцитарным лейкозом (вариант МДС/МПЗ) следует обращать внимание на цитологические особенности моноцитов.
Идентификация моноцитов при МПЦ нередко производится только на основе анализа экспрессии маркера CD45 и параметра SSC. Однако, как было упомянуто ранее, при МДС могут встречаться нейтро-филы со сниженной гранулярностью, в этом случае их популяция «пересекается» с популяцией моноцитов, что диктует необходимость применения дополнительных маркеров, таких как CD33, CD45, CD14, CD36 [14].
а
б
в
cv
ев
cv
В ходе цитометрического анализа моноцитов необходимо оценить их долю от всех CD45+ клеток, паттерны HLA-DR и CD11b, CD36 и CD14, экспрессию антигенов CD13, CD33 и CD56. При МДС может встречаться как относительная моноцитопения (в 40 % случаев), так и моноцитоз (в 12 % случаев). Параметр SSC моноцитов, так же как и гранулоцитов, у пациентов с МДС может быть снижен. В большинстве случаев отмечается аномальное созревание моноцитов, выражающееся в аномальной экспрессии CD14, CD36, CD11b и HLA-DR (рис. 3). В 92 % случаев МПЦ позволяет обнаружить признаки дисмоноцитопоэза [25]. При оценке экспрессии CD14 на моноцитах нужно помнить, что данный белок связан с мембраной через гликозилфосфатидилинозитольный якорь, поэтому у пациентов c ПНГ экспрессия данного маркера снижена или может отсутствовать.
При МДС часто отмечают повышенную экспрессию CD56 на моноцитах, которая встречается также у лиц с МПЗ и/или МДС/МПЗ, в частности с хроническим миеломоноцитарным лейкозом. Кроме того, экспрессия CD56 на моноцитах может быть обусловлена инфекционными процессами и регенерацией КМ после химиотерапии, трансплантации аллогенных стволовых клеток крови [14].
Цитометрический анализ эритрокариоцитов
Морфологические признаки дизэритропоэза являются наиболее яркими и часто встречающимися. Они присутствуют при всех вариантах МДС и остаются единственными морфологическими признаками у пациентов с рефрактерной анемией (РА) и РА с кольцевыми сидеробластами. Однако цитометрическая оценка дизэритропоэза - непростая задача, так как проблематично точно выделить популяцию эритроидных предшественников, а маркеры, по которым можно оценить их аномальность, немногочисленны. Вследствие этого с 2007 по 2012 г. оценка компартмента эри-трокариоцитов имела лишь рекомендательный характер [13, 14], в 2014 г. были обозначены обязательные критерии цитометрического анализа эритрокариоцитов [12], но только в 2017 г. опубликованы первые практические результаты введения анализа эритрокариоци-тов в интегрированную оценку МДС методом МПЦ [36].
Первым важным моментом становится определение эритрокариоцитов методом МПЦ. Эритроидная популяция выделяется по слабой/негативной экспрессии CD45 и низким параметрам прямого и бокового светорассеяния. Однако в этот регион также попадают нелизированные эритроциты и клеточный дебрис.
а ^
а
CD lib
->CD14
Рис. 3. Паттерны созревания моноцитов HLA-DR и CD11b; CD36 и CD14 при анализе костного мозга здорового донора (а) и лиц с миелодиспла-стическим сндромом (б и в). Стрелками указаны аномалии в форме паттернов (фото авторов)
Fig. 3. Patterns of monocytes maturation HLA-DR and CD11b; CD36 and CD14 in the bone marrow of a healthy donor (a) and MDS patients (б and в). Arrows indicate anomalies in patterns form (photo submitted by the authors)
б
в
Используя антигены CD36, CD71, можно выделить эритрокариоциты более точно. В ходе нормального их созревания происходит постепенное снижение экспрессии CD45, повышение экспрессии CD235a. CD71 — один из самых ранних маркеров, который экспресси-руется в течение всего периода эритроцитопоэза, он остается на ретикулоцитах после энуклеации и перестает экспрессироваться только после деградации РНК. Таким образом, основываясь на экспрессии CD71, можно исключить из анализа все зрелые эритроциты [37]. Возможно введение в панель МКА нуклеотроп-ных красителей, например CyTRAK orange, DRAQ5, DRAQ7, которые позволяют отделить ядросодержа-щие предшественники от зрелых эритроцитов даже без проведения лизиса [37]. С другой стороны, в ходе ряда исследований показано, что проведение лизиса позволяет получить более точные количественные характеристики плотности экспрессии антигенов [38].
Согласно данным Европейского общества Leuke-miaNet цитометрическими признаками аномального эритрокариоцитопоэза могут быть: повышение доли CD117+ эритроидных предшественников, аномальная гетерогенная или сниженная экспрессии CD36 и CD71 и аберрантный паттерн CD71 и CD235a [12]. Анализ этой группы показателей способствует наилучшей дифференциальной диагностике МДС и неклональ-ных цитопений [39].
Цитометрические оценочные системы в диагностике миелодиспластического синдрома
Для диагностики МДС методом МПЦ необходимо исследовать многочисленные характеристики всех основных клеточных компартментов КМ. Эти параметры изучали в нескольких центрах, и на основе ретроспективного анализа были разработаны цитометрические оценочные шкалы, обладающие диагностической и прогностической значимостью. В 2003 г. P. Wells и соавт. из США предложили шкалу, где на основе числа ци-тометрических аберраций в компартменте нейтрофи-лов и моноцитов, а также количества миелобластов подсчитывали конечный балл (табл. 2). Суммарный балл от 0 до 1 классифицировался как минимальный, от 2 до 3 — как средний, >4 — как высокий. В данном исследовании приняли участие 115 лиц с МДС и 104 пациента контрольной группы без МДС и МПЗ. Никто из больных контрольной группы не набрал >2 баллов, однако у 55 % пациентов с МДС было получено 3 и более баллов [40].
Оценка по шкале Wells коррелировала с вариантом МДС по ВОЗ. У лиц с РА и РА с кольцевыми сидеро-бластами средний балл составил 3, с РА с мультили-нейной дисплазией — 4, с РА с избытком бластов — 6 [25]. Цитометрические баллы коррелировали с оценками по шкалам IPSS (International Prognostic Scoring System), WPSS (WHO-adjusted Prognostic Scoring System) и зависимостью от трансфузий. Медиана выживаемо-
Таблица 2. Цитометрическая шкала Wells Table 2. Cytometric Wells Scale
The main score
0 Отсутствие цитометрических аберраций Absence of cytometric aberrations
Одна аберрация или в гранулоцитах, или в моно-
1 цитах
One aberration in either granulocytes or monocytes
Одна аберрация и в гранулоцитах, и в моноцитах либо...
One aberration in both granulocytes and monocytes either.
2 Две или три аберрации или в гранулоцитах, или в моноцитах
Two or three aberrations, either in granulocytes or in monocytes
Четыре и более аберраций или в гранулоцитах,
3 или в моноцитах
Four or more aberrations, either in granulocytes or monocytes
Две или три аберрации и в гранулоцитах, и в мо-
4 ноцитах
Two or three aberrations in both granulocytes and monocytes
цельный балл
Сниженное миелоидно-лимфоидное соотношение (<1)
The decreased myeloid-lymphoid ratio (<1) + 1 Нормальное содержание миелобластов (<5 %) с цитометрическими аберрациями The normal content of myeloblasts (<5 %) with cytometric aberrations
Повышенное содержание аномальных +2 миелобластов (5—10 %)
Increased content of abnormal myeloblasts (5—10 %)
Повышенное содержание аномальных миелобла-+3 стов (11-20 %)
Increased content of abnormal myeloblasts (11-20 %)
Повышенное содержание аномальных миелобла-+4 стов (>20 %)
Increased content of abnormal myeloblasts (>20 %)
сти у пациентов с минимальным баллом по шкале Wells (0—1) не была достигнута, со средним баллом (2—3) составила 19 мес, с высоким баллом (4—9) — 6 мес [41].
В 2011 г. A. van de Loosdrecht и T. Westers была предложена объединенная диагностическая шкала с учетом баллов по скрининговой шкале Ogata и количества аберраций в компартментах нейтрофилов и моноцитов [17]. Эта шкала не включала аномалии в эритроидных клетках, а заключение по ней устанавливается в виде буквенного эквивалента. Оценка «А» означает, что по результатам анализа дисмиелопоэза методом проточной цитометрии признаков МДС не выявлено; «В» — что при цитометрическом исследовании
CV
CS
CV
cv
es
выявляются признаки, которые часто обнаруживаются при МДС, и «С» — результаты цитометрического исследования соответствуют МДС (табл. 3).
Эту шкалу применяли в исследовании (его результаты были опубликованы в 2016 г.) с участием 101 пациента с МДС и 51 пациента контрольной группы без диагноза МДС или МПЗ. Из когорты участников с МДС 15 % получили оценку «А», 24 % — «В» и 61 % — «С». Оценку «А», которая соответствовала отсутствию цитометрических аномалий, имели в основном лица с МДС с изолированными дисэритропоэзом и/или дисмегакариоцитопоэзом. При этом цитогенетические аберрации, типичные для МДС, выявлены только у 23 % пациентов, другие цитогенетические аномалии — у 21 % и нормальный кариотип — у 56 %. Таким образом, цитометрические аномалии при МДС встречались чаще, чем цитогенетические. В контрольной группе оценку «А» получили 65 % пациентов, «В» — 29 % и «С» — только 6 % [4].
В 2017 г. была разработана и апробирована интегрированная диагностическая шкала, которая включала аномалии в компартменте эритрокариобластов (табл. 4). Введение в шкалу анализа аномалий эритро-идного ряда позволило повысить чувствительность метода с 69 до 80 %, а специфичность незначительно снизилась — с 98 до 95 % [36].
Заключение
Диагностика МДС требует комплексного подхода, основанного на проведении цитологического, цитохимического, цитогенетического и гистологического исследований КМ. Во многих публикациях показано, что метод МПЦ может улучшить диагностику МДС, особенно в трудных случаях, когда результатов, полученных другими методами, недостаточно, однако пока что этот способ является лишь вспомогательным.
Не существует универсального цитометрического признака, который бы позволил уверенно определить
CV
Таблица 3. Объединенная шкала диагностики миелодиспластического синдрома методом многоцветной проточной цитофлуориметрии без учета аномалий в компартменте эритрокариоцитов
Table 3. The combined scale of MDS diagnosis by MFC without taking into account anomalies in the erythrocaryocytes compartment
Шкала Ogata <2 >2
S Ш Цитометрические аберрации в миелоидных предшественниках Cytometric aberrations in myeloid progenitors - - + + - - + +
Цитометрические аберрации: Cytometric aberrations:
в гранулоцитах (сниженный индекс гранулярности или 2 и более других аберраций)
in granulocytes (reduced granulation index or two or more other aberrations) в моноцитах (экспрессия CD56 или 2 и более другие аберрации) in monocytes (CD56 expression or two or more other aberrations)
Оценка Assessment
A A/B A/B C A/B B/C B/C C
+
+
+
+
Таблица 4. Интегрированная шкала диагностики миелодиспластического синдрома методом многоцветной проточной цитофлуориметрии с учетом аномалий в компартменте эритрокариоцитов
Table 4. The integrated scale of MDS diagnosis by MFC taking into account anomalies in the erythrocaryocytes compartment
Шкала Ogata Ogata scale <2 >2
Цитометрические аберрации в миелоидных предшественниках Cytometric aberrations in myeloid progenitors - - - - + + + + - - - - + + + +
Цитометрические аберрации: Cytometric aberrations: в гранулоцитах (>2 аберраций) in granulocytes (>2 aberrations) в моноцитах (экспрессия CD56 или >2 аберраций) in monocytes (expression of CD56 or >2 aberrations) - - + + - - + + - - + + - - + +
Цитометрические аберрации (>2) в эритрокариоцитах Cytometric aberrations (>2) in erythrocaryocytes - + - + - + - + - + - + - + - +
Оценка Assessment A B B C B C C C A/B C C C C C C C M
наличие МДС, и для полноценного исследования требуется провести оценку многочисленных параметров (экспрессию антигенов, их соотношения, нормальность паттернов созревания). Европейским обществом LeukemiaNet в течение нескольких лет проводится работа по стандартизации МПЦ в диагностике МДС.
В настоящее время определены оптимальные антигены и параметры, которые необходимо анализировать в основных клеточных компартментах КМ: ранних предшественниках, нейтрофилах, моноцитах и эритрокариобластах. Перспективным направлени-
ем дальнейшей работы является уменьшение вероятности возможных ошибок, связанных с отличиями в процессах пробоподготовки, выбора комбинаций МКА и стратегий гейтирования. Немаловажен поиск способов дальнейшего повышения чувствительности и специфичности метода МПЦ в диагностике МДС. Совершенствование цитометрических подходов позволит интегрировать метод МПЦ в диагностические протоколы МДС и тем самым улучшить первичную диагностику данного гематологического заболевания.
CV
CS
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Кохно А.В. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике
и лечению миелодиспластических синдромов взрослых (2015 г.). Гематология и трансфузиология 2016;61(1S(4)):1—32. [Savchenko V.G., Parovichnikova E.N., Kokhno A.V. et al. National clinical guidelines for the diagnosis and treatment of adult myelodysplastic syndromes (2015). Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2016;61(1S(4)):1-32 (In Russ.)]. DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-1.
2. Tefferi A., Vardiman J.W. Myelodysplastic Syndromes. N Engl J Med 2009;361(19):1872-85.
DOI: 10.1056/NEJMra0902908. PMID: 19890130.
3. Двирнык В.Н., Кохно А.В., Паровичникова Е.Н. Вторичный дисмиелопоэз у больных миелодиспластическими синдромами. Терапевтический архив 2014;86(7):97-103. [Dvirnyk V.N., Kokhno A.V., Parovichnikova E.N. Secondary dysmyelopoiesis in patients with myelodysplastic syndromes. Terapevticheskiy arkhiv = Therapeutic archive 2014;86(7):97-103 (In Russ.)]. PMID: 25314785.
4. Cremers E.M.P., Westers T.M., Alhan C. et al. Multiparameter flow cytometry
is instrumental to distinguish myelodysplastic syndromes from non-neoplastic cytopenias. Eur J Cancer 2016;54:49-56. D0I:10.1016/ j.ejca.2015.11.013.PMID: 26720403.
5. Soenen V., Preudhomme C., Roumier C. et al. 17p Deletion in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome. Analysis of breakpoints and deleted segments by fluorescence in situ. Blood 1998;91(3):1008-15. PMID: 9446663.
6. Ковригина А.М., Глинкина С.А., Байков В.В. Принципы патоморфоло-гической дифференциальной диагностики миелодиспластических синдромов. Клиническая онкогематология
2015;8(1):62-8. [Kovrigina A.M., Glinkina S.A., Baykov V.V. Principles of pathomorphological differential diagnosis of myelodysplastic syndromes. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical oncohematology 2015;8(1):62-8 (In Russ.)].
7. Della Porta M.G., Malcovati L., Boveri E. et al. Clinical relevance of bone marrow fibrosis and CD34-positive cell clusters
in primary myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol 2009;27(5):754-62. D0I:10.1200/JC0.2008.18.2246. PMID: 19103730.
8. Кохно А.В., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Миелодиспластический синдром. Клиническая геронтология 2009;15(3):33-46. [Kokhno A.V., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Myelodysplastic syndrome. Klinicheskaya gerontologiya = Clinical gerontology 2009;15(3):33-46. (In Russ.)].
9. Кохно А.В., Пименова М.А., Парович-никова Е.Н. и др. Выявление скрытых аномалий кариотипа при миелодиспла-стическом синдроме. Гематология
и трансфузиология 2014;59(1):25-8. [Kokhno A.V., Pimenova M.A., Parovichnikova E.N. et al. Detection of hidden karyotype anomalies in myelodysplastic syndrome. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2014;59(1):25-8 (In Russ.)].
10. Valent P., Horny H.P., Bennett J.M. et al. Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the myelodysplastic syndromes: Consensus statements and report from a working conference.
Leuk Res 2007;31(6):727-36. DOI: 10.1016/j.leukres.2006.11.009. PMID: 17257673.
11. Loken M.R., van de Loosdrecht A., Ogata K. et al. Flow cytometry
in myelodysplastic syndromes: Report from a working conference. Leuk Res 2008;32(1):5-17. DOI: 10.1016/ j.leukres.2007.04.020. PMID: 17576013.
12. Porwit A., van de Loosdrecht A.A., Bettelheim P. et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results
in the WHO classification of myelo-dysplastic syndromes-proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS. Leukemia 2014;28(9):1793-8. DOI: 10.1038/leu.2014.191. PMID: 24919805.
13. Westers T.M., Ireland R., Kern W. et al. Standardization of flow cytometry
in myelodysplastic syndromes: a report from an international consortium and the European LeukemiaNet Working Group. Leukemia 2012;26(7):1730-41. DOI: 10.1038/leu.2012.30. PMID: 22307178.
14. van de Loosdrecht A.A., Alhan C., Bene M.C. et al. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from the first European Leukemia-Net working conference on flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Haematologica 2009;94(8):1124-34. DOI: 10.3324/haematol.2009.005801. PMID: 19546437.
15. Aanei C.M., Picot T., Tavernier E. et al. Diagnostic Utility of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes.
Front Oncol 2016;6:161. DOI: 10.3389/fonc. 2016.00161. PMID: 27446807.
16. Ogata K., Kishikawa Y., Satoh C. et al. Diagnostic application of flow cytometric characteristics of CD34+ cells in low-grade myelodysplastic syndromes. Blood 2006;108(3):1037-44.
DOI: 10.1182/blood-2005-12-4916. PMID: 16574954.
17. van de Loosdrecht A.A.,
Westers T.M. Cutting edge: flow cytometry in myelodysplastic syndromes. J Natl Compr Canc Netw 2013;11(7):892-902. PMID: 23847222.
18. Bellos F., Kern W. Flow cytometry in the diagnosis of myelodysplastic syndromes (MDS) and the value of myeloid
cv
cv
es
cv
nuclear differentiation antigen (MNDA). Cytometry B Clin Cytom 2014;92(3): 200-6. DOI: 10.1002/cytob.21190. PMID: 25258054.
19. Matarraz S., Lopez A., Barrena S. et al. The immunophenotype of different immature, myeloid and B-cell lineage-committed CD34+ hematopoietic cells allows discrimination between normal/ reactive and myelodysplastic syndrome precursors. Leukemia 2008;22(6):1175-83. DOI: 10.1038/leu.2008.49. PMID: 18337765.
20. Chabannon C., Wood P., Torok-Storb B. Expression of CD7 on normal human myeloid progenitors. J Immunol 1992;149(6):2110-3. PMID: 1381397.
21. Tien H.F., Wang C.H. CD7 positive hematopoietic progenitors and acute myeloid leukemia and other minimally differentiated leukemia. Leuk Lymphoma 1998;31(1-2):93-8. DOI: 10.3109/10428199809057588. PMID: 9720718.
22. Ogata K., Nakamura K., Yokose N. et al. Clinical significance of phenotypic features of blasts in patients with myelodysplastic syndrome. Blood 2002;100(12):3887-96.
DOI: 10.1182/blood-2002-01-0222. PMID: 12393641.
23. Jorgensen J.L., Chen S.S. Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia: methods and best applications. Clin Lymphoma Myeloma Leuk 2011;11(Suppl 1):S49-53.
DOI: 10.1016/j.clml.2011.03.023. PMID: 22035748.
24. Jaso J.M., Wang S.A., Jorgensen J.L., Lin P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant 2014;49(9):1129-38. DOI: 10.1038/bmt.2014.99.
PMID: 24842529.
25. van de Loosdrecht A.A., Westers T.M., Westra A.H. et al. Identification of distinct prognostic subgroups in low- and intermediate-1-risk myelodysplastic syndromes by flow cytometry. Blood 2008;111(3):1067-77. DOI: 10.1182/ blood-2007-07-098764. PMID: 17971483.
26. Davis B.H., Foucar K., Szczarkowski W. et al. U.S.-Canadian Consensus recommendations on the immuno-phenotypic analysis of hematologic
neoplasia by flow cytometry: medical indications. Cytometry 1997;30(5):249-63. PMID: 9383099.
27. Moon H.W., Huh J.W., Lee M. et al. Immunophenotypic Features
of Granulocytes, Monocytes, and Blasts in Myelodysplastic Syndromes. Korean J Lab Med 2010;30(2):97. DOI: 10.3343/kjlm. 2010.30.2.97. PMID: 20445324.
28. Gong P., Metrebian F., Dulau-Florea A. et al. Aberrant expression of CD56 on granulocytes and monocytes in myelo-proliferative neoplasm. J Hematop 2013;6(3):127-34.
DOI: 10.1007/s12308-013-0190-z.
29. Kussick S.J., Wood B.L. Using 4-color flow cytometry to identify abnormal myeloid populations. Arch Pathol Lab Med 2003;127(9):1140-7.
DOI: 10.1043/1543-2165(2003) 127<1140:UCFCTI>2.0.CO;2. PMID: 12946231.
30. Stetler-Stevenson M., Arthur D.C., Jabbour N. et al. Diagnostic utility of flow cytometric immunophenotyping
in myelodysplastic syndrome. Blood 2001;98(4):979-87. PMID: 11493442.
31. Chung J.W., Park C.J., Cha C.H. et al. A combination of CD15/CD10, CD64/ CD33, CD16/CD13 or CD11b flow cytometric granulocyte panels
is sensitive and specific for diagnosis of myelodysplastic syndrome. Ann Clin Lab Sci 2012;42(3):271-80. PMID: 22964615.
32. Lorand-Metze I., Ribeiro E., Lima C.S.P. et al. Detection of hematopoietic maturation abnormalities by flow cytometry in myelodysplastic syndromes and its utility for the differential diagnosis with non-clonal disorders. Leuk Res 2007;31(2):147-55.
DOI: 10.1016/j.leukres.2006.04.010. PMID: 16750852.
33. Stachurski D., Smith B.R., Pozdnyakova O. et al. Flow cytometric analysis of myelomonocytic cells by
a pattern recognition approach is sensitive and specific in diagnosing myelodysplastic syndrome and related marrow diseases: emphasis on a global evaluation and recognition of diagnostic pitfalls. Leuk Res 2008;32(2):215-24. DOI: 10.1016/j.leukres.2007.06.012. PMID: 17675229.
34. van de Vyver A., Visser A. Decreased CD10 expression in the bone marrow neutrophils of HIV positive patients. Mediterr J Hematol Infect
Dis 2010;2(3):e2010032. DOI: 10.4084/mjhid.2010.032. PMID: 21776338.
35. Keerthivasan G., Mei Y., Zhao B. et al. Aberrant overexpression of CD14
on granulocytes sensitizes the innate immune response in mDial heterozygous del (5q) MDS. Blood 2014;124(5):780-90. DOI: 10.1182/blood-2014-01-552463. PMID: 24891322.
36. Cremers E.M. P., Westers T.M., Alhan C. et al. Implementation of erythroid lineage analysis by flow cytometry in diagnostic models for myelodysplastic syndromes. Haematologica 2017;102(2):320-6. DOI: 10.3324/haematol.2016.147843. PMID: 27658438.
37. Della Porta M.G., Picone C. Diagnostic Utility of Flow Cytometry in Myelodysplastic Syndromes. Mediterr J Hematol Infect Dis 2017;9(1):e2017017. DOI:10.4084/MJHID. 2017.017. PMID: 28293405.
38. Eidenschink Brodersen L., Menssen A.J., Wangen J.R. et al. Assessment of erythroid dysplasia by "difference from normal"
in routine clinical flow cytometry workup. Cytometry B Clin Cytom 2015;88(2):125-35. DOI: 10.1002/cyto.b.21199. PMID: 25490867.
39. Westers T.M., Cremers E.M.P., Oelschlaegel U. et al. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia
in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group. Haematologica 2017;102(2):308-19. DOI: 10.3324/haematol.2016.147835. PMID: 27758818.
40. Wells D.A., Benesch M., Loken M.R.
et al. Myeloid and monocytic dyspoiesis as determined by flow cytometric scoring in myelodysplastic syndrome correlates with the IPSS and with outcome after hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2003;102(1):394-403. DOI: 10.1182/blood-2002-09-2768. PMID: 12649150.
41. Chu S.C., Wang T.F., Li C.C. et al. Flow cytometric scoring system as a diagnostic and prognostic tool in myelodysplastic syndromes. Leuk Res 2011;35(7):868—73. DOI: 10.1016/j.leukres.2011.02.016. PMID: 21397943.
ORCID авторов
Ю.О. Давыдова: https://orcid.org/0000-0001-5932-0285 ORCID of authors
Yu.O. Davydova: https://orcid.org/0000-0001-5932-0285
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Статья поступила: 27.12.2017. Принята в печать: 14.02.2018 Article received: 27.12.2017. Accepted for publication: 14.02.2018
