CC BY
4©Коллектив авторов, 2018 Вопросы онкологии, 2018. Том 64, № 1
УДК 577.152.6:576
О.В. Кеца, М.М. Марченко, И.А. Шмараков
Роль митохондриальной NO-синтазы в реализации противоопухолевых эффектов полиненасыщенных жирных кислот на модели карциномы
Герена в условиях in vivo
Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Украина
Исследовали NO-синтазную активность и уровень N0 в митохондриальной фракции карциномы Герена крыс в условиях различной обеспеченности организма ю-3 и ю-6 полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК).
В качестве модели злокачественного новообразования использовали карциному Герена, трансплантированную путем подкожного введения в участок бедра 0,5 мл 30% суспензии раковых клеток в физиологическом растворе. интенсивность роста опухоли оценивали на основе измерений размеров и коэффициента массы опухоли.
показано, что наиболее выраженный противоопухолевый эффект предварительного и посттрансплантационного введения ю-3 ПНЖК наблюдается в период интенсивного роста карциномы Герена в организме крыс. Дополнительное введение крысам ю-6 ПНЖК способствует стимуляции роста опухоли в организме и повышению коэффициента массы опухоли в логарифмическую фазу онкогенеза. Эффект ю-3 и ю-6 ПНЖК зависит от длительности их введения и степени предварительной обеспеченности организма этими нутриентами.
Установлено, что на фоне торможения роста карциномы Герена у крыс, получавших ю-3 ПНЖК, наблюдается повышение N0-синтазной активности и генерации оксида азота в митохон-дриальной фракции опухоли в логарифмическую фазу онкогенеза. В то же время, введение ю-6 ПНЖК не способствует значительным изменениям компонентов N0-синтазной системы в митохондриальной фракции карциномы Гере-на в сравнении с крысами-опухоленосителями, не получавшими исследуемые нутриенты.
Ключевые слова: N0-синтаза, митохондри-альная фракция, карцинома Герена, коэффициент массы опухоли, ю-3 и ю-6 полиненасыщенные жирные кислоты, крысы
Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) принадлежат к эссенциальным нутриентам, играющих важную роль в реализации многочисленных физиологических процессов в организме в норме и при патологических состояниях [4]. ПНЖК служат предшественниками многих био-
логически активных веществ — эйкозаноидов, резолвинов и протектинов, что позволяет использовать эти нутриенты для предупреждения многих заболеваний, в том числе и онкологических [2, 10, 12]. Перспектива применения противоопухолевых препаратов зависит от исследования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и прогрессии рака. Известно, что NO-синтазная система и оксид азота влияют на развитие трансформированных клеток [11], однако механизмы их действия в условиях in vivo до конца не выяснены. Ранняя коррекция этих механизмов с помощью ПНЖК могла бы повысить эффективность противоопухолевого лечения и гипотетически предотвратить развитие и прогресс онкозаболеваний.
В настоящее время единого мнения о степени влияния различных видов ПнЖК на процессы развития в организме злокачественных новообразований нет. Особенное значение имеют ю-3 и ю-6 ПНЖК — два основных семейства ПНЖК, владеющих разнонаправленной биологической активностью [18]. ю-3 ПНЖК преимущественно найдены в морских продуктах и проявляют благоприятные эффекты на человеческий организм. В то же время, ю-6 ПНЖК в большей степени присутствуют в ежедневной диете и могут вовлекаться в развитие многих патологических процессов, включая онкогенез [1]. Изучение зависимости противоопухолевой резистентности крыс от обеспеченности ю-3 и ю-6 ПНЖК и участие в этих процессах митохондриальной NO-синтазной системы, возможно, приведет к стратегии разработки диет с определенным соотношением и дозами этих ПНЖК, предотвращающих онкогенез.
Учитывая изложенное выше, целью исследования было изучение влияния ю-3 и ю-6 ПНЖК на темпы роста карциномы Герена, а также, NO-синтазную активность и уровень NO в митохон-дриальной фракции карциномы Герена крыс в зависимости от разной обеспеченности ПНЖК.
Материалы и методы
Исследования проводили на самках белых беспородных крыс массой тела 90-110 г. Всего в эксперименте использовано 80 крыс. Рацион животных в течение всего
эксперимента был сбалансированным по всем нутриентам. Содержание экспериментальных животных и манипуляции с ними проводили с соблюдением требований «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для опытных и научных целей» (Страсбург, 1986).
Как модель злокачественного новообразования использовали карциному Герена. Трансплантацию карциномы осуществляли путем подкожного введения в участок бедра 0,5 мл 30% суспензии раковых клеток в физиологическом растворе по методике [14].
Животные были разделены на группы: I — крысы с трансплантированной карциномой Герена (контроль); II — крысы, которым до и после трансплантации карциномы Герена дополнительно вводили рыбий жир, обогащенный ю-3 ПНЖК; III — крысы, получавшие рыбий жир только до трансплантации опухоли; IV — крысы, получавшие рыбий жир только после трансплантации карциномы Ге-рена; V — крысы, которым до и после трансплантации карциномы Герена дополнительно вводили подсолнечное масло, обогащенное ю-6 ПНЖК; VI — крысы, получавшие подсолнечное масло только до трансплантации опухоли; VII — крысы, получавшие подсолнечное масло только после трансплантации опухоли.
Идентификацию жирных кислот в рыбьем жире и подсолнечном масле проводили методом газовой хроматографии на хроматографе HRGC 5300 (Италия). Общую степень ненасыщенности жировых компонентов определяли методом [9]. Рыбий жир и подсолнечное масло вводили ежедневно в дозе, соответствующей 120 мг ю-3 или ю-6 ПНЖК на кг массы крыс, на протяжении четырех недель до трансплантации карциномы Герена и в период роста опухоли в организме.
Интенсивность роста опухоли оценивали на основе измерений ее параметров, рассчитанных по формуле: V=л/6■(h■1■w), где h — высота опухоли, 1 — длина опухоли, w — ширина опухоли [15]. Для того, чтобы убедиться, вызваны ли изменения параметров опухоли действием ПНЖК, а не являются следствием изменения веса животных в процессе эксперимента, оценивали отношение массы опухоли (Мо) к массе тела (Мт) (коэффициент массы опухоли): К=Мо/Мтх100%.
Декапитацию животных проводили под легким эфирным наркозом на 14-е сутки после трансплантации карциномы Герена, что соответствует логарифмической стадии роста данной опухоли.
Митохондриальную фракцию опухолевой ткани выделяли методом дифференциального центрифугирования [17]. В митохондриальной фракции определяли NO-синтазную активность и уровень N0. Ферментативную активность N0-синтазы определяли как разницу между показателями экстинкции субстратного и безсубстратного окисления NADPH и выражали в нмоль окисленного NADPH / мин на мг белка [16].
Содержание N0 определяли путем регистрации содержания нитрит-аниона (N0^), являющегося стабильным метаболитом оксида азота [7]. К02" фиксировали по интенсивности окраски азокомплекса, образующегося в результате реакции между сульфаниловой кислотой, N0^ и а-нафтилетиламином. Образованный комплекс регистрировали спектрофотометрически при длине волны 548 нм.
Полученные данные обрабатывали с использованием параметрических методов анализа (критерий Стьюдента). Различия считали достоверными при Р<0,05.
Результаты и обсуждение
Ввиду неоднозначности результатов исследований относительно антиканцерогенного эффекта ю-3 ПНЖК и проканцерогенного эффекта ю-6
ПНЖК [3, 18], что, вероятно, обусловлено тем, что в качестве моделей использовали опухоли разного генеза, с различием длительности применения и доз ю-3 и ю-6 ПНЖК, нами были исследованы темпы роста карциномы Герена и коэффициент массы опухоли. Проведены исследования с введением дополнительных количеств ю-3 и ю-6 ПНЖК в рацион подопытных животных с трансплантированной карциномой Герена.
Анализ результатов исследований показал, что предварительное четырехнедельное и посттрансплантационное введение в организм рыбьего жира способствует торможению роста карциномы Герена в 1,7 и 1,4 раза в логарифмическую (14-е сутки) и стационарную (21-е сутки) фазы роста опухоли соответственно в сравнении с опухоленосителями, не получавшими дополнительно ю-3 ПНЖК (рис.1а).
В то же время, применение подсолнечного масла в качестве дополнительного источника ю-6 ПНЖК до и в период роста опухоли не только не оказывает противоопухолевый эффект, а наоборот, способствует интенсификации опухолевого роста. Подтверждением этого является увеличение размеров опухоли в 1,3 и 1,2 раза в логарифмическую и стационарную фазы онкогенеза по сравнению с контролем (рис. 1б). Вероятно, в организме линолевая кислота через промежуточные у-линоленовую и дигомо-у-линоленовую кислоты превращается в арахидоновую кислоту, с которой связывают канцерогенные свойства ю-6 ПНЖК [19]. Такая конверсия ограничивает антипролиферативный эффект ю-6 ПНЖК.
Использование рыбьего жира только до трансплантации карциномы Герена приводит к торможению темпов роста опухоли в организме в 1,4 и 1,2 раза в логарифмическую и стационарную фазы онкогенеза, соответственно, в сравнении с показателями опытного контроля. Следует отметить, что исследуемый показатель не достигает значений группы животных, получавших рыбий жир до и после трансплантации опухоли в организм (рис. 1а). Введение подсолнечного масла только до трансплантации карциномы Герена способствует незначительному увеличению опухоли в организме (рис. 1б).
Введение исследуемых масел только в посттрансплантационный период не влияет на темпы роста новообразования в организме крыс (рис. 1).
Наряду с торможением темпов роста карциномы Герена у животных, получавших рыбий жир до и после трансплантации опухоли, наблюдается снижение коэффициента массы опухоли в 2 раза в сравнении с показателем в группе контроля (рис. 2). Установленный факт является свидетельством того, что уменьшение величины параметров карциномы Герена происходит соб-
Рис. 1. Темпы роста карциномы Герена в организме крыс, получавших ю-3 (а) и ю-6 (б) полиненасыщенные жирные кислоты Примечание: О — крысы с трансплантированной карциномой Герена; ю-3-0-ю-3 — крысы, которым до и после трансплантации карциномы Герена дополнительно вводили рыбий жир, обогащенный ю-3 ПНЖК; ю-3-О — крысы, получавшие рыбий жир только до трансплантации опухоли; о-ю-3 — крысы, получавшие рыбий жир только после трансплантации карциномы Герена; ю-6-о-ю-6 — крысы, которым до и после трансплантации карциномы Герена дополнительно вводили подсолнечное масло, обогащенное ю-6 ПНЖК; ю-6-О — крысы, получавшие подсолнечное масло только до трансплантации опухоли; о-ю-6 — крысы, получавшие подсолнечное масло только после трансплантации опухоли; * — статистически достоверная разница в сравнении с показателем крыс-опухоленосителей (Р<0,05)
Рис. 2. Коэффициент массы карциномы Герена крыс в условиях введения разных видов полиненасыщенных жирных кислот
0.4
0.3
В
й 0,25
ш-3-0-»-3
щ-3-0
О-а-З
О-01-6 Группа
рис. 3. NO-синтазная активность (а) и уровень N0 (б) в митохондриальной фракции карциномы Герена крыс в условиях введения разных видов полиненасыщенных жирных кислот
ственно за счет торможения роста неоплазмы, а не является артефактом изменений массы животных в процессе эксперимента.
Использование подсолнечного масла оказалось стимулирующим фактором для роста опухоли, поскольку в логарифмическую фазу онкогенеза повышается коэффициент массы карциномы Герена (рис. 2). Увеличение размера опухоли при дополнительном использование ю-6 ПНЖК, вероятно, является следствием синтеза эйкозаноидов, стимулирующих пролиферацию опухолевых клеток [5].
Таким образом, наиболее выраженный антиканцерогенный эффект ю-3 ПНЖК наблюдается в крыс, получавших исследуемый нутриент предварительно до трансплантации карциномы Герена и на протяжении всего роста опухоли в организме, что наиболее выражено в логарифмическую фазу онкогенеза. В то же время ю-6
ПНЖК, наоборот, стимулируют темпы роста карциномы Герена в организме крыс.
Одним из механизмов противоопухолевого действия ю-3 ПНЖК может быть стимуляция К0-синтазы митохондрий — органелл, запускающих апоптическую гибель клеток.
Результаты проведенных исследований показали, что предварительное и посттрансплантационное введение ю-3 ПНЖК приводит к повышению К0-синтазной активности в митохондриальной фракции карциномы Герена по сравнению с крысами-опухоленосителями (рис. 3а). Повышение 140-синтазной активности может быть следствием активации экспрессии генов ее индуцибельной изоформы, которая продуцирует большое количество N0. В подтверждение этого установлено повышение уровня N0 в митохон-дриальной фракции карциномы Герена исследуемой группы животных (рис. 3б).
Гиперпродукция NO может проявлять выраженный цитотоксический эффект в результате образования пероксинитрита — продукта взаимодействия оксида азота и супероксидного анион-радикала. Пероксинитрит способствует деструктивным изменениям ферментов митохондрий путем модификации тирозиновых остатков белковых молекул [13]. С другой стороны, действие NO in vivo может быть направлено на модуляцию потенциала и блокирование мито-хондриальных пор, что приводит к нарушению работы митохондриальной электрон-транспортной цепи с усиленной генерацией супероксидного радикала и последующей апоптической гибелью опухолевых клеток [6, 8].
Анализ результатов показал, что дополнительное введение ю-6 ПНЖК не сопровождается существенными изменениями NO-синтазной активности и уровня NO в митохондриальной фракции карциномы Герена у всех исследуемых групп (рис. 3).
Таким образом, при исследовании особенностей развития злокачественного новообразования в условиях обеспеченности организма разными видами ПнЖК установлено, что добавление к рациону ю-3 ПНЖК может угнетать опухолевую прогрессию. В то же время дополнительное введение ю-6 ПНЖК вызывает стимулирование роста карциномы Герена в организме и повышение коэффициента массы опухоли. Эффект зависит от длительности введения ПНЖК и степени предварительной обеспеченности организма ю-3 или ю-6 ПНЖК.
Снижение темпов роста опухоли в условиях дополнительного введения рыбьего жира, обогащенного ю-3 ПНЖК, может быть следствием инициации NO-синтазной активности митохондрий с последующей генерацией NO, что способствует окислению биомолекул исследуемых органелл и запуску апоптической гибели опухолевых клеток [5].
ЛИТЕРАТУРА
1. Arem H., Neuhouser M.L., Irwin M.L. et al. Omega-3 and omega-6 fatty acid intakes and endometrial cancer risk in a population-based case-control study // Eur. J. Nutr. — 2013. — Vol. 52. — P. 1251-1260.
2. Bannenberg G., Serhan C.N. Specialized pro-resolving lipid mediators in the inflammatory response: an update // Biochim. Biophys. Acta. — 2010. — Vol. 1801. — P. 1260-1273.
3. Brown M.D., Hart C., Gazi E. et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on meta-static spread from prostate cancer. // Br. J. Cancer. — 2010. — Vol. 102. — P. 403-413.
4. Calder P.C. Very long chain omega-3 (n-3) fatty acids and human health // Eur. J. Lipid Sci. Technol. — 2014. — Vol.116. — P. 1280-1300.
5. Davidson J., Rotondo D., Rizzo M.T., Leaver H.A. Therapeutic implications of disorders of cell death signalling: membranes, micro-environment, and eicosanoid and docosanoid metabolism // Br. J. Pharm. — 2012. — Vol. 166. — P. 1193-1210.
6. Gu C., Yao J., Sun P. Dynamin 3 suppresses growth and induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by activating inducible nitric oxide synthase production // Oncology letters. — 2017. — Vol. 13. — P. 4776-4784.
7. Hwang S., Lopec C.A., Heck D.E. et al. Osteopontin inhibits induction of nitric oxide synthase gene expression by inflammatory mediators in mouse kidney epithelial // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 264. — P. 711-715.
8. Kornfeld S., Goupille C., Vibet S. et al. Reducing endothelial NOS activation and interstitial fluid pressure with n-3 PUFA offset tumor chemoresistance // Carcinogenesis. — 2012. — Vol. 33. — № 2 — P. 260267.
9. Kruatian T., Jitmanee K. Simple spectrophotometric method for determination of iodine value of vegetable oils / Chiang. Mai. J. Sci. — 2013. — Vol. 40. — P. 419-426.
10. Molinari R., D'Eliseo D., Manzi L. et al. The n3-polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid induces immunogenic cell death in human cancer cell lines via pre-apoptotic calreticulin exposure // Cancer Immunol. Immunother. — 2011. — Vol. 60. — № 10. — P. 15031507.
11. Oliveira G. A., Cheng R.YS., Ridnour L.A. et al. Inducible nitric oxide synthase in the carcinogenesis of gastrointestinal cancers // Antioxidants and redox signaling. — 2017. — Vol. 26. — № 18. — С. 10591077.
12. Qu Q., Xuan W., Fan G.-H. Roles of resolvins in the resolution of acute inflammation // Cell Biol. Int. — 2015. — Vol. 39. — P. 3-22.
13. Scarel-Caminaga R.M., Cera F.F., Pigossi S.C. et al. Inducible nitric oxide synthase polymorphisms and nitric oxide levels in individuals with chronic periodontitis // Int. J. Mol. Sci. — 2017. — Vol. 18. — P. 1128-1139.
14. Shmarakov I.A., Katan N.V. The Induction of Guerin's carcinoma cytochrome P450 hydroxylase activity by retinoids. // Biochemistry (Moscow) Supple-ment Series B: Biomedical Chemistry. — 2011. — Vol. 5. — № 4. — Р. 371-377.
15. Tomayko M.M., Reynold C.P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice // Cancer. Chemother. Pharmacol. — 1989. — Vol. 24. — P. 148154.
16. Vodovotz Y, Know S., Popischil M. Inactivation of nitric oxide synthase after prolonged incubation of mouse macrophages with IFN-gamma and bacterial lipopolysaccharide // J. Immunol. — 1994. — Vol. 152. — № 8. — P. 4110 — 4118.
17. Weinbach T.C. A procedure for isolating stadle mitochondria from rat liver and kidney // Anal. Biochem. — 1961. — Vol. 2. — P. 335-343.
18. Williams C.D., Whitley B.M., Hoyo C. et al. A high ratio of dietary n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids is associated with increased risk of prostate cancer // Nutr. Res. — 2011. — Vol.31. — P. 1-8.
19. Xu Y, Qian S.Y Anti-cancer activities of ю-6 polyunsaturated fatty acids // Biomed. J. — 2014. — Vol. 37. — № 3. — P. 112-119.
Поступила в редакцию 02.08.2017 г.
O.V. Ketsa, M.M. Marchenko, I.A. Shmarakov
Role of mitochondrial NO-synthase in the
implementation of antitumor effects of polyunsaturated fatty acids in the model of Guerin's carcinoma under in vivo conditions
Yuriy Fedkovych Chernivtsi National University, Ukraine
NO-synthase activity and NO level in the mitochondrial fraction of rats Guerin's carcinoma under conditions of different ro-3 and ro-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) supplementation has been investigated. Guerin's carcinoma was used as a cancer model. 0.5 ml of 30% carcinoma cell suspension in normal saline was implanted subcutaneously into thigh of a hind leg. The intensity of tumor growth was evaluated based on measurements of subcutaneous tumor size and coefficient of tumor mass. It was showed that ro-3 PUFAs supplementation before and after transplantation of Guerin's carcinoma resulted in the decreases of tumor growth and coefficient of tumor mass in an organism. Additional ro-6 PUFA supplementation can stimulate tumor progression and increase tumor mass in body in the logarithmic phases of carcinogenesis as compared to the tumor-bearing rats. The effect depends on duration of ro-3 and ro-6 PUFAs administration and on the level of preliminary provision of an organism with these PUFAs. We found increased NO-synthase activity and NO content in mitochondrial fraction of Guerin's carcinoma in animals of the group that was administered ro-3 PUFAs both before and post-implantation of the carcinoma during logarithmic phase of carcinogenesis. At the same time, the ro-6 PUFA administration does not contribute to significant changes in the NO-synthase system components in the mitochondrial fraction of Guerin's carcinoma in comparison with the tumor-bearing rats.
Key words: NO-synthase, mitochondrial fraction, Guerin's carcinoma, coefficient of tumor mass, ro-3 and ro-6 polyunsatu-rated fatty acids, rats
