CC BY
56
УДК:617.51+617.53]-006.61-036:577.15
роль МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В РАЗВИТИИ И ПРОГНОЗЕ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫХ КАРЦИНОМ ГОЛОВЫ И ШЕИ
Е.В. Клишо, И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, Д.А. Шишкин,
О.В. Черемисина, С.Ю.Чижевская
НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск 634009, Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: biochem@oncology.tomsk.ru
Исследована прогностическая значимость определения ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови у 142 больных опухолями головы и шеи с распространенностью T1_3N0_3M0 с помощью метода ИФА. Уровень содержания ММП-9 в сыворотке крови больных значительно превосходит уровень содержания маркера в сыворотке здоровых лиц. Установлена отрицательная корреляционная связь между уровнем ММП-2 в сыворотке крови и размером опухолевого узла, причем уровень маркера при Т1 стадии значительно выше, чем у здоровых лиц. Высокий уровень содержания ММП-9 в сыворотке крови является признаком плохого прогноза 2-летней общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости больных ПКГШ. Высокая вероятность возникновения метастазов у больных опухолями головы и шеи связана с высокими уровнями как ММП-2, так и ММП-9 в сыворотке крови, исследованной до начала лечения.
Ключевые слова: плоскоклеточный рак головы и шеи, металлопротеинзы.
ROLE OF MMP-2 AND MMP-9 IN THE DEVELOPMENT AND PROGNOSIS OF SQUAMOUS CELL HEAD AND NECK CARCINOMA E.V Klisho, I.V. Kondakova, E.L. Choinzonov, D.A. Shishkin,
O.V Cheremisina, S.Yu. Chizhevskaya Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk 5, Kooperativny Street, 634009-Tomsk, e-mail: biochem@oncology.tomsk.ru
Prognostic significance of determination of MMP-2 and MMP-9 levels in blood serum of 142 patients with stage T1_4N0_3M0 head and neck cancer was studied using immunoenzymatic assay. The serum MMP-9 level in head and neck cancer patients was significantly higher than that observed in healthy subjects. Negative correlation between the serum MMP-2 level and tumor size was found. The serum MMP-2 level was significantly higher in patients with stage I head and neck cancer than in healthy subjects. High serum MMP-9 level was associated with poor prognosis for 2-year overall, recurrence-free and metastasis-free survivals of head and neck cancer patients. High serum MMP-2 and MMP-9 levels prior to treatment were found to be related to a high risk for metastasis.
Key words: squamous cell head and neck carcinoma, metalloproteinases.
Для индивидуальной противоопухолевой терапии больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи (ПКГШ) не всегда бывает достаточно клинико-морфологических критериев прогноза развития заболевания. Поэтому для объективной оценки метастатического потенциала опухоли и прогноза рецидивов возникает потребность в дополнительных молекулярных маркерах опухолевой прогрессии. Выбор прогностических маркеров опирается на современные представления о механизмах канцерогенеза. Известно, что для инвазивного роста, экстра- и интравазации при метаста-зировании опухолевым клеткам необходимо преодолевать барьеры в виде базальных мембран, экстраклеточного матрикса и тканевых
структур. Эти барьеры опухоли разрушают с помощью протеолитических ферментов, в частности матриксных металлопротеиназ (ММП), которые в настоящее время претендуют на роль прогностических факторов опухолевой прогрессии ПКГШ [12]
Матриксные металлопротеиназы играют основную роль в гидролизе базальной мембраны и экстраклеточного матрикса благодаря своей способности разлагать практически все их компоненты: коллагены всех типов, эластин, протеогликаны, ламинин и т.д. Кроме того, исследования последних лет позволили открыть новые функции ММП в опухолевой прогрессии: участие в выходе депонированных факторов роста, расщепление некоторых биоактивных мо-
лекул с образованием веществ с новыми биологическими свойствами, участие в канцерогенезе ряда опухолей, мощный ангиогенный эффект, участие в поддержании жизнеспособности опухолевых клеток [2, 4, 7, 8, 20]. Все перечисленные свойства ММП делают их ключевыми маркерами опухолевой прогрессии.
Матриксные металлопротеиназы согласно своему строению и субстратной специфичности делятся на несколько групп, наиболее перспективным является изучение группы желатиназ, так как желатиназы гидролизуют нефибриляр-ный коллаген IV типа, образующий базальные мембраны, и поэтому считается, что именно эти протеазы инициируют инвазивные процессы [2]. Группа желатиназ состоит из ММП-2 (же-латиназа А) и ММП-9 (желатиназа В).
Повышенную экспрессию ММП-2 в ткани ПКГШ по сравнению со здоровой слизистой оболочке наблюдали многие исследователи [3, 15, 22]. Эти результаты позволяют считать продукцию этого фермента опухолью индикатором степени злокачественного развития ПКГШ. Исследователи выявили корреляцию различной степени между уровнем экспрессии ММП-2 в ткани опухоли и наличием лимфогенных метастазов и инвазивностью [3, 6, 15, 10, 22, 24]. Экспрессия ММП-2 была в значительной степени связана и с отдаленным метастатическим поражением [24]. Эти результаты указывают на важную роль ММП-2 в опухолевой инвазии и метастазировании, что позволяет рассматривать ММП-2 как потенциальный биохимический маркер метастазирования и прогноза течения опухолевого процесса [11].
Следует отметить, что к настоящему времени уже опубликованы отдельные работы по оценке прогностической значимости определения ММП-2 у больных ПКГШ, позволяющих считать высокую активность ММП-2 в опухолевой ткани маркером плохого прогноза развития заболевания [24]. Общая выживаемость больных раком гортани была выше у пациентов с низким уровнем экспрессии ММП-2 в опухоли [6]. Характеристики инвазивного фронта отражают прогноз развития опухоли лучше, чем другие ее зоны. В случае ММП-2-позитивного инвазивного фронта многомерный статистический анализ показал снижение времени общей
выживаемости, связь с лимфогенным мета-стазированием и Т-стадией опухолевого роста [16]. Авторы исследования заключают, что экспрессия ММП-2 в инвазивном фронте является маркером низкой выживаемости и, вероятно, связана с ранними рецидивами у пациентов без метастазов в лимфатические узлы. Пациенты ПКГШ с высокой активностью ММП-2 имели более короткое время безрецидивной выживемо-сти после лечения, чем пациенты с опухолями, содержащими низкую активность ММП-2. Эти результаты демонстрируют важность измерения содержания ММП-2 в опухолевых образцах для прогноза безрецидивной выживаемости у больных ПКГШ [23].
Уровень активности [3] и экспрессии ММП-9 [13, 22] у больных ПКГШ был значительно выше в опухолях, чем в образцах нормальной слизистой оболочки. Серологическая концентрация ММП-9 у этих пациентов также была значительно выше, чем у здоровых лиц [17, 19]. У больных ПКГШ была выявлена достоверная корреляционная связь между уровнями содержания ММП-9 в сыворотке крови и экспрессией фермента в опухоли с такими клиникоморфологическими параметрами заболевания, как размер опухоли и наличие метастазов в лимфатических узлах [15, 19]. Кроме того, исследования последних лет обнаружили важную роль ММП-9 в процессах опухолевого ангиогенеза [8, 14, 18, 22], что согласуется с теорией о функции ММП-9 как регулятора опухолевого ангиогенеза, поддерживающего эндотелиальную клеточную инвазию ПКГШ.
У пациентов ПКГШ с высокой активностью ММП-9 в ткани опухоли наблюдалось сокращение времени безрецидивной выживаемости по сравнению с пациентами с низкой активностью ММП-9 [23]. Эти результаты свидетельствуют
о том, что измерение активности ММП-9 в опухолевых образцах может быть полезно для прогноза сроков безрецидивной выживаемости пациентов с ПКГШ.
Таким образом, матриксные металлопротеи-назы играют важную роль в инвазии и метаста-зировании злокачественных опухолей головы и шеи. Исследования последних лет указывают на большую предсказательную и прогностическую информативность определения уровня
экспрессии и активности ММП-2 и ММП-9 в опухолевой ткани. Работ по определению прогностической значимости металлопротеиназ в сыворотке крови немного, однако исследования в этом направлении являются наиболее перспективными, так как являются малоинвазивными и подходят для всех групп больных ПКГШ.
Материалы и методы
В группу исследования вошли 144 больных злокачественными опухолями головы и шеи (гортань, органы полости рта, глотки, носоглотки и придаточных пазух) стадии T1_3N0_3M0 в возрасте от 31 до 77 лет (средний возраст - 55,7 года) и 22 здоровых донора в возрасте от 26 до 57 лет. Больные проходили лечение в НИИ онкологии СО РАМН в период с сентября 2003 г. по август 2007 г. Все опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточной карциномы разной степени дифференцировки.
Срок наблюдения за больными составил от
1 до 53 мес. Материалом для исследования послужила сыворотка крови больных, не подвергавшихся специальному лечению. Сыворотку хранили при -50°С не более 6 мес и размораживали не более 1 раза для исследования содержания ферментов. Исследование уровня ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови проводилось с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (Human Human MMP-9 Quantikine ELISA Kit, Human Human TIMP-1 Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, USA) на ИФА-анализаторе ANTHOS 2020 (Австрия). По поводу основного заболевания пациенты, включенные в исследование, получили комбинированное лечение (предоперационную химиолучевую терапию и операцию) и в самостоятельном варианте лучевую терапию или оперативное вмешательство.
Статистический анализ был проведен с использованием программы STATISTICA 6.0. Результаты исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмагорова-Смирнова. При нормальном распределении значений применялся параметрический t-критерий Стьюдента. Для значений, закон распределения которых отличался от нормального, был применен непараметрический критерий Манна-Уитни.
Для оценки прогностической значимости определения ферментов и ингибиторов в сыворотке крови больных ПКГШ использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков, который был выполнен с использованием критерия Гехана-Вилкоксона и ^-рангового критерия. Сравнение выживаемости в группах проводили с помощью критерия Гехана-Вилкоксона и log-рангового критерия. Показатели 2-летней общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости оценивали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Статистически значимыми считались различия при р<0,05 [1].
Результаты и обсуждение
При анализе полученных результатов было показано значительное повышение уровня ММП-9 в сыворотке крови больных с ПКГШ до 530,0 ± 37,2 нг/мл по сравнению с уровнем протеиназы в крови здоровых лиц - 358,3 ± 42,3 нг/мл (р<0,05) (таблица). Полученные результаты согласуются с литературными данными, в которых серологическая концентрация ММП-9 была значительно выше у больных ПКГШ, чем у здоровых людей [17, 19].
Рядом исследователей были выявлены значительные корреляции между уровнем экспрессии ММП-9 в опухолевой ткани и размером опухоли у больных [15, 19]. При исследовании сыворотки пациентов нами отмечено достоверное увеличение уровня ММП-2 при местной распространенности опухоли, соответствующей Т и уровня ММП-9 при Т3 и Т4 по сравнению с уровнем показателей у контрольной группы (р<0,05). Кроме того, для ММП-2 показано снижение содержания фермента в крови при увеличении размера опухоли. Особо стоит обратить внимание на высокий уровень ММП-2 уже при I стадии опухолевого процесса. Данное повышение ферментативной экспрессии, вероятно, свидетельствует о важной роли ММП-2 на ранних стадиях развития злокачественных опухолей, и, возможно, ММП могут являться биохимическими маркерами при ранней диагностике рассматриваемых новообразований.
Известные свойства ММП делают их ключевыми маркерами опухолевой прогрессии. Учитывая их связь с клинико-морфологическими
Таблица
Уровень матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 в сыворотке крови в зависимости от распространенности процесса у больных ПКГШ
параметрами заболевания, с помощью однофакторного анализа прогностической значимости признаков с помощью критерия Гехана-Вилкоксона и ^-рангового критерия мы изучили эти ферменты в качестве факторов прогноза выживаемости больных ПКГШ. В результате наблюдения за больными ПКГШ независимо от локализации первичного очага, его стадии и метода лечения, прогрессирование процесса за счет развития рецидивов опухоли было отмечено у 34 (30,4 %) больных (сроки возникновения рецидива в среднем составили 14 мес) и за счет образования метастазов - у 21 (18,8 %) пациента (в сроки от 2 до 26 мес, в среднем - через 10,9 мес). Была выявлена прогностическая значимость обоих изучаемых параметров и определен пороговый уровень значения показателей в сыворотке крови, при превышении которого наблюдалось статистически достоверное снижение выживаемости больных ПКГШ.
При оценке 2-летней общей выживаемости был выявлен один статистически значимый критерий: уровень содержания ММП-9 в
А
1 0% ------------1----------■---------'---------'---------■---------■----------1---------'---------
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Срок наблюдения месяцев
Б
30% ■ ■
20% ■ А- ■
10% I—■-----------------------------------------------------------------------------------'-'-'-'-■-'-'-'-
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Срок наблюдения месяцев
В
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Срок наблюдения месяцы
Рис. 1. Показатели общей (А), безметастатической (Б) и безрецидивной (В) выживаемости больных ПКГШ в зависимости от порогового уровня ММП-9 в сыворотке крови, равного 550 нг/мл.
Примечание:---- уровень ММП-9 более 550 нг/мл;
----уровень ММП-9 менее 550 нг/мл
сыворотке крови. Так, показатели 2-летней общей выживаемости были достоверно выше у больных ПКГШ при уровне содержания ММП-9 в сыворотке крови менее 550 нг/мл, по
Здоровые лица ММП-2 ММП-9
п нг/мл п нг/мл
19 239,4 ± 14,0 22 358,3 ± 42,3
ПКГШ
Всего 69 255,9 ± 6,2 120 530,0 ± 37,2*
Т, 8 284,3 ± 17,3* 12 389,6 ± 91,8
Т2 19 265,9 ± 7,6 26 462,8 ± 73,3
Т3 40 245,6 ± 9,0** 69 541,7 ± 50,9*
Т4 2 252,2 ± 51,0 11 641,1 ± 117,4*
N0 45 258,9 ± 7,5 74 498,5 ± 46,7
N 17 242,1 ± 13,4 27 575,4 ± 85,0*
N. 4 276,3 ± 18,7 10 534,4 ± 118,8*
N 3 261,6 ± 39,3 6 505,5 ± 124,2
Примечания: * - различия статистически достоверны по сравнению с группой здоровых лиц (р<0,05); ** - различия статистически достоверны по сравнению с группой «Т1» (р<0,05).
Рис. 2. Безметастатическая выживаемость больных ПКГШ в зависимости от порогового уровня ММП-2 в сыворотке крови, равного 250 нг/мл
сравнению с больными, у которых было более высокое содержание фермента (р=0,009; тест Gehan's Wilcoxon; р=0,016 тест Log-Rank; n=89) (рис. 1А). Таким образом, высокие концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови коррелируют с плохим прогнозом общей 2-летней выживаемости. Безрецидивная выживаемость достоверно выше у больных с содержанием ММП-9 в сыворотке крови ниже 550 нг/мл, по сравнению с больными с более высоким уровнем ММП-9 (р<0,05) (рис. 1В).
При оценке показателей безметастатической выживаемости была выявлена информативность исследования обоих маркеров в сыворотке крови. Безметастатическая выживаемость была достоверно выше у больных с уровнем содержания ММП-9 в сыворотке крови менее 550 нг/мл. (рис. 1Б ) и с уровнем содержания ММП-2 менее 250 нг/мл, чем у больных с более высоким содержанием ферментов (рис. 2) (р<0,01).
Таким образом, анализ полученных результатов позволил сделать вывод о том, что высокий уровень содержания ММП-9 в сыворотке крови является признаком плохого прогноза 2-летней общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости больных ПКГШ. Высокая вероятность возникновения метастазов у больных опухолями головы и шеи связана с высокими уровнями как ММП-2, так и ММП-9 в сыворотке крови, исследованной до начала лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боровиков В.П. Программа STATISTICA для студентов и инженеров. М.: Компьютер Пресс, 2001. 301 с.
2. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л. Матриксные металлопротеиназы в онкогенезе // Сибирский онкологический журнал. 2003. № 2. С. 62-71.
3. Bogusiewicz M., Stryjecka-Zimmer M., Szymanski M. et al. Activity of matrix metalloproteinases-2 and -9 in advanced laryngeal cancer // Otolaryngol. Head Neck Surg. 2003. Vol. 128, № 1. P. 132-136.
4. Chang C., Werb Z. The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion, angiogenesis and metastasis // Trends Cell Biol. 2001. Vol. 11, № 11. P 37-43.
5. Charous S.J., Stricklin G.P., Nanney L.B. et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in head and neck squamous cell carcinoma // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 1997. Vol. 106, № 4. P. 271-278.
6. Danilewicz M., Sikorska B., Wagrowska-Danilewicz M. Prognostic significance of the immunoexpression of matrix metalloprotei-nase MMP2 and its inhibitor TIMP2 in laryngeal cancer // Med. Sci. Monit. 2003. Vol. 9, № 3. P. 42^7.
7. Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metal-loproteinases in cancer progression // Nat. Rev. Cancer. 2002. Vol.2, № 3. P. 161-174.
8. HeissigB., HattoriK., FriedrichM. et al. Angiogenesis: vascular remodeling of the extracellular matrix involves metalloproteinases // Curr. Opin. Hematol. 2003. Vol.10, № 2. P 136-141.
9. Imanishi Y., FujiiM., Tokumaru Y. et al. Clinical significance of expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase and matrix metalloproteinase-2 in human head and neck squamous cell carcinoma // Hum. Pathol. 2000. Vol. 31, № 8. P 895-904.
10. Kawata R., Shimada T., Maruyama S. et al. Enhanced production of matrix metalloproteinase-2 in human head and neck carcinomas is correlated with lymph node metastasis // Acta. Otolaryngol. 2002. Vol. 122, № 1. P. 101-106.
11. Kawata R., Shinomiya T., Yasuda N. et al. Matrix metallopro-teinase-2 concentrations in squamous cell carcinoma of the head and neck and its clinical significance // Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho. 1996. Vol. 99, № 2. P. 299-305.
12. Lynch C.C., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication // Differentiation. 2002. Vol. 70. P. 561-573.
13. Magary S.P., Ryan M.W., Tarnuzzer R.W., Kornberg L. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metal-loproteinases in laryngeal and pharyngeal squamous cell carcinoma: A quantitative analysis // Otolaryngol. Head Neck Surg. 2000. Vol. 122, № 5. P. 712-716.
14. O-Charoenrat P., Rhys-Evans P., Modjtahedi H. et al. Overexpression of epidermal growth factor receptor in human head and neck squamous carcinoma cell lines correlates with matrix metal-loproteinase-9 expression and in vitro invasion // Int. J. Cancer. 2000. Vol. 86, № 3. P. 307-317.
15. O-Charoenrat P., Rhys-Evans P.H., Eccles SA. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors correlates with invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the head and neck // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2001. Vol. 127, № 7. P. 813-820.
16. Ondruschka C., Buhtz P., Motsch C. et al. Prognostic value of MMP-2, -9 and TIMP-1,-2 immunoreactive protein at the invasive front in advanced head and neck squamous cell carcinomas // Pathol. Res. Pract. 2002. Vol. 198, № 8. P. 509-515.
17. Ranuncolo S.M., MatosE., LoriaD. Circulating 92-kilodalton matrix metalloproteinase (MMP-9) activity is enhanced in the eu-globulin plasma fraction of head and neck squamous cell carcinoma // Cancer. 2002. Vol. 94. № 5. P 1483-1491.
18. Riedel F, Gotte K., Schwalb J. et al. Expression of 92- kDa type IV collagenase correlates with angiogenic markers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma // Int. J. Oncol. 2000. Vol. 17, № 6, P. 1099-1105.
19. Riedel F., Gotte K., Schwalb J., Hormann K. Serum levels of matrix metalloproteinase-2 and -9 in patients with head and neck squamous cell carcinoma // Anticancer Res. 2000. Vol. 20, № 5A. P. 3045-3049.
20. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. № 17. P. 463-516.
21. Tokumaru Y., Fujii M., Otani Y. et al. Activation of matrix metalloproteinase-2 in head and neck squamous cell carcinoma: studies of clinical samples and in vitro cell lines co-cultured with fibroblasts // Cancer Lett. 2000. Vol. 150, № 1. P. 15-21.
22. Werner J.A., Rathcke I.O., MandicR. The role of matrix met-alloproteinases in squamous cell carcinomas of the head and neck // Clin. Exp. Metastasis. 2002. Vol. 19, № 4. P. 275-282.
23. Yasuda T., Sakata Y., Kitamura K. et al. Localization of plasminogen activators and their inhibitor in squamous cell carcinomas of the head and neck // Head Neck. 1997. Vol. 19, № 7. P. 611-616.
24. Yorioka C.W., Coletta R.D., Alves F. et al. Matrix metal-loproteinase-2 and -9 activities correlate with the disease-free survival of oral squamous cell carcinoma patients // Int. J. Oncol. 2002. Vol. 20, № 1. P. 189-194.
Поступила 24.08.09
