CC BY
38
БИОХИМИЯ
УДК 577.125:577.112.856
Г.С. Русских, Д.В. Суменкова, Л.М. Поляков, Т.В. Зуева
РОЛЬ МАКРОФАГОВ В ПОГЛОЩЕНИИ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВОГО КОМПОНЕНТА ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Методами диск-электрофореза и иммуноэлектроблоттинга показаны различия в поглощении и метаболической деградации белкового компонента липопротеинов высокой плотности нормальными и опухолевыми (НА-1 гепатома) перитонеальными макрофагами мышей линии А/8п(А). Обнаружено снижение поглощения и метаболической деградации макрофагами аполипопротеина А-1 при опухолевом росте. При этом спектр внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов с НА-1 гепатомой значительно отличался от нормальных клеток. В опухолевых макрофагах снижено содержание низкомолекулярных белков (6-12 кДа) и повышено содержание белков со средней и высокой молекулярной массой. Тетрагидрокортизол оказывал стимулирующее влияние на поглощение и метаболическую деградацию аполипопротеина А-1 как нормальными, так и опухолевыми клетками. Отмечено увеличение числа и количественного содержания продуктов метаболической деградации этого белка под влиянием гормона.
Ключевые слова: перитонеальные макрофаги, НА-1 гепатома, липопротеины высокой плотности, аполипопротеин А-1, тетрагидрокортизол
Известно, что обмен липопротеинов тесно связан с макрофагами, которые захватывают липопротеины с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза [!]• Механизм рецепторного поглощения макрофагами липопротеинов определяют входящие в их состав белки — аполипопротеины. Макрофаги не только поглощают липопротеины, но и активно способствуют выведению холестерина и фосфолипидов насцентными липопро-теинами высокой плотности с участием АТФ-связанного кассетного транспортера (АВСА1) и аполипопротеина Е [2, 3]. В связи с этим, выяснение путей проникновения липопротеинов в клетку, их последующая внутриклеточная локализация и метаболическая трансформация являются совершенно необходимыми для понимания не только роли моноцитов/макрофагов в обмене липопротеинов, но и в формировании у последних регуляторных свойств.
Методы исследования
Исследования выполнялись на перитонеальных макрофагах мышей-самцов линии А/8п(А), 3-4 месячного возраста, массой 20-24 г. Использовалась модель опухоли НА-1 гепатома, дифференцированная гепатокарцинома, происходящая из печени мыши-самца линии А/8п(А), индуцированная орто-аминоазотолуолом (Институт
цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу М3 СССР от 12.08.1977 г. №755).
Нормальные макрофаги получали от мышей, примированных in vivo 4% раствором крахмала за 3-5 дней до взятия материала. Макрофаги выделяли из перитонеального лаважа мышей путем введения в брюшную полость 5 мл среды RPMI-1640 («Биолот», Россия), pH 7,4, содержащей 20 мМ HEPES («ICN Biomedicals, Inc», США). Перитонеальный лаваж от 5 мышей объединяли и помещали в 40 мм культуральные чашки Петри «Costar» (1,5x106 клеток на чашку). После 30 мин инкубации при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха (С02-инкуба-тор, «Cole-Parmer», США), клеточный монослой дважды промывали средой RPMI-1640 для удаления неприкрепившихся клеток. Опухолевые макрофаги выделяли из асцитной жидкости и инкубировали вышеописанным методом. Липопротеины высокой плотности добавляли к среде инкубации в концентрации 1 мг белка на
1 мл среды, тетрагидрокортизол — в концентра-
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
45
ции lxio-s М. Инкубацию проводили при указанных выше условиях в течение 2 ч.
По окончании инкубации клетки лизировали раствором, содержащим 10 мкМ фосфорнокислого натрия, pH 7,2, 85 мкМ NaCl, 5 мкМ КС1,
0,5% дезоксихолата натрия, 1% Тритон Х-100. Клеточный лизат разбавляли (1:1) раствором, содержащим: 10 мкМ фосфорнокислого натрия, pH 7,2, 85 мкМ NaCl, 5 мкМ КС1, 1% додецил-сульфата натрия. Лизат центрифугировали для удаления клеточного дебриса и доводили до концентрации 10 мкМ раствором, содержащим фосфорнокислый натрий, pH 7,2, 85 мкМ NaCl, 5 мкМ КС1, 0,5% тритон Х-100, 0,5% додецил-сульфат натрия [4].
Выделение липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) из плазмы крови человека проводили флотацией в растворах КВг [5] на ультрацентрифуге «Optima L-90K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70,1 Ti. Полученные ЛПВП диализовали в течение 24
ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl при 4 °С. Для получения аполипопротеина А-I часть липопротеинов делипидировали охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) из расчета 20 мл смеси на 1 мл раствора липопротеинов с последующей многократной отмывкой эфиром [6]. Суммарные белки ЛПВП наносили на колонку (1,6x100 см) с Сефарозой 6B-CL «Pharmacia» (Швеция) и элюировали 0,01 М Трис-HCl буфером, pH 8,6, содержащим 6 М мочевину, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. Скорость потока — 10 мл/ч, скорость самописца — 9 мм/ч. Профиль элюции регистрировали на УФ-детек-торе 2151 «LKB» (Швеция). Проверку чистоты аполипопротеина А-I и анализ клеточных лизатов осуществляли с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [7]. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов (фосфорилаза — 94 кДа, альбумин — 67 кДа, кар-боангидраза — 30 кДа, лактальбумин — 14,4 кДа, инсулин — 6 кДа) «Pharmacia» (Швеция).
Иммуноэлектроблоттинг [8] проводили «полу-сухим» методом с использованием нит-роцеллюлозных мембран «Schleicher & Schuell» (ФРГ) с диаметром пор 0,45 мкм. Специфические антитела против человеческого аполипопротеина А-I получали описанным нами ранее методом [9].
Электрофореграммы и данные иммуноэлект-роблоттинга обрабатывали с помощью компьютерной программы TotalLab (BioSistematica, New Horizons in gel imaging and analysis).
Результаты исследования
Липопротеины высокой плотности плазмы крови человека (ЛПВП) инкубировали с нормальными и опухолевыми перитонеальными макрофагами мышей-самцов линии А/Бп(А) в течение 2 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха. После инкубации клетки отмывали калий-фосфатным буфером и лизировали. С помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле проводили анализ клеточных белков. Оказалось, что спектры внутриклеточных белков опухолевых и нормальных макрофагов значительно отличаются между собой (Рис. 1, дорожки 1 и 5). В белковом спектре макрофагов мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой содержалось значительно меньшее количество низкомолекулярных белков, соответствующих по подвижности белкам семейства апопротеинов С. Характерно, что молекулярные массы этих белков совпадают или близки молекулярным массам некоторых цитокинов, синтезируемых макрофагами (ИЛ-1, ФНО-а). С другой стороны, содержание средне- и высокомолекулярных белков в опухолевых макрофагах было более высоким.
Добавление в инкубационную среду ЛПВП приводило к поглощению их макрофагами (Рис. 1). Среди множества внутриклеточных белков макрофагов в клеточном лизате появился белковый банд, соответствующий по молекулярной массе аполипопротеину А-1 (28,3 кДа). Этот банд по иммунохимической характеристике действительно соответствовал аполипопротеину А-1, что было доказано методом иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических анти-апоА-1-антител (Рис. 2). Кроме основной формы аполипопротеина А-1 идентифицированы продукты метаболической деградации этого белка с молекулярными массами от 26 до 6 кДа. Количественный анализ поглощенного макрофагами белкового компонента ЛПВП проводили с помощью денси-
1 2 3 4 J
ргтдг-уг-чг 1* г-
[4,4 кДа---------►
Рис. 1. Электрофореграмма внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов мышей.
1 — опухолевые макрофаги;
2 — опухолевые макрофаги + ЛПВП; 3 — ano А-1;
4 — нормальные макрофаги + ЛПВП;
5 — нормальные макрофаги
1 2 3 4 5
; ш :
А 1мшийш
Рис. 2. Оценка поглощения и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП перитонеальными макрофагами мышей с помощью иммуноэлектроблоттипга с использованием специфических анти-апоА-1 антител.
1 — апоА -/ стандарт;
2 нормальные макрофаги + ЛПВП;
J — нормальные макрофаги + ЛПВП + тетрагидрокортизол;
4 — опухолевые макрофаги + ЛПВП;
5 — опухолевые макрофаги + ЛПВП +
тетрагидрокортизол
>• 9000
X
с 8000
ГО
i 7000
I
g 6000 g 5000 4000 3000 2000 1000 0
Рис. 3. Внутриклеточное содержание апоА-I и его иммунореактивных фрагментов в нормальных и опухолевых макрофагах мышей (компьютерная обработка в программе TotalLab данных, представленных на рис. 2).
1 — нормальные макрофаги + ЛПВП: 2 — нормальные макрофаги + ЛПВП + тетрагидрокортизол;
3 — опухолевые макрофаги + ЛПВП; 4 — опухолевые макрофаги + ЛПВП + тетрагидрокортизол
7943
5877
2645
Экспериментальные группы
тометрической компьютерной обработки в программе TotalLab. Обращает на себя внимание, что опухолевые макрофаги отличаются значительно меньшей способностью к поглощению н метаболической деградации аполипопротеина А-I (Рис. 3).
Известно, что макрофаги обладают высокой активностью 5а- н 5р-редуктаз, восстанавливающих дельта-4,3-кетогруппу в кольце Астероидных гормонов с образованием тетрагидросоединений 110]. Продуктом метаболизма ЛПВП и кортизола в макрофагах является комплекс аполипопротеина А-1 с тетрагидрокортизолом [11], В связи с этим мы провели исследования по влиянию тетрагидрокортизола на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента ЛПВП.
Оказалось, что теграгидрокортизол в концентрации 1 х ю-e ¡у| стимулировал поглощение ЛПВП как нормальными, так и опухолевыми макрофагами. Но при этом более выраженный эффект был отмечен для опухолевых клеток. Как видно на рис. 2 и 3, добавление гормона увеличивало поглощение ЛПВП нормальными макрофагами в 1,6 раза, а опухолевыми — в 2,2 раза. Кроме того, тетрагидрокортизол оказывал стимулирующее влияние и на внутриклеточную метаболическую деградацию аполипопротеина А-I нормальными и опухолевыми клетками. Результаты нммуно-электроблоттинга показали увеличение числа и количественного содержания продуктов метаболической деградации этого белка под влиянием гормона (Рис. 2).
Выводы
1. Спектр внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов с НА-1 гепатомой отличается от нормальных клеток. В опухолевых макрофагах снижено содержание низкомолекулярных белков (6-12 кДа) и повышено содержание белков со средней и высокой молекулярной массой.
2. Поглощение и метаболическая деградация макрофагами белкового компонента липопроте-инов высокой плотности при опухолевом росте снижено по сравнению с контролем.
3. Теграгидрокортизол оказывает стимулирующее влияние на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента лииопротен-пов высокой плотности (аполипопротеина А-1) как нормальными, так и опухолевыми клетками.
THE ROLE OF MACROPHAGES IN UPTAKE AND METABOLIC DEGRADATION OF PROTEIN COMPONENT OF HIGH DENSITY LIPOPROTEINS
G.S. Russkih, D.V. Sumenkova, L.M. Polyakov ,
T.V. Zueva
The differences in uptake and metabolic degradation of a protein component of high density lipoproteins in normal and tumor (hepatoma HA-1) peritoneal macrophages of mice A/Sn (A) were shown by disk-electrophoresis and immunoelectroblotting. During the tumor growth the decrease in uptake and metabolic degradation of apolipoprotein А-I by macrophages was revealed. The spectrum of intracellular proteins in peritoneal macrophages with HA-1 hepatoma was different from normal cells. The level of low-molecular proteins (6-12 kD) decreased and the level of proteins with average and high molecular weight increased in tumor macrophages. Tetrahydro-cortisol possessed the stimulating effects on uptake and metabolic degradation of apolipoprotein А-I in normal and tumor cells. The hormone increased the number and the level of products of metabolic degradation of apolipoprotein A-I.
Литература
1. Bryan, A. Orphan Nuclear Receptors Find a Home in the Arterial Wall / A. Bryan, P. Tontonoz // Current Science. - 2002. - Vol. 4. - P. 213-221.
2. Heterogeneity of high density lipoprotein generated by ABCA1 and ABCA7 / Michi Hayashi, Sumiko Abe-Dohmae, Mitsuyo Okazaki at al // Journal of Lipid
Research. - 2005. - Vol. 46. - P. 1703-1711.
3. Sterol efflux mediated by endogenous macrophage apoE expression is independent of ABCA1 / Z.H. Huang, C.Y. Lin, J.F. Oram, T. Mazzone // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2001. - Vol. 21. - № 12. - P. 2019-2025.
4. Tissue-specilic posttranslational modification of rat apoE. Synthesis of sialated apoE forms by neonatal rat aortic smooth muscle cells / M. Hussain, N. Bucher, B. Faris, at al. //Journal of Lipid Research. — 1988. — Vol. 29. - P. 915-924.
5. Hatch, F.T. Practical method for plasma lipoprotein analysis / F.T Hatch, R.S. Less //Adv. Lipid Res. — 1968.
- Vol. 6. - P. 2-68.
6. Fractionation of the C-apoproteins from human plasma very low density lipoproteins / P.N. Herbert, R.S. Shulman, R.I. Levy, D.S. Fredrickson //J. Biol. Chem.
- 1973. - Vol. 248. - № 14. - C. 4941-4946.
7. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
8. Tovey, E. Comparison of semi-dry add conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from poliacrilamide gels to nitrocellulose membranes / E. Tovey, A. Baldo // Electrophoresis. — 1987. — Vol. 8. — P. 384-387.
9. Панин, JI.E. Обнаружение иммунореактивности к аполипопротеинам А-I, В и Е в ядрах клеток тканей крыс / Л.Е. Панин, Г.С. Русских, Л.М. Поляков // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - № 12. - С. 1684-1689.
10. Sawyer, NJ. Observation on the role of the RES in the metabolism of adrenocortical steroids / N.J. Sawyer, R.S. Troop // Steroids. - 1963. - Vol. 2. - P. 213-227.
11. Панин, JI.E. Молекулярные механизмы регуляции клеточной пролиферации и опухолевого роста / Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН. - 2002. - № 2. -С. 8-14.
