CC BY
23
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
цитокинов, хемокинов, а также молекул адгезии и металло-протеиназ, способствуя активации остеокластов, миграции и пролиферации клеток иммунной системы в очаг воспаления, что приводит к разрушению хрящевой и костной ткани (Шнайдер М.А. и соавт., 2016). Несмотря на растущий интерес к фибробластоподобным синовиоцитам и их роли в патогенезе РА, большинство работ произведено на культурах клеток, полученных от больных пациентов (Crowley T et al., 2017). Следовательно, изучение провоспалительных свойств FLS, выделенных из мышиных суставов, in vitro остается актуальной проблемой и имеет особый интерес не только для лучшего понимания патологии в экспериментальных моделях воспалительных заболеваний суставов, но также может представлять интерес для изучения новых подходов антицитокиновой терапии.
Цель. Изучить патогенный фенотип FLS, выделенных из воспаленных суставов мышей, больных артритом, в сравнении с фибробластоподобными синовиоцитами, полученными от здоровых доноров.
В работе сравнивали культуры FLS, полученные от мышей дикого типа и мышей, дефицитных по TNF, в экспериментальной модели антитело-зависимого артрита. На четвертом пассаже первичные клеточные культуры стимулировали TNF и оценивали уровень экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени в культурах, полученных из здоровых и артритных мышиных суставов. Также был произведен анализ продукции IL6 культурами после стимуляции TNF и без нее методом иммунофер-ментного анализа (ELISA).
Было установлено, что активированные TNF фибробла-стоподобные синовиоциты от артритных мышей характеризуются повышенной экспрессией провоспалительных ци-токинов, хемокинов и молекул адгезии в сравнении с FLS из здоровых суставов. При этом было обнаружено, что у фи-бробластоподобных синовиоцитов, полученных от TNF KO мышей, в которых был индуцирован артрит, уровень продукции IL-6 значительно снижен относительно артритной культуры дикого типа, но превышает уровень его продукции у FLS из здоровых суставов, что коррелирует с отсутствием внешних признаков развития артрита и пониженной продукцией системного IL-6 у TNF-дефицитных мышей.
Полученные результаты подтверждают, что мышиные фибробластоподобные синовиоциты сохраняют патологический фенотип на протяжении нескольких пассажей, и в дальнейшем культуры FLS, полученные из артритных суставов мышей, можно использовать для изучения и создания новых подходов анти-цитокиновой терапии ревматоидного артрита.
Работа была осуществлена при поддержке РНФ 1425-00160.
РОЛЬ КАТЕПСИНА G В МОДУЛЯЦИИ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ ЛОКАЛЬНЫХ РЕНИН-АНГИОТЕНЗИНОВЫХ СИСТЕМ
Замолодчикова Т.С.1, Толпыго С.М.1, Свирщевская Е.В.2
1 Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина, Москва, Россия 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Многофункциональная сериновая протеаза имму-ноцитов катепсин G (Кат G), обладающая необычной
двойной трипсино- и химотрипсиноподобной специфичностью, синтезируется в нейтрофилах, моноцитах и тучных клетках. Кат G воздействует на функциональное состояние иммунных клеток, способствует миграции нейтрофилов и нейтрализации антигенов и считается фактором поддержания равновесия между защитой ткани и ее повреждением в условиях воспаления. Кат G является также компонентом ренин-ангиотензиновой системы (РАС), способен активировать ренин и обладает ангио-тензин-превращающими свойствами. Ангиотензин-II (А-II) является одним из ключевых медиаторов воспаления и, в качестве иммуномодулятора, может активировать инфильтрацию иммунокомпетентных клеток, воздействовать на клеточную пролиферацию, дифференци-ровку и хемотаксис. Локальная РАС слизистой тонкого кишечника представлена полным набором компонентов, локализованных, преимущественно в покровном эпителии, собственной пластинке (lamina propria) и мышечной пластинке (muscularis mucosae). Клетки иммунной защиты слизистой (нейтрофилы, тучные клетки, Т-лимфоциты) экспрессируют собственную клеточную РАС. Регуляция всех уровней функциональной активности кишечника осуществляется при непосредственном участии локальной РАС. Для установления возможной роли катепсина G в модуляции иммунных реакций с потенциальным участием ренин-ангиотензиновой системы, была проведена иммуногистохимическая локализация катепси-на G в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки (СОДПК) человека при отсутствии клинически выраженного воспаления и при воспалении (дуоденит II-III степени). В работе использовали моноклональные антитела к Кат G, меченые FITC и к компоненту рецептора CD14 (Novus Biologicals, USA). Биоптаты дуоденальной слизистой оболочки были получены в ходе эндоскопического обследования пациентов (диагноз — поверхностный проксимальный гастрит, дуодено-гастральный реф-люкс) с их информированного согласия.
В результате исследования были выявлены новые клеточные источники биосинтеза Кат G в СОДПК: межэпителиальные лимфоциты, лимфоциты собственной пластинки слизистой оболочки, большие глобулярные лимфоциты, кишечные макрофаги и специализированные эпителиоциты кишечных желез — клетки Панета. Биосинтез Кат G показан также в тучных клетках. В нашем исследовании мы впервые показали, что Кат G, традиционно рассматриваемый как один из эффекторов воспалительного процесса, конститутивно синтезируется в нормальной СОДПК, не имеющей клинически выраженных признаков воспаления. Полученные данные позволяют отнести Кат G к основным протеазам местного кишечного иммунитета. При воспалении уровень экспрессии катепсина G значительно возрастает за счет инфильтрата. В ходе двойного окрашивания биопсии воспалённой СОДПК антителами, специфичными к Кат G и к CD14 была выявлена ко-локализация Кат G и CD14 в значительной части иммуноцитов воспаленной слизистой оболочки, которые были идентифицированы как нейтрофилы и макрофаги. В некоторых случаях Кат G -специфическая флуоресценция обнаруживается на щеточной кайме энтероцитов и секрете бокаловидных клеток. В цитоплазме энтероцитов эпизодически встречаются мелкие гранулы, окрашивающиеся Кат G -специфическими антителами, что может быть следствием всасывания Кат G, сорбированного на щеточной кайме эн-тероцита путем эндоцитоза. Сорбция Кат G на щеточной
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
кайме и на слизистом секрете бокаловидных клеток указывает на возможность непосредственного контакта этой протеазы с имеющимися в этой зоне потенциальными субстратами, в том числе, проренином и ангиотензиноге-ном, что предполагает существование Кат G-зависимого пути активации локальной кишечной РАС.
Таким образом, каталитические свойства и клеточная локализация предполагают существование Кат G-зависимого пути активации локальной РАС в кишечном эпителии в норме. В условиях воспаления локальная РАС может дополняться нейтрофил-зависимой ангиотензин-генерирующей системой, инициирующей в очаге воспаления образование ангиотензинов, в том числе А-П, воздействующего на кровоток, проницаемость сосудов и инфильтрацию клеток, что, по-видимому, играет компенсаторную роль в экстремальных условиях.
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫС ПРИ ТИРЕОТОКСИКОЗЕ В ЭФФЕКТОРНУЮ ФАЗУ ИММУННОГО ОТВЕТА
Зенков А.Л.1, Годовалов А.П.1, Шилов Ю.И.1, 2
1ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения РФ, Пермь, Россия 2 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия
Ранее выявлена зависимость направленности изменений иммунного ответа от тяжести экспериментального тиреотоксикоза у крыс и участие в них функциональной экспрессии бета-адренорецепторов (Годовалов А.П., Шилов Ю.И., 2009; Шилов Ю.И., Годовалов А.П., 2012). Однако изменения функций перитонеальных лейкоцитов при тиреотоксикозе изучены недостаточно.
Цель. Оценка количественного состава и фагоцитарной активности перитонеальных клеток крыс при экспериментальном тиреотоксикозе в эффекторную фазу иммунного ответа.
Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 33 самцах белых крыс с исходной средней массой 313±4 г. Для моделирования тиреотоксикоза ежедневно подкожно вводили L-тироксин в течение 14 дней в суточной дозе 0,04 (1-я группа) или 4 мг/кг массы тела (2-я группа) (Годовалов А.П., Шилов Ю.И., 2009; Шилов Ю.И., Годовалов А.П., 2012). Крысы контрольной группы получали растворитель гормона. На 10-е сутки от начала эксперимента всех животных сенсибилизировали эритроцитами барана (108 клеток подкожно в правую стопу). На 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (109 эритроцитов подкожно в правую стопу). Через 24 ч (15-е сутки эксперимента) оценивали количественный состав перитонеальных клеток и их фагоцитарную активность по отношению к формалинизированным эритроцитам барана по ранее описанному методу (Шилов С.Ю., Шилов Ю.И., 2012). Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и критерия Дункана для множественных сравнений.
Результаты. Установлено, что у животных 1-й группы абсолютное число всех перитонеальных лейкоцитов составляет 164,2±2,7 (р < 0,05), у крыс 2-й группы — 104,0±8,9 (р > 0,05), а в контрольной группе — 132,1±15,6 млн клеток. У животных 1-й группы выявляется увеличение абсолютного числа перитонеальных лимфоцитов (85,0±5,6 млн
клеток, а в контрольной — 51,6±7,7 млн клеток; р < 0,05). Абсолютное количество перитонеальных мононуклеар-ных фагоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тучных клеток в сравниваемых группах статистически значимо не различается. При оценке фагоцитарной активности перитонеальных клеток установлено, что во 2-й группе существенно выше абсолютное число активно фагоцитирующих клеток, чем в контрольной и 1-й группах. Выявленные изменения фагоцитарной активности перитоне-альных клеток связаны, в первую очередь, с изменением фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов.
Заключение. Таким образом, при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном подкожным введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг массы тела, отмечается повышение фагоцитарной активности перитонеальных лейкоцитов преимущественно за счет мононуклеарных фагоцитов.
ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ЦИТОКИНОВЫХ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ НА РОСТ ПЕРЕВИВАЕМОЙ МЕЛАНОМЫ МЫШЕЙ
Золотарева Е.И., Златник Е.Ю., Шульгина О.Г., Новикова И.А., Быкадорова О.В.
ФГБУ«Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения РФ, Ростов-на-Дону, Россия
Введение. Цитокиновые препараты нашли применение в комплексном лечении злокачественных опухолей, в частности меланомы, однако их введение осуществляется преимущественно системно. Тем не менее, при проведении иммунотерапии, наряду с системным действием представляется возможным использовать и локальные эффекты цитокинов, способствующие коррекции микроокружения опухоли. Кроме того, оптимизация комбинаций цитокиновых препаратов для максимального проявления их противоопухолевого и иммуномодулирующего действия рассматривается как важное направление иммунотерапии опухолей.
Цель. Разработка и экспериментальное обоснование новых методов иммунотерапии перевиваемой меланомы с применением цитокиновых препаратов.
Материалы и методы. Эксперимент поставлен на 75 мышах линии С57В1/6 с перевиваемой меланомой В16, у которых после паратуморального введения в течение 8 дней различных комбинаций препаратов рекомбинант-ных цитокинов изучали динамику опухолевого роста. После эвтаназии, которую проводили через 3 дня, оценивали метастазирование в легкие и селезенку, морфологические характеристики меланомы, селезенки и тимуса, состав субпопуляций лимфоцитов в селезенке с помощью проточной цитофлюориметрии. Исследовали 6 групп живот-ных-опухоленосителей, получавших Ронколейкин (ГЬ-2), Ронколейкин + Доксорубицин, Ронколейкин + Ин-гарон (ШЫу), Ронколейкин + Ингарон + Рефнот (ТОТа с тимозином), цитостатик Доксорубицин (внутрибрю-шинно); контроль (физиологический раствор). Суммарные дозы препаратов рассчитывали, исходя из клинически рекомендованных в пересчете на массу тела мышей (18-20 г): Ронколейкин и Ингарон по 1200 МЕ, Рефнот 400 МЕ, доксорубицин 32 мкг.
Результаты. Оптимальной комбинацией оказалась Рон-колейкин + Ингарон, которая как в ходе введения, так и после его окончания вызывает торможение роста опухоли на
