CC BY
46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 577.218: 616.441-008.63: 618.145-0 0 6.6: 612.084 E01
РОЛЬ ИНТЕРФЕРИРУЮЩЕЙ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО НАДЗОРА И ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ РАКА ЭНДОМЕТРИЯ В УСЛОВИЯХ ПАТОЛОГИИ ЩИТОВИДНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ
Валерий Николаевич Запорожан, Анна Сергеевна Маринюк, Елена Леонидовна Холодкова*,
Дмитрий Юрьевич Андронов
Одесский национальный медицинский университет
Реферат
Цель. Оценка выраженности экспрессии маркёров пролиферации и дендритных клеток на фоне рака эндометрия при трансфекции siРНК (от англ. short interference — короткие интерферирующие молекулы рибонуклеиновой кислоты) в условиях экспериментальной патологии щитовидной железы.
Методы. Эксперименты проводили на 60 самках крыс, которые были распределены на пять групп: I — группа контроля, ПА и ША — животные с гипо- и гипертиреоидным состоянием и перевитой карциномой Герена; Ш> и ШБ — животные с гипо- и гипертиреоидным состоянием и перевитой карциномой Герена в комплексе с транс-фекционно введённой siРНК. Ортогональные размеры опухоли измеряли с 7-го дня после инокуляции опухолевой суспензии. Проводили иммуногистохимические исследования экспрессии маркёров пролиферации и дендритных клеток в опухолевой ткани после выведения животных из эксперимента.
Результаты. Было показано, что ингибирующее действие siРНК проявляется в большей степени при гипо-тиреоидном состоянии, указывая на важную роль гормонов щитовидной железы в регуляции экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл. Трансфекция siРНК приводит к повышению экспрессии зрелых дендритных клеток ^D83) в опухолевой ткани при гипотиреоидном состоянии и повышению экспрессии незрелых дендритных клеток (CD1a) при гипертиреоидном состоянии.
Вывод. Трансфекция siРНК тормозит пролиферацию опухолевых клеток в большей степени при гипотиреозе, чем при гипертиреозе.
Ключевые слова: siРНК, гипертиреоз, гипотиреоз, рак эндометрия, дендритные клетки.
THE ROLE OF INTERFERING RNA IN IMMUNE RESPONSE PROLIFERATIVE PROCESSES REGULATION IN EXPERIMENTAL MODEL OF ENDOMETRIAL CANCER ASSOCIATED WITH THYROID DISEASE V.M. Zaporozhan, G.S. Maryniuk, O.L. Kholodkova, D.U. Andronov. Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine. Aim. To assess the proliferation and dendritic cells markers expression degree at short interference RNA (siRNA) transfection in endometrial cancer associated with experimental thyroid disease. Methods. Experiments were performed on female rats distributed to five groups: I — control group; IIA and ПIА — animals with simulated hypo-and hyperthyroidism and transplanted Guerin’s carcinoma, Iffi and IIIB — animals with simulated hypo- and hyperthyroidism and transplanted Guerin’s carcinoma in combination with siRNA transfection. Orthogonal tumor dimensions were measured starting from the 7-th day after tumor suspension inoculation. Proliferation and dendritic cells markers expression were assessed in tumor samples by immunohistochemistry after the exclusion of animals from the experiment. Results. siRNA inhibitory effect was more marked in animals with hypothyroidism, indicating an important role of thyroid hormones in regulating cell cycle controlling genes expression. Transfection of siRNA increased mature dendritic cells (CD83) expression in tumor tissue in animals with hypothyroidism and increased immature dendritic cells (CD1a) expression in tumor tissue in animals with hyperthyroidism. Conclusion. siRNA transfection inhibits the tumor cells proliferation mainly at hypothyroidism compared to hyperthyroidism. Keywords: siRNA, hyperthyroidism, hypothyroidism, endometrial cancer, dendritic cells.
В последние годы изучению применения коротких интерферирующих молекул рибонуклеиновой кислоты ^РНК — от англ. short interference) в лечении онкологических заболеваний уделяют большое внимание. Искусственная индукция siРНК может быть использована в терапевтических целях для выключения различных патологических генов. Тем не менее, механизмы регулирования действия siРНК изучены недостаточно [12].
Дефицит гормонов щитовидной железы (ЩЖ) приводит к снижению ангиогенеза путём блокирования экспрессии фактора роста эндотелия сосудов [4]. Тироксин способен ингибировать апоптоз [9]. Кроме
Адрес для переписки: [email protected]
способности прямой стимуляции онкогенов, некоторые авторы называют влияние гормонов ЩЖ на субпопуляции Т-хелперов и других иммунокомпетентных клеток [5]. Есть данные о присутствии рецепторов ти-реотропного гормона и гормонов ЩЖ в лимфоцитах и дендритных клетках (ДК) — специализированных антиген-презентиру-ющих клетках, способных активизировать Т-клетки и регулировать адаптивный иммунитет [8].
Влияние тиреоидных гормонов на диф-ференцировку и функционирование ДК [6, 13] предполагает их возможную роль в контролировании начала адаптивного Т-клеточного иммунного ответа.
При изучении патогенеза различных онкологических заболеваний большое вни-
мание уделяют механизмам пролиферации и апоптоза опухолевых клеток, ангиогенезу, противоопухолевому иммунитету, однако данных об эпигенетических модификациях опухолевого роста при дисфункции ЩЖ очень мало.
Целью исследования была оценка степени выраженности экспрессии маркёра пролиферации Ю-67 и маркёров ДК (CD1a, CD40, CD83, CD86) в опухолевой ткани при трансфекции siРНК в условиях экспериментальной патологии ЩЖ.
Опыты проводили на 60 белых лабораторных крысах-самках с массой тела 180±20 г, которых содержали на стандартной диете вивария. Животные были распределены на три группы: I — группа контроля (п=12), II — группа с экспериментальным гипотиреозом (п=24), III — группа с экспериментальным гипертиреозом (п=24). При этом группы II и III подразделялись на две подгруппы (А и Б). Животным групп I, НА и ША трансплантировали карциному Герена путём подкожной инъекции в область спины между лопатками 0,5 мл суспензии опухолевых клеток (5-6х106 кл/мл), полученных от крыс-доноров (штамм опухоли был получен в Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавец-кого НАН Украины). Животным групп НЕ и ШБ вводили опухолевые клетки вместе с введённой методом трансфекции siРНК по такой же методике [10].
Гипотиреоидное состояние (подгруппы НА и НЕ) у крыс моделировали путём блокирования секреции тиреоидных гормонов тиреоцитами под влиянием тиама-зола (мерказолила, «Здоровье», Украина), который вводили 1 раз в сутки в дозе 5 мг на 100 г массы тела внутрижелудочно в течение 2 нед. Гипертиреоидное состояние (подгруппы ША и ШБ) моделировали путём внутрижелудочного введения 1 раз в сутки левотироксина натрия (^тироксина, «Берлин-Хеми», Германия) в дозе 50 мкг на 100 г массы тела в течение 2 нед.
Для получения опухолевой взвеси проводили предварительное выделение отдельных клеток опухолевой ткани путём её инкубации с коллагеназой (в концентрации 1 мкл/мл) в течение 1 ч при температуре 37 °С, после чего проводили дополнительное расщепление опухолевых клеток с помощью автоматизированной системы для механической дезагрегации тканей «BD Medimachine» (Германия). Опухолевые клетки фильтровали с помощью шприца че-
рез насадку «Steri-Dual» («3M Health Care», Германия). Подсчитывали опухолевые клетки в камере Горяева. Затем добавляли к ним среду RPMI 1640 до концентрации 5-6х 106 кл/мл.
Отдельно готовили смесь трансфекции. В стерильную пробирку к 4 мкл реагента трансфекции «Turbofect R-0537» («Fermentas») добавляли 100 мкл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы и перемешивали, тщательно встряхивая, после чего выдерживали разведённый реагент трансфекции при комнатной температуре 10-20 мин. К разбавленному реагенту трансфекции добавляли 1 мкл siРНК («Thermo scientific», USA), аккуратно перемешивая с помощью пипетки, и инкубировали при комнатной температуре 10-20 мин с целью формирования трансфекционных комплексов. Полученную смесь разводили 500 мкл культуральной среды RPMI 1640. Затем аспирировали питательную среду от опухолевых клеток и сразу же заменяли разведённой смесью трансфекции. Равномерно распределяли трансфецированные комплексы, осторожно покачивая тарелку.
Через 20-30 мин опухолевые клетки с введёнными методом трансфекции siFHX перевивали самкам крыс групп 11Б и IIIB подкожным введением в область спины между лопатками.
Наблюдали за развитием опухоли у подопытных животных в течении 21 сут, после чего выводили их из эксперимента путём декапитации под лёгким хлороформным наркозом.
Иммуногистохимическим методом определяли биомаркёры ДК (CD1a, CD40, CD83, CD86) с помощью стандартных наборов «Dako» (США) и маркёр пролиферации Ю-67 в опухолевой ткани, полученной от экспериментальных животных. Индекс пролиферации рассчитывали как процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток в пределах пролиферативного ком-партамента в пяти случайно выбранных полях зрения (>500 клеток) [1, 3].
Статистическая обработка проведена с помощью программы «Statistica 6.15» («StatSoft Inc.», США) [2].
Трансфекция siРНК существенно повлияла на динамику опухолевого роста (табл. 1). Замедление роста опухоли в подгруппах с трансфекционно введённой siРНК наблюдали уже с 9-го дня эксперимента. К 12-му дню объём опухоли в группе IIB был в 1,4 раза меньше, чем в группе НА, а в груп-
Таблица 1
Динамика роста опухоли (см3) в экспериментальных группах ^±111)
Группа Дни эксперимента
9-й 12-й 15-й 18-й 21-й
ПА 2,38±0,15 7,76±0,37 15,82±0,55 18,77±0,61 21,39±0,41
ПБ 1,71±0,08 5,5±0,15 8,02±0,25 11,41±0,44 15,92±0,48
ША 2,6±0,13 6,22±0,25 12,92±0,45 17,35±0,39 19,22±0,74
ШБ 1,62±0,14 5,18±0,17 9,5±0,31 14,83±0,64 18,53±0,72
Примечание: ПА — экспериментальный гипотиреоз; ПБ — экспериментальный гипотиреоз с трансфекцией siРНК; ША — экспериментальный гипертиреоз; ШБ — экспериментальный гипертиреоз с трансфекцией siРНК.
пе 111Б — в 1,2 раза меньше по сравнению с 111А. Наибольшее замедление роста опухоли в группах 11Б и 111Б отмечено на 15-й день эксперимента: объём опухоли в группе 11Б был в 1,9 раза меньше, чем в группе 11А, а в группе 111Б — в 1,4 раза меньше по сравнению с 111А. Затем разрыв в динамике роста опухоли начал уменьшаться, и к концу эксперимента объём опухоли в группе 11Б был в 1,3 раза меньше, чем в группе 11А, в то время как разница между объёмами опухолей в подгруппах с моделированным гипертиреозом (111А и 111Б) была вообще несущественной.
Анализируя данные иммуногистохими-ческого исследования маркёров ДК в опухолевой ткани, которую получали после выведения животных из эксперимента, можно сделать заключение, что как при гипо-, так и при гипертиреоидном состоянии характерным было снижение активности зрелых ДК ^83, CD86) (табл. 2).
Таблица 2
Функциональное состояние антиген-презентирующих клеток в опухолевой ткани
Примечание: I — группа контроля; ПА — экспериментальный гипотиреоз; ПБ — экспериментальный гипотиреоз с трансфекцией siРНК; ША — экспериментальный гипертиреоз; ШБ — экспериментальный гипертиреоз с трансфекцией siРНК.
При этом популяция незрелых ДК была значительно беднее при экспериментальном гипотиреозе. После трансфекции 81РНК уровень экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК повысился, однако при ги-342
потиреозе преобладали зрелые ДК (CD83), а при гипертиреозе — незрелые ДК (CD1a).
Индекс пролиферации опухолевых клеток для самок-крыс в группе I (контрольной) был меньшим по сравнению с экспериментальным гипо- и гипертиреозом без трансфекции з1РНК и составлял 9,8%. После трансфекции з1РНК при гипотире-оидном состоянии этот индекс уменьшился в 1,3 раза и почти не отличался от подобного показателя при гипертиреоидном состоянии. Если сравнивать индекс пролиферации опухолевых клеток для гипо- и гипертиреоза без применения трансфекции 81РНК и с ней, то нами отмечено, что в группе 11А (с моделированным гипотиреозом) он составлял 14,4%, тогда как в группе 11Б этот показатель был меньше в 2,5 раза и составлял всего 5,6%. В условиях экспериментального гипертиреоза после введения 81РНК индекс пролиферации почти не изменился: в группе ША он составлял 10,3%, а в III Б — 9,6%.
Учитывая тот факт, что дефицит гормонов ЩЖ угнетает ангиогенез [4], можно было предположить, что прогрессирование опухолевого роста на фоне гипотиреоза должно быть менее выраженным, чем при гипертиреозе. Однако в случае с раком эндометрия мы получили противоположную картину. По всей видимости, здесь необходимо учитывать наличие гиперэстрогене-мии, которая может оказывать стимулирующее влияние на фактор роста эндотелия сосудов, активизировать пролиферацию опухолевых клеток и подавлять их апоптоз [7, 14]. Таким образом, эстрогены играют важную роль в патогенезе рака эндометрия при гипотиреозе.
Существуют данные о том, что активированный фактор роста эндотелия сосудов угнетает иммунную систему в отношении противоопухолевой защиты, а это приводит к снижению экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК [11]. В результате проведённых
Мар- кёр Кон- троль Экспериментальный гипотиреоз Экспериментальный гипер-тиреоз
I ПА ПБ ША ШБ
СБ1а +/- - +/- +/- +
СБ40 + +/- +/- +/- +/-
СБ83 + +/- + +/- +/-
СБ86 +/- +/- +/- +/- +/-
исследований нами выявлено, что как при гипо-, так и при гипертиреозе происходит снижение активности зрелых ДК (СD83, CD86) в опухолевой ткани, при этом угнетение популяции незрелых ДК (CD1a, CD40) при гипотиреоидном состоянии более выражено. На основании вышеизложенного можно сделать заключение о том, что нарушение функций ЩЖ приводит к снижению диф-ференцировки ДК при раке эндометрия, причём дефицит гормонов ЩЖ препятствует миграции незрелых ДК в опухолевую ткань, подавляя механизмы противоопухолевого иммунного надзора. Повышение уровня экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК после трансфекции 81РНК в опухолевую ткань на фоне гипо- и гипертиреоидного состояния можно связать с тем фактом, что з1РНК способна подавлять активность фактора роста эндотелия сосудов [11].
Согласно полученным данным, применение трансфекции з1РНК к концу эксперимента уменьшило рост опухоли у крыс с гипотиреоидным состоянием на 25,5%, тогда как рост опухоли при гипертиреоидном статусе уменьшился всего на 3,5%, что позволяет предположить наличие у гормонов ЩЖ способности блокировать ингибирующее влияние 81РНК.
Учитывая тот факт, что в результате трансфекции 81РНК в опухолевую ткань индекс пролиферации опухолевых клеток при гипотиреозе уменьшился в 2,5 раза, а степень экспрессии маркёров ДК повысилась независимо от функционального состояния ЩЖ, можно говорить об антипролифера-тивном и иммуностимулирующем действии 81РНК при раке эндометрия, что подтверждает ещё большую перспективность применения 81РНК в лечении онкологических больных.
ВЫВОДЫ
1. В условиях экспериментальной модели рака эндометрия трансфекция з1РНК приводит к повышению экспрессии зрелых дендритных клеток (СD83) в опухолевой ткани при гипотиреоидном состоянии и незрелых дендритных клеток (CD1a) при ги-пертиреоидном состоянии.
2. Трансфекция siPHK тормозит пролиферацию опухолевых клеток в большей степени при гипотиреозе, чем при гипертиреозе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баударбекова М.М. Експреая Ki-67 та PCNA при гшерпластичних станах та аденокарцином! ендометр1я у жшок в перименопаузальному сташ // Онколопя. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 394.
2. Боровиков В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере (2-е издание). — М.: Медицина, 2007. — 700 с.
3. Зак М.Ю. Кштинне оновлення у слизовш оболонщ шлунка у хворих на хрошчний атроф1чний гастрит // Сучасна гастроентерол. — 2011. — Т. 2, №58. — С. 27-32.
4. Beruchashvili M.V., Tsagareli Z.G., Gogiashvili L.E. et al. Features of immunohistochemical markers expression in cervical epithelium under thyroid dysfunction // Georgian Med. News. — 2011. — Vol. 195. — С. 32-37.
5. Brent G.A. Mechanisms of thyroid hormone action // J. Clin. Inves. — 2012. — Vol. 122, N 9. — P. 3035-3043.
6. Dedecjus M, Stasiolek M, Brzezinski J. et al. Thyroid hormones influence human dendritic cells’ phenotype, function, and subsets distribution // Thyroid. — 2011. — Vol. 21, N 5. — Р. 533-540.
7. George A.L., Rajoria S., Suriano R. et al. Hypoxia and estrogen are functionally equivalent in breast cancer-endothelial cell interdependence // Mol. Cancer. — 2012. — Vol. 1. — Р. 80.
8. Klecha A.J., Genaro A.M., Gorelik G. et al. Integrative study of hypothalamus-pituitary-thyroid-immune system interaction: thyroid hormone-mediated modulation of lymphocyte activity through the protein kinase C signaling pathway // J. Endocrinol. — 2006. — Vol. 189, N 1. — Р. 45-55.
9. Liqun Z., Cooper-Kuhn C.M., Nannmark U. et al. Stimulatory effects of thyroid hormone on brain angioge-nesis in vivo and in vitro // J. Cereb. Blood Flow. Metab. — 2010. — Vol. 30, N 2. — Р. 323-335.
10. McNaughton B.R., Cronican J.J., Thompson D.B., Liu D.R. Mammalian cell penetration, siRNA transfection, and DNA transfection by supercharged proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2009. — Vol. 106, N 15. — Р. 6111-6116.
11. Ni Y.H., Wang Z.Y., Huang X.F. et al. Effect of siRNA-mediated downregulation of VEGF in Tca8113 cells on the activity of monocyte-derived dendritic cells // Oncol. Lett. — 2012. — Vol. 3, N 4. — P. 885-892.
12. Shibata M.A., Ambati J., Shibata E. et al. Mammary cancer gene therapy targeting lymphangiogenesis: VEGF-C siRNA and soluble VEGF receptor-2, a splicing variant // Med. Mol. Morphol. — 2012. — Vol. 45, N 4. — Р. 179-184.
13. Stasiotek M, Adamczewski Z, Puta B. et al. Distribution of subpopulations of dendritic cells in peripheral blood of patients treated with exogenous thyrotropin // Thyroid Res. — 2012. — Vol. 5, N 1. — Р. 18.
14. Wincewicz A., Baltaziak M, Kanczuga-Koda L. et al. STAT3 and apoptosis regulators: Bak and Bcl-xL in endometrioid adenocarcinomas of different estrogenreceptor-a immunoprofile // Gynecol. Endocrinol. — 2011. — Vol. 27, N 8. — Р. 536-540.
