Научная статья на тему 'Роль индуцибельной NO-синтазы в механизмах регуляции функциональной активности кальций-активируемых калиевых каналов коронарных сосудов у крыс, адаптированных к стрессу'

Роль индуцибельной NO-синтазы в механизмах регуляции функциональной активности кальций-активируемых калиевых каналов коронарных сосудов у крыс, адаптированных к стрессу Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY
80
38
Поделиться
Ключевые слова
ВКСА -КАНАЛЫ / АДАПТАЦИЯ / ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ NO-СИНТАЗА / ВКСА -CHANNELS / ADAPTATION / INDUCIBLE NO-SYNTHASE

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Лазуко С.С.

Цель изучить влияние индуцибельной NO-синтазы (iNOS) на функциональную активность кальций-активируемых калиевых каналов большой проводимости (ВКСа -каналов) гладкомышечных клеток коронарных сосудов крыс в процессе формирования адаптации к стрессу. Эксперименты выполнены на 134 белых беспородных крысах-самках массой 200-250 г. Адаптацию проводили иммобилизацией животных в вертикальном положении в пластиковом пенале, заполненном водой (t=23±2°C) до уровня шеи, в течение 8 суток. Тонус коронарных сосудов и сократительную функцию миокарда исследовали на препаратах сердец крыс, изолированных по методу Лангендорфа и перфузируемых в условиях постоянной объемной скорости коронарного потока (10 мл/мин) раствором Кребса-Хензелайта стандартного состава. Блокаду iNOS осуществляли S-метилизотиомочевиной (S-MT, 10-6 М). Для изучения роли ВКСа -каналов в регуляции тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда в перфузионный раствор добавляли блокатор ВКСа -каналов тетраэтиламмоний (ТЭА) в концентрации 1 мМ. Вклад ВКСа -каналов в регуляцию тонуса сосудов сердца определяли по величине вазоконстрикторного эффекта ТЭА, т.е. по величине прироста коронарного перфузионного давления. Концентрацию iNOS и эндотелиальной NO-синтазы (еNOS), стабильных продуктов деградации NO (NO2-/NO3-), определяли иммуноферментным и спектрофотометрическим методами, соответственно. Установлено, что добавление в перфузионный раствор S-MT не приводит к изменению тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда как в контрольной, так и в группе адаптированных животных. Коронароконстрикторный эффект ТЭА у адаптированных животных выражен в той же степени, что и в контроле. При совместной блокаде ВКСа -каналов и iNOS в группе адаптированных животных отмечается увеличение коронарного перфузионного давления на 30% по сравнению с контрольными показателями в этих же условиях. Характерное для адаптации увеличение концентрации NO2-/NO3-наблюдается на фоне снижения концентрации в сыворотке крови iNOS и повышения еNOS. Заключение. При адаптации к стрессу наблюдается увеличение функциональной активности ВКСа -каналов, которое проявляется лишь после блокады iNOS, что указывает на выраженную зависимость их активности от NO, продуцируемого данным ферментом.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Лазуко С.С.,

THE ROLE OF THE INDUCIBLE NO-SYNTHASE IN THE REGULATION MECHANISMS OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE ВКCa-CHANNELS IN THE CORONARY VESSELS OF RATS ADAPTED TO STRESS

To investigate the influence of the inducible NO-synthase (iNOS) on the functional activity of potassium ion channels activated by calcium with high conduction (ВКСа -channels) in the smooth muscle cells of the coronary vessels of rats in the process of the formation of adaptation to stress. Experiments were carried out on 134 female white mongrel rats weighing 200-250 g. Adaptation to stress was reproduced by upright immobilization of rats in the plastic box filled with water (t=23±2°C) up to the level of the neck during 8 days. Coronary vessels’ tone and myocardial contractility were investigated on isolated by Langendorff’s method rats’ hearts perfused at the constant coronary flow (10 ml/min) with the standard composition of Krebs-Henseleight solution. The blockade of iNOS was realized with S-methylisothiourea (S-MT, 10-6 M). Tetraethylammonium (TEA), a blocker of ВКСа -channels, was added to the perfusion solution (1 mM) to evaluate the role of these channels in the regulation of the coronary blood flow and myocardial contractility. The contribution of ВКСа -channels to the regulation of coronary vessels’ tone was assessed by TEA-mediated vasoconstriction effect, i.e. the increment of the coronary perfusion pressure. The concentration of iNOS, endothelial NO-synthase (eNOS) and stable products of NO degradation (NO2-/NO3-) were detected with immunoenzyme assay and spectrophotometric methods, accordingly. It has been established that the addition of S-MT to the perfusion solution doesn’t lead to any changes of the coronary vessels’ tone and myocardial contractility both in the control group and in the group of the «adapted to stress». Animals coronary constrictor effect of TEA in the adapted animals was expressed to the same extend as in the control group. A simultaneous blockade of ВКСа -channels and iNOS results in the increase of coronary perfusion pressure by in the group of adapted animals 30% compared with the control data under the same conditions. A typical for the adaptation elevation of NO2-/NO3-concentration was accompanied by a decrease of iNOS and an increase of eNOS concentration. Conclusions. The adaptation to stress leads to the functional activation of the ВКСа -channels, which reveals itself only after the blockade of iNOS, thus demonstrating strong dependence of their activity on the iNOS-derivednitric oxide.

Текст научной работы на тему «Роль индуцибельной NO-синтазы в механизмах регуляции функциональной активности кальций-активируемых калиевых каналов коронарных сосудов у крыс, адаптированных к стрессу»

ФИЗИОЛОГИЯ

© ЛАЗУКО С.С., 2016

РОЛЬ ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ КОРОНАРНЫХ СОСУДОВ У КРЫС, АДАПТИРОВАННЫХ К СТРЕССУ

ЛАЗУКО С.С.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», г.Витебск, Республика Беларусь

Вестник ВГМУ. - 2016. - Том 15, №2. - С. 34-43.

THE ROLE OF THE INDUCIBLE NO-SYNTHASE IN THE REGULATION MECHANISMS OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE ВКГ -CHANNELS IN THE CORONARY VESSELS

Ca

OF RATS ADAPTED TO STRESS LAZUKO S.S.

Educational Establishment «Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Médical University», Vitebsk, Republic of Belarus Vestnik VGMU. 2016;15(2):34-43.

Резюме.

Цель - изучить влияние индуцибельной NO-синтазы (iNOS) на функциональную активность кальций-акти-вируемых калиевых каналов большой проводимости (ВКСа-каналов) гладкомышечных клеток коронарных сосудов крыс в процессе формирования адаптации к стрессу.

Эксперименты выполнены на 134 белых беспородных крысах-самках массой 200-250 г. Адаптацию проводили иммобилизацией животных в вертикальном положении в пластиковом пенале, заполненном водой (t=23±2°C) до уровня шеи, в течение 8 суток. Тонус коронарных сосудов и сократительную функцию миокарда исследовали на препаратах сердец крыс, изолированных по методу Лангендорфа и перфузируемых в условиях постоянной объемной скорости коронарного потока (10 мл/мин) раствором Кребса-Хензелайта стандартного состава. Блокаду iNOS осуществляли S-метилизотиомочевиной (S-MT, 10-6М). Для изучения роли ВКСа-каналов в регуляции тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда в пер-фузионный раствор добавляли блокатор ВКСа-каналов тетраэтиламмоний (ТЭА) в концентрации 1 мМ. Вклад ВКСа-каналов в регуляцию тонуса сосудов сердца определяли по величине вазоконстрикторного эффекта ТЭА, т.е. по величине прироста коронарного перфузионного давления. Концентрацию iNOS и эндотелиальной NO-синтазы ^NOS), стабильных продуктов деградации NO (NO2-/NO3-), определяли им-муноферментным и спектрофотометрическим методами, соответственно.

Установлено, что добавление в перфузионный раствор S-MT не приводит к изменению тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда как в контрольной, так и в группе адаптированных животных. Коронароконстрикторный эффект ТЭА у адаптированных животных выражен в той же степени, что и в контроле. При совместной блокаде ВКСа-каналов и iNOS в группе адаптированных животных отмечается увеличение коронарного перфузионного давления на 30% по сравнению с контрольными показателями в этих же условиях. Характерное для адаптации увеличение концентрации NO2-/NO3- наблюдается на фоне снижения концентрации в сыворотке крови iNOS и повышения еNOS.

Заключение. При адаптации к стрессу наблюдается увеличение функциональной активности ВКСа-каналов, которое проявляется лишь после блокады iNOS, что указывает на выраженную зависимость их активности от NO, продуцируемого данным ферментом.

Ключевые слова: ВКСа-каналы, адаптация, индуцибельная NO-синтаза.

Abstract.

To investigate the influence of the inducible NO-synthase (iNOS) on the functional activity of potassium ion channels activated by calcium with high conduction (BKCa-channels) in the smooth muscle cells of the coronary vessels of rats in the process of the formation of adaptation to stress.

Experiments were carried out on 134 female white mongrel rats weighing 200-250 g. Adaptation to stress was reproduced by upright immobilization of rats in the plastic box filled with water (t=23±2°C) up to the level of the neck during 8 days. Coronary vessels' tone and myocardial contractility were investigated on isolated by Langendorffs method rats' hearts perfused at the constant coronary flow (10 ml/min) with the standard composition of Krebs-Henseleight solution. The blockade of iNOS was realized with S-methylisothiourea (S-MT, 10-6 M). Tetraethylammonium (TEA), a blocker of BKCa-channels, was added to the perfusion solution (1 mM) to evaluate the role of these channels in the regulation of the coronary blood flow and myocardial contractility. The contribution of BKCa-channels to the regulation of coronary vessels' tone was assessed by TEA-mediated vasoconstriction effect, i.e. the increment of the coronary perfusion pressure. The concentration of iNOS, endothelial NO-synthase (eNOS) and stable products of NO degradation (NO2-/NO3-) were detected with immunoenzyme assay and spectrophotometric methods, accordingly.

It has been established that the addition of S-MT to the perfusion solution doesn't lead to any changes of the coronary vessels' tone and myocardial contractility both in the control group and in the group of the «adapted to stress». Animals coronary constrictor effect of TEA in the adapted animals was expressed to the same extend as in the control group. A simultaneous blockade of BKCa-channels and iNOS results in the increase of coronary perfusion pressure by in the group of adapted animals 30% compared with the control data under the same conditions. A typical for the adaptation elevation of NO2-/NO3- concentration was accompanied by a decrease of iNOS and an increase of eNOS concentration.

Conclusions. The adaptation to stress leads to the functional activation of the BKCa-channels, which reveals itself only after the blockade of iNOS, thus demonstrating strong dependence of their activity on the iNOS-derived nitric oxide.

Key words: ВКСа-channels, adaptation, inducible NO-synthase.

Умеренный эмоциональный стресс вызывает многовекторный метаболический и кардиоваскулярный ответ, обеспечивающий адаптацию организма к возможным последующим более тяжелым стрессорным воздействиям. Исследования на изолированных сердцах мышей показали, что кардиопро-текция, вызванная прекондиционированием, устраняется блокадой кальций-активируемых калиевых каналов большой проводимости (ВКСа-каналы), активатор ВКСа-каналов N8-1619 оказывает кардиопротективный эффект [1]. Эти наблюдения доказывают, что наряду с К -каналами, ВК -каналы вовлечены в

АТФ ' Са

механизмы защиты сердца от ишемических инсультов [1]. ВКСа-каналы, расположенные в гладкомышечных клетках сосудистой стенки, принимают также участие в регуляции сосудистого тонуса [2]. Нарушение экспрессии гена, кодирующего в 1-субъединицу ВКСа-каналов, приводит к его увеличению и развитию артериальной гипертензии [3]. Снижение функциональной активности ВК -каналов является

Са

одной из причин сосудистых «катастроф» при сахарном диабете [4], а ее увеличение при геморрагическом шоке сопровождается разви-

тием гипореактивности сосудов [5].

Активность ВК -каналов может изме-

Са

няться под влиянием эндогенных сосудорасширяющих веществ [6]. Существует две гипотезы, объясняющие эффект монооксида азота (N0) на ВКСа-каналы. Одна из них связана с активацией N0 растворимой гуанилатцикла-зы с последующим увеличением производства цГМФ и активацией цГМФ-зависимой протеинкиназы, которая увеличивает активность ВКСа-каналов. Существуют данные о прямом влиянии N0 на ВКСа-каналы [6]. Можно предположить, что ВКСа-каналы способны изменять свою активность под действием биологически активных веществ, в частности вазоактивных метаболитов эндотелиального происхождения. Менее изучена роль ВКСа-каналов в регуляции тонуса коронарных сосудов при таких состояниях организма, когда образование вазоактивных метаболитов возрастает, включая адаптацию к стрессу. В ряде исследований было показано, что активность индуцибельной N0-синтазы ^N08) вносит существенный вклад в формирование эффектов пре-, посткондиционирования и адаптации к факторам среды [7]. Однако роль N0, обра-

зуемого iNOS, в модуляции функциональной активности ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов недостаточно исследована. В связи с этим целью работы было изучить влияние iNOS на функциональную активность кальций-активируемых калиевых каналов большой проводимости гладкомы-шечных клеток коронарных сосудов крыс в процессе формирования адаптации к стрессу.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на 134 половозрелых беспородных белых крысах-самках массой 200-250 г в осенне-зимний период. Животные содержались в стандартных условиях и имели свободный доступ к воде и пищи. Крысы были распределены на 4 группы: 1 -«контроль»; 2 - «стресс»; 3 - «адаптация»; 4 -«адаптация+стресс». Каждая группа включала 3 подгруппы: 1 - добавление в перфузионный раствор блокатора ВКСа-каналов тетраэтилам-мония (ТЭА); 2 - содержание в перфузате бло-катора iNOS S-метилизотиомочевины (S-MT); 3 - совместное добавление в перфузионный раствор ТЭА и S-MT.

Эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990).

Экспериментальные модели. Адаптация к стрессу: крыс помещали в пластиковый пенал и погружали вертикально в воду (t=23±2°C) до уровня шеи в первый день на 5 минут, во второй день на 10 минут, в третий день на 15 минут, после двухдневного перерыва процедуру повторяли по той же схеме [8]. Стресс вызывали путем фиксации животных в положении на спине без ограничения подвижности головы в течение 6 часов. По окончании иммобилизации крыс выпускали на 90 минут в клетку, затем брали в эксперимент.

Тонус коронарных сосудов и сократительную функцию миокарда изучали на препаратах сердец крыс, изолированных по Лан-гендорфу. Сердца перфузировали раствором Кребса-Хензелайта стандартного состава, насыщенным карбогеном (95% О2 и 5% СО2), в условиях постоянного потока, при объемной скорости коронарного потока (ОСКП), составлявшей 10 мл/мин. Использовали установ-

ку для перфузии изолированного сердца мелких лабораторных животных IH-SR типа 844/1 (HSE-HA, ФРГ), оборудованную датчиками для измерения аортального и развиваемого внутрижелудочкового давления (РВД) (Isotec pressure transducer). Датчики были соединены с модулями для измерения давления ТАМ-А, HSE-HA. Компьютерную регистрацию и обработку измеряемых показателей осуществляли с помощью программы ACAD (HSE, ФРГ). Сердца сокращались в постоянном ритме с частотой 240 ударов в минуту при подаче импульсов от электростимулятора С тип - 224 (HSE-HA, ФРГ). По истечении 15 минут, необходимых для стабилизации работы сердец, регистрировали РВД при помощи латексного баллончика постоянного объема, находящегося в левом желудочке.

Для изучения роли оксида азота, продуцируемого iNOS, в механизмах регуляции тонуса коронарных сосудов в перфузионный раствор добавляли высокоселективный блокатор iNOS S-метилизотиомочевину (S-MT, 10-6М, Sigma, USA). Роли ВКСа-каналов в регуляции тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда исследовали при помощи блокатора ТЭА в концентрации 1 мМ. Вклад ВКСа-каналов в регуляцию тонуса сосудов сердца определяли по величине вазоконстрик-торного эффекта ТЭА, т.е. по величине прироста коронарного перфузионного давления, выраженного в % от исходного уровня.

Иммуноферментный анализ. Концентрацию ферментов iNOS и эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя тест-системы и реагенты для iNOS (Uscn, Life Science Inc. China, Lot L130827587) и eNOS (Cloud-Clone Corp. USA, Uscn, Life Science Inc., Lot L141013209), с помощью фотометра универсального Ф-300 ТП при ^=450 нм. Содержание iNOS в сыворотке крови выражали в нг/мл, eNOS в пг/мл.

Концентрацию стабильных продуктов деградации NO (NO2-/NO3-) в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грисса при длине волны 540 нм результат выражали в мкМ [9].

Концентрацию С-реактивного белка в сыворотке крови определяли диагностическим набором C-Reactive Protein (CRP) BioSystems

(Испания), иммунотурбидиметрическим методом по инструкции производителя. Содержание С-реактивного белка выражали в мг/л.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью стандартного пакета статистических программ «STATISTICA 10.0» и «MS Excel». Величины количественных показателей в экспериментальных группах представляли в виде медианы (Ме), интерквартильного интервала [25%; 75%]. О достоверности различий между несвязанными выборками судили по критерию Манна-Уитни (U) и Уилкоксона (W). Проверку статистических гипотез выполняли при критическом уровне значимости 5% (p<0,05).

Результаты

В сердцах животных, перенесших стресс, коронарное перфузионное давление (КПД) и РВД снижалось в среднем на 23%, по сравнению с контрольными показателями (р<0,05) (табл. 1, рис. 1). Добавление в перфузионный раствор блокатора iNOS при перфузии сердец животных, перенесших стресс, приводило к восстановлению тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда до контрольных значений. Введение ТЭА в коронарное русло изолированных сердец крыс, под-

вергнутых иммобилизации, сопровождалось увеличением КПД на 68%, т.е. на 27% меньше, чем в контроле (р<0,05) (табл. 1, рис 2), РВД при этом не изменялось. Следовательно, стресс снижал эффективность действия ТЭА в отношении величины КПД, что может быть обусловлено снижением функциональной активности ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов. В изолированных сердцах крыс группы «Стресс» на фоне блокады синтеза N0 интракоронарное введение ТЭА увеличивало КПД на 88% (табл. 1), развиваемое внутрижелудочковое давление было сопоставимо с контрольными показателями при совместной блокаде iN0S и ВКСа-каналов (табл. 1).

Таким образом, продолжительный эмоционально-болевой стресс у крыс подавляет активность ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов и создает выраженную зависимость их активности от функционирования iN0S.

В сердцах животных, адаптированных к стрессу, КПД и РВД не отличались от таковых в контроле (табл. 1, рис. 1). Добавление в пер-фузионный раствор S-MT не сопровождалось изменениями КПД и сократительной функции сердца, адаптированных к стрессу животных (табл. 1). Под влиянием ТЭА в группе живот-

Рисунок 1 - Влияние стресса и адаптации на величину развиваемого внутрижелудочкового давления: по оси абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - «Контроль»; 2 - «Стресс»; 3 - «Адаптация»; 4 - «Адаптация+стресс»; по оси ординат - величина развиваемого внутрижелудочкового давления в мм рт. ст.; [25%-75%] - интерквартильный интервал, ДИ - доверительный интервал; * - р<0,05, по сравнению с группой «Контроль».

ы 00

Таблица 1 - Влияние стресса и адаптации на изменение коронарного перфузионного давления изолированного сердца крысы

Группы экспериментальных животных и условия перфузии миокарда

Показатель Контроль без блокатора (п=8) Стресс без блокатора (п=8) Адаптация без блокатора (п=8) Адаптация+стресс без блокатора (п=8)

Медиана, % 81,00 64,00 76,00 79,50

р<0,0009

Размах (Min-Max), % 75,00-95,00 55,00-69,00 69,00-86,00 72,00-86,00

95% ДИ для медианы, % 75,73-86,27 59,89-68,11 71,41-80,56 75,40-83,60

25-75 процентиль, % 77,50-85,00 59,00-65,50 74,50-80,25 75,75-80,00

Контроль с Стресс с Адаптация с Адаптация+стресс с

S -метилизотиомочевиной S-метилизотиомочевиной S -метилизотиомочевиной S-метилизотиомочевиной

(п=8) (п=8) (п=8) (п=8)

Медиана, % 87,00 81,00 80,50 80,50

Р2<0,0026

Размах (Min-Max), % 75,00-100,00 65,00-88,00 65,00-96,00 72,00-85,00

95% ДИ для медианы, % 79,63-94,37 75,14-86,86 69,73-91,27 76,86-84,14

25-75 процентиль, % 81,50-95,75 78,50-83,50 66,00-89,75 79,00-83,50

Контроль с Стресс с тетраэтиламмонием Адаптация с Адаптация+стресс с

тетраэтиламмонием (п=8) (п=8) тетраэтиламмонием (п=8) тетраэтиламмонием (п=8)

Медиана, % 160,00 102,50 157,50 164,00

Р,<0,017 Р<0,001; Р2<0,017; Р3<0,0014 Р<0,0014; Р2<0,0015 Р<0,0014; Р2<0,0015

Размах (Min-Max), % 140,00-179,00 97,00-118,00 135,00-165,00 145,00-187,00

95% ДИ для медианы, % 151,01-168,99 96,11-108,89 148,50-166,49 152,55-175,45

25-75 процентиль, % 155,75-165,00 99,50-111,00 145,00-161,00 157,50-171,50

Контроль с Стресс с тетраэтиламмонием и S-метилизотиомочевиной Адаптация с Адаптация+стресс с

тетраэтиламмонием и S -метилизотиомочевиной (п=8) тетраэтиламмонием и S -метилизотиомочевиной (п=8) тетраэтиламмонием и S-метилизотиомочевиной (п=8)

(п=8)

Медиана, % 173,00 159,00 176,00 178,00

Р<0,0015 Р<0,0014; Р2<0,0015 Р<0,001; Р2<0,001; Р3<0,011 Р1<0,001; Р2<0,001; Р3<0,011

Размах (Min-Max), % 139,00-181,00 121,00-163,00 146,00-187,00 174,00-195,00

95% ДИ для медианы, % 158,56-187,44 146,66-171,34 162,68-189,32 172,16-183,84

25-75 процентиль, % 147,25-177,50 142,50-159,25 155,50-185,00 175,75-181,00

А ^

А

И

Я ^

о

Со

К -

А А

Примечание: р1 - по сравнению с контрольной группой животных без блокатора; р2 - по сравнению с той же группой, но без блокатора; р3 - по сравнению с группой «контроль», содержащей тетраэтиламмоний. п - количество животных в группе.

ных «Адаптация» КПД увеличивалось на 98%, РВД не изменялось, и было выражено в той же степени, что и в контроле (рис. 2). Совместное

интракоронарное введение S-MT и ТЭА сопровождалось увеличением КПД на 117% (р<0,05, по сравнению с контрольными показателями

140

60

□ Медиана

□ 25%-75%

X ДИ минимум; максимум

Рисунок 2 - Влияние блокады ВКСа-каналов тетраэтиламмонием (ТЭА) на изменение величины коронарного перфузионного давления у экспериментальных животных: по оси абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - «Контроль+ТЭА»; 2 - «Стресс+ТЭА»; 3 - «Адаптация+ТЭА»; 4 - «Адаптация+стресс+ТЭА»; по оси ординат - величина коронарного перфузионного давления, выраженная в %; [25%-75%] - интерквартильный интервал, ДИ - доверительный интервал; * - р<0,05, по сравнению с группой «Контроль +ТЭА».

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60

Т

т

□ Медиана

□ 25%-75%

I ДИ минимум; максимум

Рисунок 3 - Влияние совместной блокады ВКСа-каналов тетраэтиламмонием (ТЭА) и iN0S - S-метилизотиомочевиной ^-МТ) на изменение величины коронарного перфузионного у экспериментальных животных: по оси абсцисс - группы экспериментальных животных: 1 - «Контроль+S-MT+ТЭА»; 2 - «Стресс+ S-MT+ТЭА»; 3 - «Адаптация +S-MT+ТЭА»; 4 - «Адаптация+стресс+ S-MT+ТЭА»; по оси ординат - величина коронарного перфузионного давления, выраженная в %; [25%-75%] - интерквартильный интервал, ДИ - доверительный интервал; * - р<0,05, по сравнению с группой «Контроль+S-MT+ТЭА».

2

3

4

2

3

4

при совместной блокаде iN0S и ВКСа-каналов (рис. 3), сократительная функция миокарда при этом не изменялась. Следовательно, блокада iN0S увеличила функциональную активность ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов у крыс, адаптированных к стрессу.

В группе животных «Адаптация+стресс», КПД и РВД не отличались от показателей, выявленных в сердцах контрольных животных. Добавление в перфузионный раствор высокоселективного блокатора S-MT не оказывало влияния на изменение КПД и сократительной функции миокарда в группе животных «адаптация+стресс» (табл. 1). Добавление в перфузионный раствор ТЭА сопровождалось изменением КПД и РВД в равной степени, что и в контрольной группе животных (табл. 1, рис. 2). В группе животных «Адаптация+стресс» при совместной блокаде iN0S и ВКСа-каналов наблюдалось увеличение КПД на 125% (р<0,05, по сравнению с контрольными показателями при совместной блокаде iN0S и ВКСа-каналов (рис. 3). В отношении сократительной функции миокарда коронарокон-стрикторный эффект ТЭА, был выражен в той же степени, что без добавления в перфузион-ный раствор блокатора S-MT. Исходя из вышеприведённых фактов можно заключить, что

адаптация к стрессу предупредила постстрес-сорное нарушение тонуса коронарных сосудов и сократительной функции миокарда, а также вызываемое стрессом снижение функциональной активности ВК„ -каналов.

Са

Методом ИФА установлено, что в группе животных, перенесших стресс, концентрация еN0S в сыворотке крови снижалась на 54%, а индуцибельной возрастала в 8 раз. В группе «адаптация» и «адаптация+стресс» содержание фермента eN0S увеличивалось в одинаковой степени в 1,3 раза, а концентрация iN0S не отличалась от контрольных показателей.

Концентрация N02"/N03" в сыворотке крови крыс группы «стресс» и «адаптация» увеличивалась на 41 и 20% (р<0,05) (табл. 2) соответственно, по сравнению с контрольными значениями. В группе «адаптация+стресс» концентрация N02VN03" была такой же, как в контроле.

В группе «стресс» концентрация С-реактивного белка увеличивалась в 2 раза, по сравнению с контрольными показателями (р<0,05), напротив, в группах «адаптация» и «адаптация+стресс» концентрация С-реактивного белка не отличалась от показателей группы «контроль» (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние адаптации на концентрацию N02VN03" и С-реактивного белка в сыворотке крови экспериментальных животных

Группа Показатель Ш2-/Ш3-, мкМ С-реактивный белок, мг/л

Контроль (п=9) Медиана, % 24,2 0,21

Размах (Мш-Мах), % 18,0-31,10 0,06-0,25

95% ДИ для медианы, % 21,11-27,29 0,13-0,29

25-75 процентиль, % 21,60-26,70 0,07-0,23

Стресс(п=9) Медиана, % 33,06 р<0,01 0,36 р<0,04

Размах (Мш-Мах), % 22,44-44,94 0,12-0,48

95% ДИ для медианы, % 26,55-39,58 0,24-0,39

25-75 процентиль, % 29,94-43,06 0,24-0,39

Адаптация (п=9) Медиана, % 31,81 р<0,0001 0,05

Размах (Мш-Мах), % 26,81-35,56 0,03-0,26

95% ДИ для медианы, % 31,81-29,52 0,01-0,11

25-75 процентиль, % 29,31-33,69 0,04-0,06

Адаптация+стресс(п=9) Медиана, % 23,5 0,20

Размах (Мш-Мах), % 19,60-27,50 0,05-0,60

95% ДИ для медианы, % 21,55-25,45 0,05-0,35

25-75 процентиль, % 21,60-24,30 0,18-0,22

Примечание: р - по сравнению с группой «контроль»; п-количество животных в группе.

Обсуждение

Адаптация к стрессу предупредила пост-стрессорное нарушение тонуса коронарных сосудов и снижение сократительной функции миокарда, а также вызванное иммобилизаци-онным стрессом снижение эффективности действия тетраэтиламмония на тонус коронарных сосудов. После адаптации к стрессу блокада ¡N08 приводила к повышению активности ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов. Этот факт наводит на мысль о том, что N0, образуемый ¡N08 при адаптации к стрессу, ограничивает, но в отличие от иммобилизации не нарушает функциональную активность ВКСа-каналов.

Обнаружение двукратного увеличения содержания С-реактивного белка в крови крыс группы «стресс» отражает развитие в этих условиях системного воспаления низкой интенсивности [10]. Системное воспаление низкой интенсивности в наших исследованиях сопровождается снижением концентрации еN08 на 54%, что может свидетельствовать о разобщении данного фермента [11], в результате чего еN0S, помимо N0, может производить супероксидный радикал или другие активные формы кислорода с последующим уменьшением биодоступности N0 при стрессе [11].

Адаптация к стрессу так же, как и иммобилизация, сопровождается усилением продукции N0 [12], но, в отличие от стресса, низкой концентрацией фермента ¡N08, и увеличенной концентрацией фермента еN0S, а также отсутствием системного воспаления низкой интенсивности. К основным механизмам адаптации можно отнести ограничение постстрессорной активации перекисного окисления липидов мембран [13], гиперпродукции монооксида азота и усиление его депонирования в эндотелии и гладкомышечных клетках кровеносных сосудов [14], увеличение образования белков теплового шока, сохранение функции ионных насосов, а также регуляцию редокс-состояния клеток [6, 15]. Регуляция редокс-состояния клеток приводит к изменению их фенотипических свойств и, тем самым, предотвращает нарушение функции калиевых каналов при адаптации к стрессу. В качестве одного из механизмов, лежащих в основе контроля постстрессорной активности ¡N08 при адаптации, можно рассматривать и формиро-

вание так называемых «аггресом» (aggresome) [16]. Формирование «аггресом», включающих белок iNOS, происходит в цитозоле, там же локализуется и индуцибельная NO-синтаза. Образуемый ею NO оказывает прямое влияние на механизм сокращения миофиламентов гладкомышечных клеток коронарных сосудов и кардиомиоцитов. Клетки, в которых iNOS располагается преимущественно в составе «аггресом», продуцируют монооксид азота в значительно меньших концентрациях. Таким образом, формирование аггресом в цитозоле можно рассматривать как механизм ограничения постстрессорной гиперпродукции NO индуцибельной NO-синтазой [17].

Заключение

Полученные экспериментальные данные позволяют констатировать, что активация ин-дуцибельной NO-синтазы в результате адаптации к стрессу, вероятно, играет важную роль в поддержании адекватной биодоступности NO, участвующего в механизмах локальной регуляции тонуса сосудов сердца. Усиленная продукция эндотелием NO (и, возможно, других веществ эндотелиального происхождения) при адаптации к стрессу по механизму обратной связи подавляет, но не нарушает базальную активность ВКСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов. Следовательно, активность ВКСа-каналов на фоне повышенного образования NO индуцибельной NO-синтазой в условиях адаптации к стрессу создает условия для осуществления полноценного адаптационного ответа и является проявлением нормальных взаимоотношений систем локальной регуляции тонуса сосудов сердца. При этом скрытая активация ВКСа-каналов при адаптации имеет биологическую целесообразность и может лежать в основе ограничения избыточного поступления внутрь сосудистых гладкомышечных клеток ионов кальция и предупреждения коронароспазма при последующем стрессе.

Литература

1. Opening of Ca2+-activated K+ channels triggers early and delayed preconditioning against I/R injury independent of NOS in mice / X. Wang [et al.] // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2004 Nov. - Vol. 287, N 5. - Р. H2070-H2077.

2. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone / J. Ledoux [et al.] // Physiology. - 2006 Feb. - Vol. 21. - Р. 69-78.

3. Physiological roles of K+ channels in vascular smooth muscle cells / E. A. Ko [et al.] // J. Smooth Muscle Res. - 2008 Apr. - Vol. 44, N 2. - Р. 65-81.

4. The BK channel betal subunit gene is associated with human baroreflex and blood pressure regulation / M. Gollasch [et al.] // J. Hypertens. - 2002 May. - Vol. 20, N 5. - P. 927-933.

5. Potassium channel contributions to afferent arteriolar tone in normal and diabetic rat kidney / C. M. Troncoso Brindeiro [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. -2008 Jul. - Vol. 295, N 1. - Р. F171-178.

6. Clapp, L. H. Stoking up BKCa channels in hemorrhagic shock: which channel subunit is really fueling the fire? / L. H. Clapp, N. O. Nelson // Cir. Res. - 2007 Aug. - Vol. 101, N 5. - Р. 436-438.

7. Kyle, D. B. The regulation of BK channel activity by pre- and post-translational modifications / D. B. Kyle, A. P. Braun / Front. Physiol. - 2014 Aug. - Vol. 5. - Р. 316.

8. Chronic stress adaptiation of the nitric oxide synthases and IL-1 в levels in brain structures and hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity induced by homotypic stress / A. Gadek-Michalska [et al.] // J. Physiol. Pharmacol. - 2015 Jun. - Vol. 66, N 3. - Р. 427-440.

9. Вовлечен ли оксид азота в адаптационную защиту органов от стрессорных повреждений? / Е. Б. Мале-нюк [и др.] // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. - 1998. - Т. 126, № 9. - С. 274-277.

10. Восстановление NO2-/NO3- цинковой пылью в присутствии аммиачного комплекса сульфата меди / И. С. Веремей [и др.] // 40 лет фармацевтическому фа-

References

1. Wang X, Yin C, Xi L, Kukreja RC. Opening of Ca2+-activated K+ channels triggers early and delayed preconditioning against I/R injury independent of NOS in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004 Nov;287(5):H2070-7.

2. Ledoux J, Werner ME, Brayden JE, Nelson MT. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology. 2006 Feb;21:69-78.

3. Ko EA, Han J, Jung ID, Park WS. Physiological roles of K+ channels in vascular smooth muscle cells. J Smooth Muscle Res. 2008 Apr;44(2):65-81.

4. Gollasch M, Tank J, Luft FC, Jordan J, Maass P, Krasko C, Sharma AM, Busjahn A, Bähring S. The BK channel betal subunit gene is associated with human baroreflex and blood pressure regulation. J Hypertens. 2002 May;20(5):927-33.

5. Troncoso Brindeiro CM, Fallet RW, Lane PH, Carmines PK. Potassium channel contributions to afferent arteriolar tone in normal and diabetic rat kidney. Am J

культету : сб. науч. тр. - Витебск, 1999. - С. 274-276.

11. Involvement of the endothelin and nitric oxide systems in the pathogenesis of renal ischemic damage in an experimental diabetic model / N. Abu-Saleh [et al.] // Life Sci. - 2012 Oct. - Vol. 91, N 13/14. - Р. 669-675.

12. Kietadisorn, R. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities / R. Kietadisorn, R. P. Juni, A. L. Moens // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. - 2012 Mar. - Vol. 302, N 5. - Р. E481-E495.

13. Normobaric, intermittent hypoxia conditioning is cardio- and vasoprotective in rats / E. B. Manukhina [et al.] // Exp. Biol. Med. - 2013 Dec. - Vol. 238, N 12. - Р. 1413-1420.

14. Меерсон, Ф. З. Постстрессорная активация синтеза нуклеиновых кислот и белков и ее роль в адаптационных реакциях организма / Ф. З. Меерсон, В. И. Павлова, Г. Т. Сухих // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1982. - № 5. - С. 3-17.

15. Депонирование оксида азота в сердечно-сосудистой системе / Е. Б. Манухина [и др.] // Изв. РАН. Сер. биол. - 2002. - № 5. - С. 585-596.

16. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells / I. Yu. Malyshev [et al.] // FEBS Lett. - 1996 Aug. - Vol. 391, N 1/2. - Р. 21-23.

17. The physiologic aggresome mediates cellular inactivation of iNOS / L. Pandit [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2009 Jan. - Vol. 106, N 4. - Р. 1211-1215.

18. Wang, T. Inducible nitric oxide synthase aggresome formation is mediated by nitric oxide / T. Wang, Y. Xia // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2012 Sep. - Vol. 426, N 3. - P. 386-389.

Поступила 04.03.2016г. Принята в печать 15.04.2016г.

Physiol Renal Physiol. 2008 Jul;295(1):F171-8.

6. Clapp LH, Orie NN. Stoking up BKCa channels in hemorrhagic shock: which channel subunit is really fueling the fire? Circ Res. 2007 Aug;101(5):436-8.

7. Kyle BD, Braun AP. The regulation of BK channel activity by pre- and post-translational modifications. Front Physiol. 2014 Aug;5:316.

8. Gadek-Michalska A, Tadeusz J, Rachwalska P, Bugajski J. Chronic stress adaptiation of the nitric oxide synthases and IL-1 P levels in brain structures and hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity induced by homotypic stress. J Physiol Pharmacol. 2015 Jun;66(3):427-40.

9. Malenyuk EB, Aymasheva NP, Manukhina EB, Mikoyan VD, Kubrina LN, Vanin AF, Larionov NP, Malyshev IYu. Vovlechen li oksid azota v adaptatsionnuiu zashchitu organov ot stressornykh povrezhdenii? [Whether nitrogen oxide is involved in adaptic protection of organs from the stressornykh of damages?]. Biul Eksperiment Biologii i Meditsiny. 1998;126(9):274-7.

10. Veremey IS, Solodkov AP, Deyun GV, Golman VI. Vosstanovlenie NO2-/NO3- tsinkovoi pyl'iu v

prisutstvii ammiachnogo kompleksa sul'fata medi [ Restoration of NO2-/NO3-zinc dust in the presence of an ammoniacal complex of copper sulfate]. V: 40 let farmatsevticheskomu fakul'tetu: sb nauch tr. Vitebsk, RB; 1999. P. 274-6.

11. Abu-Saleh N, Ovcharenko E, Awad H, Goltsman I, Khamaisi M, Hoffman A, Heyman SN, Winaver J, Abassi Z. Involvement of the endothelin and nitric oxide systems in the pathogenesis of renal ischemic damage in an experimental diabetic model. Life Sci. 2012 Oct;91(13-14):669-75.

12. Kietadisorn R, Juni RP, Moens AL. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Mar;302(5):E481-95.

13. Manukhina EB, Belkina LM, Terekhina OL, Abramochkin DV, Smirnova EA, Budanova OP, Mallet RT, Downey HF. Normobaric, intermittent hypoxia conditioning is cardio- and vasoprotective in rats. Exp Biol Med. 2013 Dec;238(12):1413-20.

14. Meerson FZ, Pavlova VI, Sukhikh GT. Poststressornaia aktivatsiia sinteza nukleinovykh kislot i belkov i ee rol' v adaptatsionnykh reaktsiiakh organizma [Poststressic activation of synthesis of nucleic acids and proteins and its role in adaptic reactions of an organism]. Patol Fiziol i Eksperim Terapiia. 1982;(5):3-17.

15. Manukhina EB, Smirin BV, Malyshev IYu, Stoclet J-C, Muller B, Solodkov AP, Shebeko VI, Vanin AF. Deponirovanie oksida azota v serdechno-sosudistoi sisteme [Deposition of nitrogen oxide in cardiovascular system]. Izv RAN Ser Biol. 2002;(5):585-96.

16. Malyshev IYu, Malugin AV, Golubeva LYu, Zenina TA, Manukhina EB, Mikoyan VD, Vanin AF. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells. FEBS Lett. 1996 Aug;391(1 -2):21 -3.

17. Pandit L, Kolodziejska KE, Zeng S, Eissa NT. The physiologic aggresome mediates cellular inactivation of iNOS. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan;106(4):1211-5.

18. Wang T, Xia Y. Inducible nitric oxide synthase aggresome formation is mediated by nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun. 2012 Sep;426(3):386-9.

Received 04.03.2016 Accept 15.04.2016

Сведения об авторах:

Лазуко С.С. - к.б.н., доцент, заведующая кафедрой нормальной физиологии УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет».

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210023, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра нормальной физиологии. E-mail: lazuko71@mail.ru - Лазуко Светлана Степановна.