Роль иммунологической памяти в формировании противоопухолевого иммунитета у больных раком яичников на этапе неоадъювантного лечения

Златник Е. Ю.; Неродо Г. А.; Арджа А. Ю.; Селютина О. Н.; Бондаренко Е. С.

РОЛЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ В ФОРМИРОВАНИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ НА ЭТАПЕ НЕОАДЪЮВАНТНОГО ЛЕЧЕНИЯ

Е. Ю. Златник1 Г. А. Неродо2, А. Ю. Арджа2, О. Н. Селютина1, Е. С. Бондаренко1

1 Лаборатория иммунофенотипирования опухолей,

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону

2 Отделение онкогинекологии,

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону

Изучение роли иммунологической памяти, опосредованной Т-лимфоцитами, при злокачественных опухолях и их лечении — актуальная научная задача. Целью исследования была оценка роли Т-клеток иммунологической памяти в формировании противоопухолевого иммунитета у больных раком яичников на этапе неоадъювантного лечения, включающего химиоиммунотерапию с применением рекомбинантного интерферона-гамма (рИФНу). Методы: проточная цитометрия для определения центральных (Тст) и эффекторных (1е1Т1) Т-клеток памяти (Tm) и наивных Т-лимфоцитов (Th0). Результаты: в крови больных по сравнению с донорами обнаружено высокое (Тт) и низкое (Jh0) содержание Т-клеток среди CD4+ и CD8+ субпопуляций. В асцитической жидкости происходило накопление Тт, превышающих количество Th0 в 7,7 раза в субпопуляции CD4+ и в 6,5 раза в субпопуляции CD8+, в которой Тет преобладали над Тст. После химиотерапии с препаратом рИФНу в крови больных выявлено снижение уровня Th0, в крови и в асцитической жидкости — преобладание Тст среди CD8+ тт, а у больных, получавших химиотерапию без иммунотерапии, преобладали Тет. Данные различия были расценены как благоприятные, поскольку сопровождались положительной клинической динамикой: меньшей частотой рецидивирования (46,7 против 80 % в контроле) и более длительным безрецидивным периодом (17,5 ± 1,6 против 11,3 ± 1,5 мес. в контроле). Таким образом, химиоиммунотерапия вызывает перераспределение субпопуляций T-клеток в крови и в асцитической жидкости при раке яичников в сторону преобладания Тст над Тет, что может быть одним из механизмов действия препарата «Ингарон» (рИФНу).

Ключевые слова: рак яичников, асцитическая жидкость, кровь, проточная цитометрия, лимфоциты, T-клетки памяти, Тст, Тет, наивные T-лимфоциты, интерферон-у

^<1 Для корреспонденции: Златник Елена Юрьевна

ул. 14-я линия, д. 63, г Ростов-на-Дону, 344037; [email protected]

Статья получена: 22.09.2017 Статья принята к печати: 30.09.2017

THE ROLE OF IMMUNOLOGICAL MEMORY IN ESTABLISHING ANTITUMOR IMMUNITY IN PATIENTS WITH OVARIAN CANCER UNDERGOING NEOADJUVANT THERAPY

Zlatnik EYu1 Nerodo GA2, Ardzha AYu2, Seliutina ON1, Bondarenko ES1

1 Laboratory for Immunophenotyping of Tuтors,

Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia

2 Department of Gynecologic Oncology,

Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia

Understanding the role of immunological memory mediated by Т-lymphocytes in patients with malignant tumors is a pressing issue. This study aimed to assess the contribution of memory Т-cells to antitumor immunity in patients with ovarian cancer undergoing neoadjuvant chemoimmunotherapy with recombinant interferon-gamma (rIFNy). Quantification of central (Тст) and effector (Тет) memory T-cells (Tm), as well as naive T-lymphocytes (Th0), was done using flow cytometry. Compared to healthy females, untreated cancer patients were found to have more Tm and less Th0 cells in their blood CD4+ and CD8+ T-cell subpopulations. In cancer patients, Tm cells accumulated in the ascitic fluid, exceeding 7.7 times the number of CD4+ Th0 cells and 6.5 times the number of CD8+ Th0 cells, with Tem prevailing over Tcm. After chemotherapy with rIFNy, blood Th0 decreased in cancer patients, while Tcm dominated the CD8+ Tm subpopulation both in the blood and ascitic fluid. Tem cells were a prevalent cell type in patients who received chemotherapy without interferon-gamma. Decreased Th0 and Tcm prevalence were a positive sign accompanied by a good response to treatment, including lower relapse rates (46.7 % vs. 80 % in controls) and a longer relapse-free period (17.5 ± 1.6 vs. 11.3 ± 1.5 months in controls). Therefore, we conclude that chemoimmunotherapy alters proportions of T-cell subpopulations in the blood and ascitic fluid of patients with ovarian cancer, with Tcm cells prevailing over Tem, which may be one of the mechanisms of rIFNy (Ingaron) action.

Keywords: ovarian cancer, ascitic fluid, blood, flow cytometry, lympocytes, memory T-cells, Тст, Тет, Th0, interferon-gamma

^ Correspondence should be addressed: Elena Zlatnik

14-ya liniya, d. 63, Rostov-on-Don, Russia, 344037; [email protected]

Recieved: 22.09.2017 Accepted: 30.09.2017

Бурное развитие клеточных технологий, перспективных для противоопухолевого лечения, предлагает применение адоптивной иммунотерапии активированными ex vivo лимфоцитами периферической крови и опухолевого микроокружения (LAK- и TIL-клеток), CIK-лимфоцитов, ДК-вак-цинации и пр. [1]. В работах последних лет высокую активность при ряде опухолей показала САЯ-терапия [2].

Тем не менее эффект применения адоптивной иммунотерапии у онкологических больных не оправдывает ожиданий, что приводит к разочарованию клиницистов в таких подходах, альтернативных химиотерапии или использующихся в сочетании с ней [1]. Подобные противораковые стратегии нередко терпят поражение из-за имму-носупрессивных механизмов организма опухоленосителя, проявляющихся в дисбалансе и дисфункциях различных субпопуляций лимфоцитов, среди которых важную роль играют лимфоциты, обеспечивающие иммунологическую память. Феномен иммунологической памяти известен давно и присущ системе адаптивного иммунитета, включающего Т- и В-клеточные звенья. Роль лимфоцитов памяти представляется важной при любой хронической патологии, а для опухолевых заболеваний особенно актуальна иммунологическая память, опосредуемая Т-лимфоцитами. Особое значение при этом придается Сй8+-клеткам, так как частота встречаемости специфических цитотоксичес-ких Т-лимфоцитов против опухолевых антигенов намного выше среди Сй8+-клеток памяти, чем среди наивных [3]. У онкологических больных, как продемонстрировано на примере тетрамера меланомы мелан-А, отмечена различная способность наивных Т-лимфоцитов (Th0) и Т-клеток памяти (Tm) отвечать на стимуляцию опухолевым антигеном ex vivo, отсутствующая у клеток CD45RA+CCR7+ и наличествующая у CD45RO+CCR7- [4, 5]. Некоторыми авторами уровень СD8+-клеток памяти в опухоли при колоректаль-ном раке и других солидных опухолях рассматривается как ключевой фактор общей выживаемости больных [6].

Как стало известно в конце ХХ в. после введения в широкий научно-лабораторный обиход методов иммуно-фенотипирования лимфоцитов, субпопуляция Тт-лим-фоцитов гетерогенна и подразделяется в зависимости от экспрессии адгезионных, хемокиновых, костимулирую-щих рецепторов, от способности к продукции цитокинов и к ответу на них, возможности проникать через эндотелий и от других характеристик. На основании этих особенностей были определены основные субпопуляции Тт: центральные (Тст) и эффекторные (Тет). Фенотип этих клеток характеризуется экспрессией CD45RO при отсутствии экспрессии CD45RA, а также наличием на Тст рецепторов CCR7, CD62L, CD27 и СD28, тогда как на Тет-клетках экспрессия CCR7, CD62L и СD28 отсутствует, а CD27 сохраняется [7]. ТЬО обладают высокой экспрессией CCR7, CD62L, CD27, СD28 и CD45RA при отсутствии CD45RO. Таким образом, иммунофенотипирование минимальной панелью моноклональных антител СD62L, CD45RA и CD45RO позволяет отнести Т-лимфоцит к субпопуляции Th0, Тст или Тет.

Хроническая антигенная стимуляция вызывает изменения ТЬО, в ходе которых происходит не только указанное выше изменение их иммунофенотипа, но и снижение про-лиферативной активности и выживаемости, а также ответа на гомеостатические цитокины (IL-7, IL-15) и способности к продукции IL-2; при этом нарастают эффекторные функции, в частности цитотоксичность. Рецепторы CD62L и CCR7, экспрессируемые ТЬЮ и Тст, способствуют их экстравазации через высокий эндотелий венул и миграции

в Т-зависимые зоны периферических лимфоузлов, тогда как Тет населяют периферические ткани (печень, легкие), а также область воспалительного или опухолевого очага [8, 9]. Благодаря таким свойствам Тет выполняют «сторожевую» функцию, а Тс т обеспечивают защиту на системном уровне и быстрый ответ на последующие введения антигена [10, 11].

В отношении преимущественной противоопухолевой активности эффекторных или центральных Тт высказываются различные мнения, хотя чаще приоритет отдают Тст [7, 9]. Есть данные о том, что вклад обоих видов клеток в противоопухолевую защиту хотя и разный по механизмам, но комплементарный, и для ее оптимального осуществления необходимы обе субпопуляции Тт [12]. В литературе приводятся сведения, что при адоптивной иммунотерапии наличие среди Тт СЭ4+-лимфоцитов предотвращает истощение СЭ8+-лимфоцитов [13], а, следовательно, необходимо использовать их гетерогенную смесь [12, 13].

Некоторые авторы, кроме основных субпопуляций Тт, выделяют еще одну резидентную (Тгт), которая формируется из циркулирующих СЭ8+ Тт, экспрессируя в патологическом очаге дополнительные рецепторы СЭ103 [14]. Есть сообщения о различных фенотипических характеристиках СЭ8+ Тт в разных органах. Например, перитонеальная полость в нормальном состоянии содержит только эф-фекторные СЭ4+- и СЭ8+-лимфоциты, а при воспалении, кроме того, СЭ4+ и СЭ8+ Тт [14]. Сигналом к задержке Тт в очаге с последующей их транфсормацией в Тгт-клетки может быть поступление антигена [15] или «цитокиновый взрыв», наблюдаемый при воспалении. Тгт-клетки описаны при воспалительных процессах [16, 17], но не при опухолевом росте.

Иммунологическим исследованиям при раке яичников посвящен ряд современных работ, планирующих разработку новых методов иммунотерапии [1, 18]. В ходе таких исследований авторами делаются неожиданные находки, касающиеся клеток иммунологической памяти, в частности, описана минорная субпопуляция Тт, экспресси-рующих В-клеточный рецептор СЭ20+ вместе с !РЫу+ и СЭ8+ [19], которая рассматривается как подавляющая опухолевый рост.

В норме в крови человека Тст преобладают среди лимфоцитов субпопуляции СЭ4+, а Тет в субпопуляции СЭ8+ [11], при этом установлено различное содержание этих клеток в лимфоидных и нелимфоидных органах, а также некоторые различия их фенотипических и функциональных характеристик в зависимости от микроокружения [14].

Иммунная защита организма от опухоли осуществляется как на системном, так и на локальном уровне с участием различных клеточных факторов, а также их растворимых продуктов [18]. Однако роль присутствующих в микроокружении опухоли иммунокомпетентных клеток и цитокинов расценивается двояко, т. е. они рассматриваются как факторы не только способствующие ее регрессии, но и могущие стимулировать ее рост, тем более при распространенных стадиях [20-23].

Лечение рака яичников (РЯ) остается одной из сложных проблем в онкологии [24]. Согласно имеющимся в литературе данным, РЯ среди всех злокачественных опухолей находится на пятом месте по числу случаев, и, несмотря на постоянное совершенствование методов диагностики и лечения, занимает лидирующее место по показателю смертности. Хотя РЯ чувствителен к химиотерапии, он редко поддается полному излечению и склонен к частому

и раннему рецидивированию. Стандартом лечения РЯ ПНУ стадий в настоящее время является хирургическое лечение в сочетании с химиотерапией, однако технические трудности, обусловленные распространенностью опухолевого процесса, не позволяют выполнить циторедуктивную операцию в оптимальном объеме. В том случае, когда провести операцию не представляется возможным, первым этапом лечения проводят неоадъювантную химиотерапию, а после операции выполняется адъювантная химиотерапия; наиболее часто для проведения химиотерапии используется комбинация «Паклитаксела» и «Карбоплатина» с интервалом в три недели [25].

Рекомбинантный интерферон -гамма (рИФНу) «Инга-рон», разработанный российскими учеными в виде формы для инъекций и направленный на стимуляцию клеточного иммунитета, обладает противовирусным, антипролифе-ративным и иммуномодулирующим действием [26]. Его противоопухолевое действие связано со способностью активировать естественные киллеры (ЫК-клетки), цито-токсические Т-лимфоциты и макрофаги. При применении в комбинации с цитостатиками он помогает преодолевать резистентность опухолевых клеток к химиотерапии, существенно повышая эффективность лечения [27]. Данный препарат исследовался и применялся при раке шейки матки, раке молочной железы, легкого, меланоме, колорек-тальном раке, продемонстрировав эффективность даже в далеко зашедших стадиях [28].

Целью работы было оценить роль Т-клеток иммунологической памяти в формировании противоопухолевого иммунитета у больных раком яичников на этапе неоадъ-ювантного лечения, включающего химиоиммунотерапию с применением рекомбинантного интерферона-гамма.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на базе отделения онкогинеко-логии отдела органов репродуктивной системы и лаборатории иммунофенотипирования опухолей Ростовского научно-исследовательского онкологического института в период с 2013 по 2017 г. Обследованы 30 больных РЯ в возрасте от 34 до 77 лет; средний возраст — 54,9 ± 1,3 года. Все больные были первично выявленными; средняя продолжительность анамнеза составляла 7 мес. Все больные дали письменное добровольное информированное согласие на проведение лечения, все исследования выполнены в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2013). Исследование утверждено протоколом этического комитета РНИОИ № 24 от 23.11.2012.

Критериями включения больных в исследование были: возраст старше 18 лет; верифицированный цитологически или морфологически рак яичников 111-1У стадии, асцитная форма; отсутствие предыдущего специального лечения.

Критерии исключения: выраженная сопутствующая патология (перенесенный инфаркт миокарда, декомпен-сированный порок сердца, сахарный диабет); прохождение химиотерапии, лучевой терапии, хирургического вмешательства, иммунотерапии до начала исследуемого лечения; метастатическое поражение центральной нервной системы; беременность и лактация; любые причины, препятствующие регулярному лечению и наблюдению за пациентом.

Были сформированы две группы по 15 больных: основная, получавшая химиотерапию с иммунотерапией рИФНу (ХИТ), и контрольная, получавшая химиотерапию (ХТ).

Сравнительный анализ двух групп больных, подвергшихся неоадъювантной химиотерапии с применением рИФНу и без него, выявил, что в основной группе и в группе контроля с III стадией было по 11 (73,3 %) больных, с IV стадией — по 4 (26,7 %) больных; различия статистически незначимы (р > 0,05). В обеих группах наибольшее количество больных было в возрастной группе 50-59 лет: в основной группе — 5 (33,3 %) пациенток, в контрольной — 6 (40,0 %); статистически достоверной разницы не отмечено. Общее состояние больных оценивали по шкале ECOG-WHO, по которой у наибольшего числа больных было 2 балла: у 8 (53,3 %) и 9 (60,0 %) пациенток в основной и контрольной группах соответственно; различия статистически незначимы. Таким образом, на основании представленных данных следует, что больные сравниваемых групп в исходном состоянии были идентичны по возрасту, стадиям заболевания и общему состоянию, что дает право проводить сравнительный анализ.

Группу сравнения составили 20 практически здоровых женщин аналогичного возраста, у которых брали пробы крови.

Больных обследовали в динамике лечения: до и через 3 нед. после проведения ХТ (15 больных) и ХИТ (15 больных); такой промежуток между обследованиями был выбран в соответствии с интервалом между курсами лечения. Больные получили по 2-3 курса полихимиотерапии по схеме: «Карбоплатин» ^UC-6) внутривенно капельно, «Паклитаксел» 175 мг/м2 внутривенно капельно, интервал между курсами 21 день. ХИТ выполняли следующим образом: рИФНу («Ингарон» производства «Фармаклон», Россия) вводили внутримышечно в 1-й день 500 тыс. МЕ, во 2, 3, 5-й дни по 1 млн МЕ, в 4-й день проводили курс полихимиотерапии по той же схеме («Паклитаксел» + «Карбопла-тин»). Обе группы больных были идентичны по возрасту, стадиям заболевания и общему состоянию.

В дальнейшем все больные подвергались хирургическому лечению, которое заключалось в экстирпации матки с придатками, экстирпации или резекции большого сальника или удалении придатков матки, в зависимости от эффективности проведенного лечения. В послеоперационном периоде больным основной группы выполнялась адъювантная ХИТ: на 9-й день после операции начинали вводить «Ингарон» внутримышечно по той же схеме. Проводили 2 курса лечения, включающего «Ингарон», затем 4 курса химиотерапии; всего больные получали 6 курсов адъювантного лечения. Больным контрольной группы выполняли 6 курсов ХТ.

Эффект неоадъювантного этапа лечения оценивали по наличию полной, частичной регрессии, общего эффекта, складывающегося из полной и частичной регрессии; стабилизации или прогрессирования опухоли согласно критериям ВОЗ для оценки эффективности лечения при солидных опухолях.

После окончания адъювантного лечения больных наблюдали в течение 3 лет, отмечали время наступления рецидива.

Кровь и асцитическую жидкость (АЖ) брали до начала и на этапах лечения. Общее количество исследованных образцов крови составило 98, АЖ — 47.

Проточная цитофлуориметрия лимфоцитов крови и АЖ. Измерения проводили на проточном цитофлуориме-тре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США), оснащенном двумя лазерами с длинами волн возбуждения флуорофоров 488 нм и 633 нм с возможностью использовать до 6 моноклональных антител в одной пробирке

Рис. 1. Анализ Тт периферической крови методом проточной цитофлуориметрии: (А) — выделение региона лимфоцитов среди клеток крови; (Б) — определение популяции Т-лимфоцитов; (В) — распределение СЭ4 и СЭ8; (Г) — распределение СЭ45ЯА и СЭ45ЯО после логического ограничения по СЭ4; (Д) — распределение С045ЯА и СЭ45ЯО после логического ограничения по СЭ8; (Е) — распределение С045ЯА и СЭ621_ после логического ограничения по СЭ4; (Ж) — распределение С045ЯА и СЭ62_ после логического ограничения по СЭ8

одновременно. Моноклональные антитела были конъ-югированы со следующими флуорохромами: FITC, PE, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, APC-Cy7. Инструментальные настройки прибора проводили с помощью стандартизированных флуоресцентных шариков BD FACS 7-color setup beads (BD Biosciences, США).

Процедура пробоподготовки и иммунофенотипическое окрашивание. Для оценки экспрессии рецепторов использовали иммунофенотипическое окрашивание. Окраску проводили с помощью флуоресцентно-меченых антител согласно протоколу производителя. На каждого обследо-

ванного приходилось 2 пробирки со следующими наборами моноклональных антител BD Multitest (Becton Dickinson, США):

1) CD45RA FITC/CD45RO PE/CD3 PerCP/CD4 APC (кат. № 340571) или CD45RA FITC/CD45RO PE/CD3 PerCP/ CD8 APC (кат. № 340574);

2) CD45RA FITC/CD62L PE/CD3 PerCP/CD4 APC (кат. № 340977).

Данная панель антител позволяет определить содержание Th0, Tcm и Tem (CD62L+CD45RA+CD45RO-, CD62L+CD45RA-CD45RO+ и CD62L-CD45RA-CD45RO+

CD45RA FITC-A

Рис. 2. Анализ Тт АЖ методом проточной цитофлуориметрии: (А) — выделение региона лимфоцитов; (Б) — определение популяции Т-лимфоцитов; (В) — распределение СЭ4 и СЭ8; (Г) — распределение С045ЯА и СЭ45ЯО после логического ограничения по СЭ4; (Д) — распределение СЭ45ЯА и СЭ45ЯО после логического ограничения по СЭ8; (Е) — распределение С045ЯА и СЭ621_ после логического ограничения по СЭ4; (Ж) — распределение С045ЯА и СЭ621_ после логического ограничения по СЭ8

соответственно) среди CD4+ и CD8+ субпопуляций Тт. В каждом образце для анализа данных накапливали не менее 50 000 клеток.

Тактика гейтирования и анализ данных. С помощью графика Dot Plot по параметрам прямого (относительный размер клеток) и бокового (структура клеток) светорассеяния выделяли область лимфоцитов. В пределах этого региона по маркерам CD3, СD4 и CD8 рассчитывали процент T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов в общей популяции лимфоцитов. Далее анализировали процент T-лимфоцитов с фенотипами СD4+CD45RO+CD45RA-, СD8+ CD45RO+CD45RA-,СD4+CD45RА+CD62L+, СD8+CD45RА+ CD62L+ в популяциях T-хелперов и цитотоксических T-лим-

фоцитов. Для каждой пробы вычисляли коэффициенты Tm/Th0 среди CD4+ и CD8+ субпопуляций. Уровни Tcm и Tem определяли в процентах от количества Tm, принадлежащих к субпопуляциям CD4+ и CD8+; рассчитывали коэффициент Tem/Tcm. Примеры результатов проточной цитофлуориметрии крови и АЖ приведены на рис. 1 и 2.

Методы математической и статистической обработки. Математическую обработку цитофлуориметрических данных проводили в программе BD FACSDiva Software (Becton Dickinson, США). Для анализа результатов и статистической обработки использовали программный пакет Statistica 8.0 for Windows и MS Excel. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Использовали

также критерий Уилкоксона; оценку достоверности различий между частотой развития полного и общего эффекта, частотой рецидивирования проводили по критерию соответствия х2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования представлены в табл. 1-4 и на рис. 3 и 4. В пробах биологических жидкостей обнаружены различия содержания Тт- и ТИЮ-лимфоцитов. Как видно из табл. 1, в крови больных РЯ выявлен статистически достоверно более высокий уровень Тт среди С03+СЭ4+-кле-ток и более низкий уровень ТИ0 среди С03+С08+-клеток по сравнению с показателями здоровых женщин (р < 0,05). При сопоставлении уровней Тт в крови и в АЖ больных РЯ выявлено выраженное преобладание их в АЖ (р < 0,05); в отличие от них уровни ТИ0 в АЖ были статистически значимо ниже по сравнению с кровью больных (р < 0,05) (табл. 1).

При этом не наблюдалось статистически достоверных различий между уровнями СЭ4+- и СЭ8+-клеток в крови и в АЖ, хотя содержание лимфоцитов и моноцитов в АЖ значительно превышало показатели крови. Так, несмотря на значительно более высокий уровень лимфоцитов в АЖ (52,4 ± 5,5 против 17,4 ± 2,7 % в крови больных), содержание их основных субпопуляций в этих биологических жидкостях не имело статистически достоверных различий: уровень СЭ4+-клеток в крови составлял 49,2 ± 3,1 %, в АЖ — 48,7 ± 3,2 %, а уровень СЭ8+ — 18,4 ± 2,7 и 22,6 ± 3,3 % соответственно. Индекс С04+/С08+ в АЖ также не имел статистически достоверных отличий от показателя крови больных. Однако соотношение Тт/ТИ0, относящихся к обеим Т-клеточным субпопуляциям, было существенно выше в АЖ больных по сравнению с показателями их крови (7,7 ± 1,0 против 2,9 ± 0,5 для СЭ4+-клеток и 6,5 ± 1,3 против 2,1 ± 0,3 для СЭ8+-клеток соответственно; в обоих случаях р < 0,05), что говорит о выраженном преобладании Тт над ТИ0 именно в опухолевом очаге по сравнению с периферической кровью.

Установлен также ряд различий по содержанию субпопуляций Тт в исследуемых биологических жидкостях (табл. 2).

Как видно из табл. 2, уровни Тет среди субпопуляций СЭ4+- и СЭ8+-клеток в АЖ статистически достоверно превышали содержание этих клеток в крови больных, а также в крови здоровых женщин (р < 0,05). По содержанию Тст найдено различие только в субпопуляции СЭ8+ между их уровнем в АЖ больных и в крови здоровых женщин. Интересно, что не обнаружено статистически значимых различий исследуемых субпопуляций в крови больных и здоровых лиц.

Уровни Тет в субпопуляциях СЭ4+ и СЭ8+ в большинстве случаев оказались сходными, тогда как процент Тст в субпопуляции СЭ4+-клеток был в 2-2,3 раза выше, чем в СЭ8+. Соотношение Тет/Тст в пробах крови и АЖ характеризовалось преобладанием Тет в субпопуляции СЭ8+-клеток, превышая 1,0, и преобладанием Тст в субпопуляции СЭ4+, где оно было ниже 1,0 (рис. 3).

Таким образом, сопоставление показателей системного и локального клеточного иммунитета при асцитных формах РЯ продемонстрировало преобладание Тт в крови больных по сравнению со здоровыми женщинами, а также в АЖ по сравнению с периферической кровью больных. При этом среди Тт, относящихся к СЭ4+, отмечено преимущественное содержание Тс т, а среди СЭ8+ Тт наблюдается преобладание Тет с накоплением последних в АЖ больных.

Анализ клинической динамики у больных основной и контрольной групп на этапе неоадъювантного лечения показал, что в основной группе, получавшей ХТ с рИФНу, полная регрессия опухоли отмечена у 4 (26,7 %) больных, в контрольной группе — у 1 (6,7 %) больной. При оценке общего эффекта от проводимого лечения получены статистически достоверные различия показателей основной и контрольной групп (87,0 и 30,0 % соответственно). Про-грессирование заболевания отмечено только в группе без применения рИФНу у 1 (6,7 %) больной.

После проведения 2-3 курсов неоадъювантной полихимиотерапии удалось выполнить оперативное лечение полного объема (экстирпация матки с придатками, резекция или экстирпация большого сальника) у 12 (80,0 %) больных основной группы и у 6 (40,0 %) — из контрольной; различия достоверны (р < 0,05). Неполный объем оперативного пособия, включающий удаление опухолей яичников с резекцией большого сальника, в основной группе был

Таблица 1. Количество Тт и ТИ0 субпопуляций СЭ4+ и СЭ8+ в крови и АЖ больных РЯ

Пробы % ™, %

CD4+ CD8+ CD4+ CD8+

Кровь здоровых женщин (п = 20) 55,0 ± 3,7 35,0 ± 4,3 23,4 ± 3,2 27,7 ± 3,7

Кровь больных РЯ (п = 30) 64,5 ± 2,3* 40,8 ± 5,1 22,4 ± 4,1 18,5 ± 2,7*

АЖ больных РЯ (п = 30) 79,2 ± 4,0*** 57,5 ± 3,1*** 10,2 ± 1,6*** 9,5 ± 2,5***

Примечание. *—достоверные отличия от показателей крови здоровых доноров (р < 0,05); **—достоверные отличия от показателей крови больных (р < 0,05). Здесь и далее в табл. 2-4 для расчета достоверности различий применяли критерий Уилкоксона.

Таблица 2. Количество центральных и эффекторных Тт с фенотипом СЭ4+ и СЭ8+ в крови и АЖ больных РЯ

Пробы ^ CD4+ ^ CD8+

Tcm, % Tem, % Tcm, % Tem, %

Кровь здоровых женщин (п = 20) 41,7 ± 2,5 17,8 ± 2,3* 17,7 ± 2,5* 24,1 ± 3,6*

Кровь больных РЯ (п = 30) 42,0 ± 3,1 24,8 ± 1,8* 22,0 ± 1,5 28,2 ± 3,2*

АЖ больных РЯ (п = 30) 47,1 ± 3,3 39,8 ± 3,9 27,0 ± 2,0 42,1 ± 4,1

Примечание. * — достоверные отличия от показателей АЖ больных (р < 0,05).

Кровь здоровых доноров

Кровь больных РЯ

АЖ больных РЯ

СЭ4+ Тт

СЭ8+ Тт

2,01,5 —

1,00,50

Рис. 3. Соотношение Тет/Тст в субпопуляциях СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеток памяти

выполнен у 3 (20,0 %) больных, а в контрольной группе — у 8 (53,3%) пациенток, еще у 1 (6,7 %) больной из той же группы была выполнена пробная лапаротомия.

После проведения адъювантного лечения больных наблюдали в течение 3 лет. Процент возникновения рецидива у больных основной группы составил 46,7 % против 80,0 % в контрольной группе (7 и 12 больных соответственно), а средний срок его возникновения был 17,5 ± 1,6 мес. и 11,3 ± 1,5 мес. соответственно; различия достоверны (р < 0,05).

Учитывая, что больным выполняли разные по объему операции, для иммунологического исследования мы отбирали тех, кому проводили операцию одинакового типа, а именно полного объема.

Изучение динамики уровней Тт и ТИ0 в крови больных при лечении с применением и без применения интерфе-рона-гамма показало ряд различий (табл. 3). Обращает на себя внимание, что у больных основной группы, получавших ХТ с рИФНу, произошло снижение уровней наивных ТИ0, статистически значимое к концу лечения (р < 0,05). В контрольной группе уровень этих клеток не отличался от исходного на протяжении всего срока наблюдения.

Соотношение Тт/ТИ0 в процессе лечения статистически достоверно возрастало у больных основной, но не контрольной группы (рис. 4). Так, соотношение Тт/ТИ0 среди СЭ8+-клеток у больных основной группы возросло с 2,5 ± 0,5 до 3,4 ± 0,7, а в контрольной группе снизилось с 1,7 ± 0,3 до 1,4 ± 0,3, оказавшись достоверно ниже, чем в основной (р < 0,05). В субпопуляции СЭ4+-лимфоцитов отмечено 2,5-кратное возрастание этого показателя в основной группе и отсутствие изменений в контрольной.

Несмотря на то, что содержание Тт не имело статистически достоверных различий в процессе лечения (табл. 3), оценка динамики процентного содержания Тст и Тет у больных основной и контрольной групп показала наличие таких различий в субпопуляции Тт СЭ8+ (табл. 4).

В крови больных контрольной группы происходило постепенное снижение уровня Тст, к концу лечения достигшее статистически значимого (р < 0,05); при этом уровни Тет не менялись.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Применение ХИТ с рИФНу первоначально приводило к подобным изменениям, однако, в финале лечения количество Тст оказалось выше, а уровень Тет ниже у больных основной группы по сравнению с контрольной (табл. 4). Таким образом, в крови больных контрольной группы к концу лечения преобладали Тет, а в основной группе — Тст (соотношение Тет/Тст составляло 2,27 ± 0,4 и 0,62 ± 0,18 соответственно; р < 0,05).

Динамику уровней исследуемых субпопуляций в АЖ можно было определить только в тех случаях и в те сроки, когда происходило накопление АЖ, т. е. в предоперационном периоде. Было установлено, что в субпопуляции СЭ4+-лимфоцитов соотношение уровней Тт и ТИ0 в динамике ХИТ с применением рИФНу статистически достоверно повышалось с 7,7 ± 1,0 до 13,0 ± 1,5 (р < 0,05). В АЖ больных той же группы отмечены изменения и в субпопуляции Тт СЭ8+, где произошло снижение уровня Тет (13,6 ± 4,6 против 42,1 ± 4,1 % в контрольной группе; р < 0,05), а количество в ней Тст имело тенденцию к повышению. Общее количество лимфоцитов после проведения ХИТ в АЖ составляло 42,2 ± 7,8 против 31,1 ± 7,1 % после ХТ (различия статистически недостоверны), однако после ХТ без рИФНу отмечено их достоверное снижение по сравнению с исходным показателем (52,4 ± 5,5 %, р < 0,05). Кроме того, отмечены и другие статистически значимые различия: уровни СЭ3+- и СЭ4+-клеток были выше после ХИТ по сравнению с наблюдаемыми после ХТ, составив 82,1 ± 6,3 против 65,4 ± 6,5 % и 57,6 ± 5,7 против 42,6 ± 2,5 % соответственно; в обоих случаях р < 0,05).

Таким образом, в АЖ больных РЯ обнаружено более высокое содержание Тт как среди субпопуляций СЭ4+, так и среди СЭ8+ при более низких количествах ТИ0, чем

Таблица 3. Динамика содержания Тт и ТИ0 в крови больных РЯ основной и контрольной групп

Группа больных Срок исследования Тт, % ТИ0, %

СЭ4+ СЭ8+ СЭ4+ СЭ8+

Основная (п = 12) до лечения 65,8 ± 4,2 40,9 ± 5,2 20,5 ± 3,5* 17,2 ± 1,6*

после 2-3 курсов ХИТ 64,6 ± 6,1 37,7 ± 4,5 15,7 ± 3,4 16,5 ± 2,3

после окончания ХИТ 72,8 ± 5,9 35,7 ± 5,1 9,7 ± 2,7 10,4 ± 2,6

Контрольная (п = 6) до лечения 66,3 ± 4,4 38,1 ± 4,7 23,6 ± 4,6 23,6 ± 5,6

после 2-3 курсов ХТ 59,1 ± 7,1 31,6 ± 4,5 16,8 ± 3,9 18,8 ± 3,2

после окончания ХТ 63,2 ± 7,3 37,5 ± 7,2 24,4 ± 6,2* 27,3 ± 7,5*

Ь;

т

Примечание. * — достоверные отличия от показателей основной группы после окончания ХИТ (р < 0,05).

До лечения После лечения

CD4+ основная группа

CD4+

контрольная группа

CD8+ основная группа

CD8+

контрольная группа

Рис. 4. Изменение соотношения Тт/ТИ0 в субпопуляциях СЭ4+- и СЭ8+-лимфоцитов в крови больных РЯ до и после лечения

в крови больных; при этом выявлено преобладание Тет среди Тт СЭ8+. Показана разнонаправленная динамика Тет и Тст клеток в крови и АЖ больных, подвергавшихся ХТ с включением и без включения препарата «Ингарон» (рИФНу).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учитывая важность биологической роли Тт при онкологических заболеваниях и возможность изменения их количества и соотношения субпопуляций при проведении иммунотерапии, нами было выполнено исследование уровней Тт, включая Тст и Тет, а также ТИО в крови и асцитической жидкости больных РЯ до лечения и при проведении химиоиммунотерапии. Кроме ранее описанного нами присутствия в АЖ больных высокого количества лимфоцитов с преобладанием Тт [29], в данной работе показано превалирование среди последних Тет, преимущественно принадлежащих к субпопуляции СЭ8+. Хотя пока не представляется возможным установить их специфичность и обосновать предположение об их возможной противоопухолевой активности, данные литературы свидетельствуют о том, что поскольку экспансия лимфоцитов, находящихся в составе лимфоидного инфильтрата в опухоли (опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов), носит клональный характер, в окружении опухоли преобладают антиген-специфические лимфоциты [6]. При этом у больных РЯ, судя по наличию распространенного опухолевого процесса, не происходит развития эффективных иммунных реакций, причинами чего могут быть особенности микроокружения опухоли. Опухолевые клетки, находящиеся в АЖ, видимо, активируют перитонеальные макрофаги

и моноциты, что приводит к гиперпродукции цитокинов, обладающих проонкогенными свойствами [21]. Моноциты АЖ служат потенциальным источником макрофагов 2-го типа, поддерживающих опухолевый рост путем аутокрин-ной продукции УБОР, БЭР, ТОРГС, 1_-6, 1_-8, 1_-10, чему способствует гипоксия, развивающаяся в опухолевой ткани [23, 30]. Эти же цитокины, а также хемокины, способные вырабатываться и опухолевыми клетками, стимулируют миграцию лимфоцитов в перитонеальную полость. По данным литературы, среди них находятся естественные Т-регуляторные клетки (Т-гедэ), обладающие иммуносу-прессивной и проонкогенной активностью, количество которых у больных РЯ выше, чем у здоровых женщин [31], а в АЖ значительно выше, чем в крови [32]. Возможно, они блокируют активность Т-лимфоцитов, в частности Тт, как и других лимфоцитов (ЫК-, СЭ8+), которые, несмотря на их высокое содержание, по-видимому, являются функционально неполноценными, как это было показано на примере СЭ8+ Тт, хронически стимулируемых при вирусных инфекциях [7, 9, 33, 34]. Тт, в отличие от Т-гедэ, подвергаются апоптозу при взаимодействии с Раэ_, экс-прессируемым эндотелиоцитами опухолевых сосудов, что рассматривается как один из защитных механизмов опухоли [35]. Возможно, применение воздействий, направленных на снятие локальной иммуносупрессии, позволило бы добиться результативного включения клеточных факторов в противоопухолевый иммунный ответ с возможностью повышения эффективности лечения РЯ.

Как описано нами ранее, применение «Ингарона» в курсе химиотерапии, наряду с другими позитивными изменениями иммунного статуса, вызывает снижение уровня ТИО у больных РЯ [36]. В данной работе, где сделан акцент на изучение Тт у этих больных, показано, что

Таблица 4. Динамика содержания Тст и Тет в крови больных РЯ основной и контрольной групп

Группа больных Срок исследования Тт CD4+ Тт CD8+

Тст, % Тет, % Тст, % Тет, %

Основная (П = 12) до лечения 43,0 ± 2,5 26,3 ± 3,8 24,4 ± 3,6 25,8 ± 3,3

после 2-3 курсов ХИТ 39,8 ± 4,1 26,8 ± 3,3 13,3 ± 3,4* 22,6 ± 3,7

после окончания ХИТ 42,8 ± 3,8 28,4 ± 5,1 22,2 ± 2,9** 13,9 ± 3,6***

Контрольная (П = 6) до лечения 42,3 ± 3,6 25,5 ± 2,8 22,5 ± 2,3 30,6 ± 4,9

после 2-3 курсов ХТ 45,3 ± 4,7 23,7 ± 3,7 17,8 ± 4,0 25,3 ± 2,9

после окончания ХТ 43,1 ± 6,1 23,8 ± 4,7 12,6 ± 2,2* 28,7 ± 3,3

Примечание. * — достоверные отличия от показателей до лечения (р < 0,05); ** — достоверные отличия от соответствующих показателей контрольной группы (р < 0,05).

применение рИФНу способствует увеличению преобладания Тт над уровнем ТИ0 в крови и в АЖ больных РЯ после химиоиммунотерапии, а также вызывает перераспределение Тт СЭ8+ в пользу Тст, в отличие от больных, получавших химиотерапию без рИФНу, с чем отчасти может быть связано повышение клинического эффекта, наблюдаемое при включении данного иммунопрепара-та в курс химиотерапии. Хотя в литературе описано, что при повторном введении антигена происходит нарастание пролиферативной активности и цитотоксичности как среди Тс т, так и среди Тет, входящих в субпопуляцию СЭ8+ Т-клеток, считается, что эти свойства, а также более активное взаимодействие с антигенпрезентирующими клетками, более высокая антиген-индуцированная пролиферация, генерация цитотоксических Т-эффекторов и хоуминг во вторичные лимфоидные органы превалирует у Тст [7, 37]. Это говорит о преимуществе опухоль-специфичных СЭ8+ Тст по сравнению с Тет как противоопухолевых факторов, что позволяет рассматривать полученные нами данные как один из механизмов реализации терапевтического действия «Ингарона» при асцитных формах РЯ.

ВЫВОДЫ

У больных асцитными формами рака яичников до лечения среди Тт, относящихся к СЭ4+, отмечено преимущественное содержание Тс т, а среди субпопуляции СЭ8+ — преобладание Тет с их накоплением в асцитической жидкости больных. Несмотря на высокие уровни Тт в крови и АЖ, их функция, по-видимому, является дефектной, вследствие чего представляется важным изучить возможность ее восстановления.

Положительная клиническая динамика у больных РЯ после завершения химиотерапии с рекомбинантным ин-терфероном-гамма по сравнению с получавшими только химиотерапию сопровождается снижением количества ТИ0 в крови больных, а среди СЭ8+ Тт — формированием преобладания Тст над Те т. Поскольку подобные изменения развиваются и в АЖ, такая модуляция иммунологического микроокружения опухоли может вносить вклад в развитие полученного клинического эффекта, в частности, более длительного безрецидивного периода у больных РЯ после введения рекомбинантного интерферона-гамма.

Литература

1. Cannon MJ, O'Brien TJ. Cellular Immunotherapy for ovarian cancer. Expert Opin Biol Ther. 2009 Jun; 9 (6): 677-88. doi: 10.1517/14712590902932897

2. Golubovskaya V, Wu L. Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy. Cancers (Basel). 2016 Mar 15; 8 (3): pii: E36. doi: 10.3390/cancers8030036

3. Beckhove Ph, Feuerer M, Dolenc M, Schuetz F, Choi C, Sommerfeldt N, et al. Specifically activated memory T cell subsets from cancer patients recognize and reject xenotransplanted autologous tumors. J Clin Invest. 2004 Jul 1; 114 (1): 67-76. doi: 10.1172/JCI200420278

4. Dunbar PR, Smith CL, Chao D, Salio M, Shepherd D, Mirza F, et al. A Shift in the Phenotype of Melan-A-Specific CTL Identifies Melanoma Patients with an Active Tumor-Specific Immune Response. J Immunol. 2000 Dec 1; 165 (11): 6644-52. doi: https://doi.org/10.4049/jimmunol.165.11.6644

5. Valmori D, Scheibenbogen C, Dutoit V, Nagorsen D, Asemissen AM, Rubio-Godoy V, et al. Circulating Tumor-reactive CD8(+) T cells in melanoma patients contain a CD45RA(+) CCR7(-) effector subset exerting ex vivo tumor-specific cytolytic activity. Cancer Res. 2002 Mar 15; 62 (6): 1743-50.

6. Hadrup S, Donia M, Thor Straten P. Effector CD4 and CD8 T Cells and Their Role in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 2013 Aug; 6 (2): 123-33. doi: 10.1007/s12307-012-0127-6

7. Klebanoff CA, Gattinoni L, Torabi-Parizi P, Kerstann K, Cardones AR, Finkelstein SE, et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jul 5; 102 (27): 9571-6.

8. Weninger W, Crowley MA, Manjunath N, von Andrian UH. Migratory properties of naive, effector, and memory CD8 (+) T cells. J Exp Med. 2001 Oct 1; 194 (7): 953-66.

9. Wherry EJ, Teichgräber V, Becker TC, Masopust D, Kaech SM, Antia R, et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 2003 Mar; 4 (3): 22534.

10. Sallusto F, Lenig D, Förster R, Lipp M, Lanzavecchia A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 1999 Oct 14; 401 (6754): 708-12.

11. Sallusto F, Geginat J, Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu Rev Immunol. 2004; 22: 745-63.

12. Church SE, Jensen SM, Antony PA, Restlfo NP, Fox BA. Tumor-specific CD4+ T cells maintain effector and memory tumor-specific CD8+ T cells. Eur J Immunol. 2014 Jan; 44 (1): 69-79. doi: 10.1002/eji.201343718

13. Perret R, Ronchese F. Memory T cells in cancer immunotherapy: which CD8 T-cell population provides the best protection against tumours? Tissue Antigens. 2008 Sep; 72 (з): 187-94. doi: 10.1111/j.1399-0039.2008.01088.x

14. Shin H, Iwasaki A. Tissue-resident memory T cells. Immunol Rev. 2013 Sep; 255 (1): 165-81. doi: 10.1111/imr.12087

15. Zammit DJ, Turner DL, Klonowski KD, Lefrangois L, Cauley LS. Residual antigen presentation after influenza virus infection affects CD8 T cell activation and migration. Immunity. 2006 Apr; 24 (4): 439-49.

16. Shin H, Iwasaki A. A vaccine strategy that protects against genital herpes by establishing local memory T cells. Nature. 2012 Nov 15; 491 (7424): 463-7. doi: 10.1038/nature11522

17. Mackay LK, Stock AT, Ma JZ, Jones CM, Kent SJ, Mueller SN, et al. Long-lived epithelial immunity by tissue-resident memory T (TRM) cells in the absence of persisting local antigen presentation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 1; 109 (18): 7037-42. doi: 10.1073/pnas.1202288109

18. Preston CC, Goode EL, Hartmann LC, Kalli KR, Knutson KL. Immunity and immune suppression in human ovarian cancer. Immunotherapy. 2011 Apr; 3 (4): 539-56. doi: 10.2217/imt.11.20

19. de Bruyn M, Wiersma VR, Wouters MC, Samplonius DF, Klip HG, Helfrich W, et al. CD20+ T cells have a predominantly Tc1 effector memory phenotype and are expanded in the ascites of patients with ovarian cancer. Oncoimmunology. 2015 Mar 19; 4 (4): e999536. eCollection 2015 Apr. doi: 10.1080/2162402X.2014.999536

20. Balkwill F. Cancer and the chemokine network. Nat Rev Cancer. 2004 Jul; 4 (7): 540-50. doi: 10.1038/nrc1388

21. Бережная Н. М., Чехун В. Ф. Иммунология злокачественного роста. К.: Наукова Думка; 2005. 792 с.

22. Fidler IJ. The organ microenvironvent and cancer metastasis. Differentiation. 2002 Dec; 70 (9-10): 498-505.

23. Lewis CE, Pollard JW. Distinct role of macrophages in different tumor microenvirontments. Cancer Res. 2006 Jan 15; 66 (2): 605-12.

24. Ашрафян Л. А., Киселев В. И., Муйжнек Е. Л., Герфано-ва Е. В., Антонова И. Б., Кузнецов И. Н. и др. Современные принципы эффективной терапии рака яичников. Опухоли женск. репрод. системы. 2015; 11 (2): 68-75.

25. Тюляндин С. А., Деньгина Н. В., Коломиец Л. А., Мор-хов К. Ю., Нечушкина В. М., Покатаев И. А. и др. Практические рекомендации по лекарственному лечению рака яичников/ первичного рака брюшины/ рака маточных труб. Злока-честв. опухоли. 2016; (4 Спецвып. 2): 123-34.

26. Шмелев В. А., Личиницер М. Р., Абрамов М. Е., Кузнецов В. В., Славина Е. Г., Кадагидзе З. Г. Инновационный противоопухолевый цитокиновый препарат Ингарон. Мед. алфавит. Диагностич. радиол. и онкотер. 2013; (3-4): 60-8.

27. Неродо Г. А., Новикова И. А., Златник Е. Ю., Арджа А. Ю. Применение Ингарона в комплексе с химиотерапией у больных раком яичников III-IV стадий. Фундамент. исслед. 2015; 1-8: 1649-54.

28. Брюзгин В. В., Платинский Л. В. Роль цитокинов в химиотерапии злокачественных опухолей: практика применения цитокиновых препаратов. Рефнот и Ингарон при распространенных опухолевых процессах с множественными метастазами. Совр. онкол. 2014; 16 (1): 70-5.

29. Златник Е. Ю., Неродо Г. А., Новикова И. А., Бахтин А. В., За-кора Г. И., Селютина О. Н. и др. Молекулярные и клеточные факторы локального иммунитета в асцитической жидкости при раке яичников. Мол. мед. 2016; 14 (3): 39-42.

30. Pollard JW. Tumor-educated macrophages promote tumor progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 2004 Jan; 4 (1): 71-8.

31. Курганова Е. В., Тихонова М. А., Лебедева В. А., Ласка-вая Е. Г., Коваленко В. Ф., Останин А. А. и др. Характеристика регуляторных Т-клеток у больных раком яичников. Сибирск. онкол. журн. 2008; 30 (6): 40-5.

References