CC BY
13
© Коллектив авторов, 2005
И.И. Ремизова, Г.Н. Чистякова, Г.А. Черданцева
РОЛЬ ИММУННЫХ ФАКТОРОВ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ
ГУ «Уральский НИИ охраны материнства и младенчества МЗ РФ» (дир. проф. Г.А. Черданцева), г.Екатеринбург, РФ
Обследовано 100 новорожденных, в том числе 36 здоровых детей и 64 ребенка, родившихся от матерей с урогенитальным хламидиозом. Установлено, что наиболее информативными иммунологическими показателями, отражающими развитие признаков инфицирования у новорожденных, являются определение титра антител к липополисахаридам хламидий (IgG к LPS), оценка функциональной аффинности антител к нейтрализующим антигенам главного белка внешней мембраны (IgG к МОМР), измерение концентрации циркулирующих иммунных комплексов с низкой молекулярной массой. На основании информативных показателей разработано правило прогнозирования развития хламидийной инфекции в раннем неонатальном периоде.
Authors examined 100 neonates (36 healthy children and 64 children born by mothers with urogenital chlamydiasis). They showed that most informative immunologic parameters testified to invasion signs development in neonates were: determination of antibodies titer to Chlamydia lipopolycaccharides (IgG to LPS), estimation of antibodies functional affinity to neutralized antigens of major outer membrane protein (IgG to MOMP), measurement of low molecular weight circulated immune complexes concentration. Rule of Chlamydia infection development in early neonatal period was outworked on the background of most informative parameters.
В настоящее время общепринятым критерием для верификации внутриутробной хламидийной инфекции (ХИ) у новорожденных является обнаружение возбудителя или антигена, а также выявление специфических ^М в пуповинной крови [1—3]. Это не всегда обеспечивает правильную постановку диагноза, так как в раннем периоде новорожденнос-ти, даже при использовании современных высокочувствительных методов, вероятность определения возбудителя или антигена невелика и возможны ложноположительные результаты. Оценка специфического противохламидийного иммунитета вызывает определенные сложности из-за иммуносупрессии клеточных и гуморальных реакций новорожденного. Кроме того, инфицирование новорожденного не всегда завершается развитием инфекционного процесса [4], что не позволяет при использовании стандартных методов исследования прогнозировать осложнения в раннем неонатальном периоде адаптации и формировать группу риска по развитию ХИ у данной категории детей.
Цель работы — выявить диагностическую информативность показателей иммунной системы новорожденных, отражающих развитие ХИ в раннем неона-тальном периоде.
Материалы и методы исследования
Проведено комплексное клинико-иммунологи-ческое обследование 100 новорожденных (на 3—5-е сутки жизни), родившихся от женщин с физиологи-
ческой и осложненной хламидиозом беременностью.
В соответствии с установленным диагнозом, нами выделены следующие группы: 1-я группа — 36 здоровых доношенных новорожденных, родившихся от женщин с неосложненной беременностью, низким и умеренным риском по развитию неонаталь-ной инфекции; 2-я группа — 30 детей от женщин с ХИ, у которых ранний период адаптации протекал физиологически (дети были выписаны домой на 4— 7-е сутки жизни); 3-я группа — 34 новорожденных, родившихся с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ).
Диагноз ХИ у новорожденных был верифицирован на основании выявления ДНК инфекционного агента методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием отечественных тест-систем "Литех" (Москва). Материалом для исследования служили образцы проб, взятые с задней стенки глотки, конъюнктивы глаза, осадка мочи.
Серологические исследования проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с определением родо-специфических антител (АТ) к липополисахаридам (LPS) хламидий (r-ELISA "MEDAK", Германия), видоспецифи-ческих АТ классов IgM, IgG к нейтрализующим антигенам (АГ) основного белка внешней мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis (Ch. trachomatis), Chlamydia pneumonia и Chlamydia psittaci (Ch. pneumonia, psittaci) (ЗАО "Вектор-Бест", НПО "Медико-Биологический Союз"). Иммунологическое обследование новорожденных включало в себя исследование клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Идентификацию лимфоцитов проводили в реакции прямой иммунофлюоресценции на про-
точном цитофлюориметре фирмы «Becton Dickinson» с использованием диагностических наборов «Simul Set IMK Lymphocyte» с помощью моноклональных антител (МкАТ), меченных флюоресциин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) и фи-коэритрином (ФЭ) к фенотипическим маркерам лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16, 56+ и антигенам CD19+/CD23+ , CD3+/HLADR+.
Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) выполняли методом преципитации в 3% и 4% растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) (Грине-вич Ю.А. и соавт., 1981). Иммунные комплексы, выделенные при 4% концентрации ПЭГ, оценивали как содержащие крупные, средние и малые по размеру агрегаты (полный состав ЦИК). При 3% концентрации ПЭГ в основном осаждаются крупные ЦИК. Содержание средне-и низкомолекулярных ЦИК определяли по разности концентраций IgG в комплексах, полученных соответственно в 4% и 3% ПЭГ.
Определение сывороточных Ig A, M, G классов определяли методом радиальной иммунодиффузии (Mancini G. et al., 1965) c использованием моноспецифической сыворотки Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов.
Функциональную активность специфических IgG оценивали по интенсивности их взаимодействия с АГ (аффинности) [5, 6], модифицированной нами для определения аффинности антихламидийных АТ.
Способ определения функциональной активности ан-тихламидийных АТ: в предварительно промытые фосфатным буфером лунки полистиролового планшета, с иммо-билизированным антигеном (МОМР Chlamydia) вносили контрольные (положительные и отрицательные) сыворотки и опытные образцы (положительную на хламидии сыворотку пациентов брали в разведении, дающем при длине волны 492 нм оптическую плотность 1000—1500 ед.). После фиксации АТ и последующей отмывки фосфатным буфером в лунки добавляли аммоний роданистый (CH4N2S — о.с.ч.) ("MERCK", Германия) в различных концентрациях (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 М). После 10-минутной инкубации лунки планшета отмывали фосфатным буфером. Далее реакцию проводили по инструкции используемой тест-системы.
Относительную величину аффинности АТ определяли по формуле: RHAV = А1-7+А2-6+А3-5+А4-4, где А1, А2, А3, А4 — процент от начального количества АТ, оставшихся в лунке после их обработки роданистым аммонием в концентрациях 2,5; 2,0; 1,5; 1,0 М соответственно.
Статистическую обработку материала проводили на IBM PC с использованием процедуры дискриминантного анализа, реализованной в пакете прикладных программ "КВАЗАР", "STATGRAPH 2.1".
Результаты и их обсуждение
При исследовании клеточного звена иммунитета новорожденных, родившихся от матерей с хла-мидиозом, в сравнении со здоровыми детьми 1-й группы были обнаружены статистически значимые различия в увеличении абсолютного количества В-лимфоцитов и экспрессии молекул активации (CD23+ и HLADR+) на поверхности CD19+ и CD3+ популяций соответственно (табл.1). Причем повышение числа В-клеток и активированной популяции Т-лимфоцитов были более выражены у детей с нео-сложненным течением раннего периода адаптации
в сравнении с новорожденными, имеющими признаки ВУИ. Что касается популяции МК-клеток, то значение этого показателя у детей 2-й группы не отличалось от аналогичного в группе здоровых новорожденных, тогда как у детей 3-й группы этот параметр превышал значения групп сравнения в 1,6 раза.
Наиболее выраженные нарушения функционирования иммунной системы были обнаружены при исследовании гуморального звена иммунитета. В сравнении с новорожденными 1-й группы у детей без признаков ВУИ наблюдалась тенденция к снижению активности комплемента и содержания основных классов сывороточных ^ (табл. 2). Особенно резко отличалось значение ^А, концентрация которого в 3,2 раза была ниже аналогичного параметра здоровых детей и в 2,5 раза отличалась у новорожденных 3-й группы. Концентрация ЦИК при этом оставалась на уровне здоровых детей.
Изменения, выявленные у новорожденных 3-й группы, выражались в снижении активности комплемента и повышении концентрации ЦИК. Содержание ^ находилось в пределах физиологической нормы.
Анализ специфических гуморальных реакций показал, что при одинаковой антигенной нагрузке (20% случаев во 2-й группе против 20,6% в 3-й группе) количественный и качественный состав антихламидийных АТ у новорожденных от матерей с хламидиозом различен. При развитии инфекционного процесса у новорожденных наблюдалась высокая концентрация специфических IgG как к липополисахаридному, так и к белковым АГ хламидий, функциональная активность АТ в обоих случаях была сниженной.
При физиологическом течении раннего периода адаптации в сыворотке крови новорожденных обнаруживались невысокие титры специфических IgG, которые обладали высокой функциональной активностью. Учитывая то обстоятельство, что АТ к МОМР являются ответственными за нейтрализацию хламидийных АГ, можно предположить, что высокоаффинные материнские АТ оказывают непосредственное влияние на формирование протек-тивного иммунитета новорожденных, что подтверждается отсутствием клинических признаков инфицирования у детей 2-й группы.
Возможно, что функционально активные специфические АТ матери воздействуют на субпопуляцию СБ4+ лимфоцитов новорожденного (г= 0,58; р<0,03), регулируя синтез высокоаффинных АТ посредством активации СБ19+клеток (СБ4 + -СБ19 + , г=0,63 при р<0,001; СБ19+ - СБ23+/ СБ19+, г=0,76 при р< 0,0001). При этом в сыворотке крови новорожденных наблюдается увеличение содержания В-клеток и повышение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности молекулы активации (ИЬАБК+/СБ3+). Обнаруженное нами снижение концентрации сы-
Таблица 1
Иммунологические показатели периферической крови у новорожденных, родившихся у матерей с ХИ, на 3—5-е сутки жизни
Показатели 1-я группа — здоровые новорожденные (n=36) 2-я группа — новорожденные с неосложненным периодом ранней адаптации (n=30) 3-я группа — новорожденные с признаками ВУИ (n=34)
Лимфоциты, • 109/л 3,69±0,20 3,32±0,22 3,59±0,24
CD3+, -109/л 2,93±0,19 2,67±0,67 2,76±0,24
CD4+, -109/л 2,30±0,17 1,99±0,17 1,97±0,15
CD8+, -109/л 0,77±0,04 0,76±0,09 0,73±0,07
CD4+/CD8+ 3,21±0,23 3,1±0,23 3,17±1,23
HLADR/CD3+, -109/л 0,06± 0,00 0,22±0,051) 0,14±0,021)
CD19+, -109/л 0,34±0,02 0,53±0,051) 0,40±0,031)- 2)
CD23/CD19+, -109/л 0,21±0,03 0,31±0,031) 0,39±0,061)
CD16,56+, -109/л 0,25±0,02 0,25±0,03 0,38±0,041) • 2)
Здесь и в табл. 2: р>0,05: 1) при сравнении показателей у детей 1-й группы, 2) при сравнении показателей у детей 2-й группы.
Таблица 2
Характеристика показателей гуморального звена иммунитета новорожденных, родившихся от матерей с физиологической и осложненной
хламидиозом беременностью
Показатели 1-я группа — здоровые новорожденные (n=36) 2-я группа — новорожденные с неосложненным периодом ранней адаптации (n=30) 3-я группа — новорожденные с признаками ВУИ (n=34)
IgA, г/л 0,13±0,01 0,04±0,02 1) 0,10±0,03 2)
IgM, г/л 0,20±0,02 0,13±0,05 1) 0,23±0,04
IgG, г/л 13,14±0,83 10,10±0,62 1) 11,99±0,54
Титр IgG к LPS, у.е. — 230,54±43,07 555,15±83,55 1)
Титр IgG к МОМР Chlamydia, у.е. — 81,54±14,70 324,23±167,351)
RHAV IgG к LPS, у.е. — 688,67±43,1 432,4547,161)
RHAV IgG к МОМР Chlamydia, у.е. — 803,90±125, 54 243,03±26,45 1)
СН50, усл.ед. 48,19±1,83 39,70±1,87 1) 40,69±1,22 1)
ЦИК общий состав, усл. ед. 3,81±1,30 5,17±1,93 32,2±6,94 1)- 2)
ЦИК высокомолекулярные, усл. ед. 1,30±0,58 3,42±1,58 8,1±2,54 1)- 2)
ЦИК низкомолекулярные, усл. ед. 0,54±0,30 1,67±0,61 25,90 5,61 1)- 2)
вороточных IgM, IgA, IgG и угнетение активности комплемента компенсируется повышенными уровнями В-лимфоцитов, а также функционально активными материнскими и собственными АТ новорожденного, которые, связываясь с АГ хламидий, способствуют элиминации патогена фагоцитирующими клетками. Доказательством этому служит незначительное количество иммунных комплексов, выявляемых в сыворотке крови новорожденных.
В случае осложненного течения периода ранней адаптации основное действие на иммунную систему новорожденных оказывали низкоаффинные материнские IgG к LPS хламидий. Снижение хелперной активности Т-лимфоцитов (55,74±1,50% против 61,36±1,91% здоровых детей) проявлялось в низком аффинитете образующихся специфических IgG АТ и их ограниченной эффекторной активности, сводящейся к спектру активности IgM и IgA. Чем выше в исследовании был титр низкоаффинных IgG к LPS хламидий, тем более высокой была концентрация сывороточных IgA и IgM новорожденных (г=0,69 при p<0,003). Нарушение в регуляции антителообразования CD4+клетками было сопряжено с угнетением активности комплемента, что еще более усугубляло супрессию гуморальных реакций и способствовало повышению циркуляции иммунных комплексов в кровяном русле.
Статистическая обработка полученных результатов исследования позволила определить наиболее информативные иммунологические показатели, отражающие развитие признаков инфицирования у новорожденных. Информативными являются следующие тесты диагностики: определение титра АТ к LPS хламидий (IgG к LPS), оценка функциональной аффинности АТ к нейтрализующим АГ главного белка внешней мембраны (IgG к МОМР), измерение концентрации ЦИК с низкой молекулярной массой.
На этой основе разработано правило прогноза развития ХИ в раннем неонатальном периоде:
F=X-K1+X2-K2+X3-K3+const, где где значения Х соответствуют иммунологическим параметрам: Х1 — (низкомолекулярные) ЦИК (усл.ед.), Х2 — IgG к LPS хламидий (усл.ед.), Х3 — аффинность IgG к МОМР хламидий (усл.ед.), Кх=0,04; К2=0,002; К3=-0,002; const=-0,48.
Далее, с использованием данных иммунологических показателей крови по уравнению определяют диагностический показатель F. При F<0 делают заключение об отсутствие иммунологических признаков развития ХИ. При F>0 диагностируют наличие лабораторных признаков, характерных для реализации данной патологии.
Предлагаемый способ дает вероятность правильной классификации в обучающей выборке — 94,7% для нормы (специфичность метода), для патологии (информативность метода) — 100%. Эффективность метода 97,1%. Вероятность распознавания на тестовой выборке (30 новорожденных) составила 100%.
Выводы
1 . Развитие ХИ в раннем неонатальном периоде сопровождается выраженными изменениями в иммунной системе новорожденных.
2. Пассивная передача высокоаффинных IgG к нейтрализующим АГ МОМР хламидий способствует формированию протективного иммунного ответа у новорожденных. Неблагоприятным прогнозом течения раннего периода адаптации является наличие в сыворотке крови новорожденных низкоаффинных IgG к LPS хламидий, оказывающих супрессивное влияние на иммунную систему.
3.Наиболее информативными лабораторными показателями, отражающими развитие инфицирования у новорожденных, являются титр IgG к LPS хламидий, функциональная аффинность специфических IgG к нейтрализующим АГ МОМР, концентрация ЦИК с низкой молекулярной массой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Запруднов АМ, Мазанкова ЛН, Панкратова ВН. //Рос. вестн. перинат. и педиат. — 2002. — № 3. — С. 46—49.
2. Ожегов А.М., Мякишева Л.С., Плахотина Н.Г. // Педиатрия. — 2000. — № 4. — С. 61—63.
3. Царегородцев АД, Рюмина И.И. //Рос.вестн.пери-нат. и педиатр. — 2001. — № 2. — С. 4—7.
4. Королева Л.И., Зубжицкая Л.Б. //Вестн. Рос.ассоц. акуш.-гинек. — 2000. — № 4. — С. 50—53.
5. Luxton R.W., Thompson E.J. //Journal of Immunological Methods. - 1990. — Vol. 131. — P. 277—282.
6. Климова С.В., Пинегин Б.В., Кулаков А.В. и др. //Иммунология. — 1997. — № 3. — С. 50—52.
