Роль хронического экспериментального поражения печени матери в нарушении генеративной функции потомства Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 611. 36. 018

РОЛЬ ХРОНИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ МАТЕРИ В НАРУШЕНИИ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ ПОТОМСТВА

Г.В. Брюхин, М.Л. Сизоненко, А.С. Романов, И.В. Зубарев, Д.С. Ласьков Челябинская государственная медицинская академия, г. Челябинск

Изучено влияние экспериментального поражения печени различного генеза у самок крыс на морфофункциональное становление генеративной функции потомства. Установлено, что патология печени матери в условиях эксперимента обусловливает нарушение фолликулогенеза в яичниках и сперматогенеза в семенниках потомства.

Ключевые слова: патология печени, потомство, сперматогенез, фолликулогенез.

Введение. Актуальность настоящего исследования определяется важной ролью материнского здоровья в решении проблемы воспроизводства полноценного потомства, в связи с чем вопросы сохранения здоровья женщины находятся в центре внимания ученых всего мира и рассматриваются в аспекте воспроизводства нового поколения. Современные медикобиологические и социальнодемографические исследования свидетельствуют, что здоровье взрослого населения, в том числе женщин фертильного возраста, не является оптимальным, а риск мутагенных и патогенных воздействий на материнский организм в связи с экологическим неблагополучием в регионах с интенсивным развитием промышленности, не имеет тенденции к снижению [7]. В связи с этим беременности высокого риска, являющиеся основным источником спонтанных абортов, мертворождае-мости, рождения маловесных, дефектных и физиологически незрелых детей, в настоящее время продолжают оставаться главным объектом изучения как для клиницистов, так и для теоретиков.

Одной из важнейших причин перинатальной патологии являются экстрагенитальные заболевания женщин, в структуре которых особое место, в силу своей распространенности, занимают болезни гепатобилиарной системы [9].

Ранее нами было показано, что у самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место задержка наступления беременности, пролонгирование беременности до 28-29 дней. При этом наблюдалось снижение численности пометов, характеризующихся выраженными признаками физиологической незрелости [2], что проявляется нарушением морфофункционального становления систем жизнеобеспечения, в том числе иммунной, кроветворной, пищеварительной, нейроэндокринной [1].

Эти теоретические предпосылки явились причиной изучения особенностей становления генеративной функции у 60-дневного потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатоби-лиарной системы различного генеза.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на белых лабораторных крысах «Вис-тар» (30 взрослых половозрелых самок) и их 60-дневом потомстве (60 крысят из 31 помета). Для достижения поставленной цели у взрослых половозрелых крыс-самок моделировалось хроническое поражение печени токсической и аутоиммунной этиологии.

Хроническое токсическое поражение («токсическая» - «Т»-группа) печени вызывалось путем однократного внутрибрюшинного введения взрослым половозрелым крысам Д (+)-галактозамина гидрохлорида («Sigma - G500», США) на 0,9 %-ном растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного [3]. Экспериментальную «галакто-заминовую» группу («Г»-группу) составили 20 крысят из 10 пометов.

Вторую группу составили животные, у которых создавался аутоиммунный процесс с преимущественным поражением печени («аутоиммунная» -«А»-группа) путем введения им 0,2 мл супернатанта шестидневной культуры E.coli (штамм АТСС 25922) [6]. Эту экспериментальную группу («Е»-группу) составили 17 крысят из 9 пометов.

О развитии патологического процесса в печени экспериментальных животных судили на основании морфологических изменений (очаговые бионекротические изменения гепатоцитов, дис-комплексация гепатоцитов, периваскулярная лим-фогистиоцитарная инфильтрация, гипертрофия и гиперплазия купферовских клеток), биохимических критериев (повышение концентрации билирубина, аланин- и аспартатаминотрансфераз и др.) и высокого титра печеночных аутоантител (1:640 и 1:1280).

Контрольную группу («К»-группа) составили интактные животные (23 крысенка из 12 пометов).

Объектом исследования явилось непосредственно потомство самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы на 60-й день после рождения, у которого проводилась оценка генеративной функции. Прежде всего осуществлялось определение весового индекса муж-

ских и женских половых желез. Оценка генеративной функции семенников проводилась на серийных гистологических срезах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну по общепринятой методике [8] с определением площади семенных извитых канальцев, суммарного количества сперматогенных клеток и их субпопуляцион-ного состава, а также количества канальцев со слущенным эпителием и числа гигантских сперма-тогенных клеток.

Одним из показателей, отражающих фертильность сперматозоидов, является характер их подвижности. В связи с этим нами проводилась оценка подвижности эпидидимальных сперматозоидов по общепринятой методике с определением числа неподвижных (0 баллов), «дергающихся» на месте (1 балл), слабоподвижных (2 балла) и прогрессивно-подвижных (3 балла) сперматозоидов. Для постановки этого теста зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника [5]. Затем с использованием камеры Горяева в полученной взвеси подсчитывали сперматозоиды в 5 больших квадратах в течение трех часов через каждые 15 минут.

Для оценки фолликулогенеза в яичниках потомства экспериментальных животных на серийных гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, а также железным гепаток-силином, проводился морфометрический анализ, позволяющий произвести дифференцированный подсчет овариальных фолликулов разных пулов. При этом использовалась общепринятая классификация Lintem Moore (1967), по методике Pedesen a Peters [10], основанная на оценке фолликула с определенным количеством фолликулярных клеток и его диаметра. Во избежание ошибок и повторов при подсчете учитывались овариальные фолликулы на максимальных сечениях ооцитов, маркерами которых служили ядрышки. Фолликулы, имеющие в окружении менее 10 клеток, относили к стадии 1-2 (покоящиеся); 1-20 клеток - к стадии 3а; 21-60 клеток - к стадии 3б; 61-100 клеток - к стадии 4; от 101 до 200 клеток - к стадии 5а; 201-400 клеток - к стадии 5б (растущие); 401-

600 клеток - к стадии 6; больше 600 - к стадии 7-8 (полостные). Для активности атрезии подсчитывали общее количество атретических фолликулов.

Полученные результаты обработаны статистически с использованием пакета прикладных программ {^ІагіБІЇса 6,0». Достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрического критерии Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Площадь поперечного сечения и диаметр семенных извитых канальцев оказались сниженными по сравнению с таковым в контроле. Так, если у ин-тактных 60-дневных крысят диаметр семенных канальцев составил 234,47 ± 5,527, то у подопытных животных токсической и аутоиммунной групп исследуемый показатель составил всего 189,13 ± 5,196 и 198,78 ± 4,69 соответственно. Аналогичная закономерность выявлена и при изучении площади поперечного сечения канальцев. Так, у интактных крысят данный показатель составил 43574 ± 1592 мкм2, а у подопытных крысят всего 28387 ± 1005 мкм2 и 31298 ± 584 мкм2 соответственно.

Важнейшим показателем структурно-функционального состояния семенника является характеристика сперматогенного пласта. Сперматоген-ный пласт изучался нами с учетом суммарного содержания сперматогенных клеток и их субпопу-ляционного состава. Обнаружено, что у интактных крысят суммарное содержание сперматогенных клеток составляет 265,9 ± 33,53, а у подопытных животных как токсической (235,21 ± 3,29), так и аутоиммунной (242,15 ± 2,63) групп снижено.

Наибольший интерес представляют данные дифференцированного анализа сперматогенных клеток с учетом их зрелости [8].

Нами установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени имеет место изменение субпопуляционного состава сперматогенных клеток по сравнению с контролем (табл. 1).

Как видно из табл. 1, какой-либо закономерности в изменении числа сперматогоний различной степени зрелости (А, П, Б) у эксперименталь-

Таблица 1

Субпопуляционный состав сперматогенных клеток семенных извитых канальцев семенников экспериментальных животных (М ± т)

Сперматогенные клетки Группа

Контрольная(К) Опытная 1 (О1) Опытная 2 (О2)

Суммарное содержание сперматогоний 44,94 і G,86 ж 13,3б і G,66 4б,12 і 3,GG

Сперматогонии А 22,38 і G,18 ж 2G,65 і G,31 2G,72 і G,11*

Сперматогонии П 8,87 і G,18 9,G8 і G,4* 9,75 і G,22*

Сперматогонии Б 13,б9 і G,3 ж 1З,бЗ і G,33 ж 12,28 і G,49

Сперматоциты I и II 194,57 і 1,87 179,3 і 2,5* ж 179,79 і 1,5б

Сперматиды 1б,4б і 1,19 8,б1 і G,5* ж 1G,59 і G,79

Сперматозоиды 9,94 і G,86 ж 3,93 і G,49 б,53 і G,92*

Суммарное кол-во сперматогенных клеток 2б5,9 і 3,52 ж 235,21 і 3,2 ж 242,15 і 2,б

Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < G,G5).

Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура», выпуск 3G

ее

Проблемы здравоохранения

ных животных выявить не удается. В то же время содержание сперматоцитов 1 и 2 порядка, сперма-тид и сперматозоидов в семенных извитых канальцах подопытных крысят снижено по сравнению с интактными животными. Вместе с тем у подопытных крысят выявлено существенное увеличение по сравнению с контрольной группой числа семенных извитых канальцев со слущенным эпителием, являющегося чувствительным индикатором интенсивности апоптотических процессов. Так, если у интактных крысят содержание канальцев со слущенным эпителием составляет 7,11 ± 1,3, то у подопытных животных обеих групп исследуемый показатель оказался существенно увеличенным и составил 25,5 ± 3,1 и 27,44 ± 4,0. Заслуживают внимания также данные, свидетельствующие об увеличении в семенных извитых канальцах подопытных крысят числа гигантских сперматогенных клеток. Так у интактных крысят содержание таких клеток в канальцах составило

0,32 ± 0,02, а у подопытных животных обеих экспериментальных групп этот показатель оказался равным 0,64 ± 0,13 и 0,55 ± 0,08.

Таким образом, анализ результатов данной серии исследования позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место нарушение процесса сперматогенеза, о чем свидетельствует, прежде всего, снижение суммарного содержания сперматогенных клеток, а также количества сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов в семенных извитых канальцах.

Анализ двигательной активности сперматозоидов позволил выявить следующую закономерность. У подопытных половозрелых крысят общее содержание в 1 мл эпидидимальных сперматозоидов снижено по сравнению с контролем (154,47 ± 2,74)106 и составляет соответственно (69,24 ± 1,365) 106 и (99,29 ± 1,716)106. Кроме того, у интактных крысят первоначально содержание прогрессивно-подвижных сперматозоидов составило 18,90 ± 0,691 %, в то время как у крысят опытной группы 1 этот показатель был равен всего 8,25 ± 1,876 %, а у животных второй опытной группы 1,86 ± 1,742 %. Через 15 минут после начала исследования у подопытных крысят отсутствовали прогрессивноподвижные сперматозоиды, в то же время у ин-тактных животных число половых клеток данной популяции составило 0,25 ± 0,125 %. Аналогичная закономерность выявлена и при анализе содержания слабоподвижных сперматозоидов (рис. 1).

Таким образом, на всех сроках исследования у подопытных крысят обеих групп число фертильных сперматозоидов (прогрессивно-подвижных и слабоподвижных) снижено по сравнению с контролем.

При этом у подопытных крысят обеих групп содержание нефертильных («дергающихся» на месте и неподвижных) сперматозоидов на большинстве сроков исследования оказалось повышенным по сравнению с группой сравнения (рис. 2).

В следующей серии нашего исследования проведен анализ особенностей фолликулогенеза в яичниках потомства самок крыс с эксперимен-

20 15 % 10 5 0

1 15 30 45

и с

----К - - - ■ Опыт 1---Опыт 2

Рис. 1. Динамика изменения содержания эпидидимальных слабоподвижных сперматозоидов

Рис. 2. Динамика изменения содержания эпидидимальных «дёргающихся» (а) и неподвижных (б) сперматозоидов

Таблица 2

Популяционный состав фолликулов по степени зрелости в яичниках экспериментальных животных (М ± т)

Показатель Группа

К О1 О2

Суммар. кол-во фоллик. 702 ± 53 526 ± 34 627 ± 58*

Фолликулы 1 типа 164 ± 28 80 ± 4 138±22*

Фолликулы 2 - 3 а типа 90 ± 11 47 ± 6* 58 ± 6*

Фолликулы 3 б типа 64 ± 5 40 ± 4 76 ± 7*

Фолликулы 4 типа 62 ± 6 74 ± 6* 85 ± 5

Фолликулы 5 а типа 96 ± 9 54 ± 3* 52 ± 6*

Фолликулы 5 б типа 112 ± 16 107 ± 8 98 ± 6

Фолликулы 6 типа 42 ± 3 40 ± 5* 54 ± 6

Фолликулы 7- 8 типа 96 ± 9 84 ± 7* 66 ± 5

Малые фолликулы 254 ± 25 127 ± 27 196±46*

Средние фолликулы 222 ± 16 168±15 213±14*

Большие фолликулы 226 ± 19 231 ± 24 218 ± 19

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05).

тальным поражением печени (табл. 2). Одним их важнейших показателей, отражающих функциональное состояние яичников, является суммарное содержание фолликулов различной степени зрелости [4]. Нами установлено, что у подопытных животных суммарное содержание фолликулов снижено по сравнению с контролем.

Так, у интактных крысят этот показатель составил 702 ± 53, в то время как у подопытных животных и токсической (526 ± 34), так и аутоиммунной (627 ± 58) групп суммарное содержание фолликулов различной степени зрелости оказалось сниженным. При этом дифференцированный подсчет овариальных фолликулов позволил выявить определенную закономерность: у подопытных крысят содержание больших фолликулов практически не отличается от контроля, в то время как число малых фолликулов, являющихся резервом будущих половых клеток, существенно снижено (см. табл. 2). Уменьшение числа растущих фолликулов в яичниках подопытных крысят обеих групп в период становления половой зрелости согласуется с результатами, полученными при анализе числа атретических фолликулов в их яичниках. У потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза число атрети-ческих фолликулов существенно увеличено по сравнению с контролем. Так, у подопытных животных токсической и аутоиммунной групп число атретических фолликулов соответственно составило 39,54 и 31,67 %, в то время как у животных контрольной группы исследуемый показатель оказался равным 30,7 %.

Таким образом, результаты данной серии исследования позволяют констатировать, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени, в яичниках имеет место нарушение процесса фолликулогенеза, что, прежде всего, находит свое проявление в уменьшении числа рас-

тущих фолликулов и как следствие уменьшение суммарного количества фолликулов, а также в усилении процессов атрезии фолликулов.

Заключение. Нарушение условий внутриутробного развития при моделировании поражения гепатобилиарной системы матери приводит к нарушению процессов формирования коррелятивных взаимоотношений в гипофизарно-тиреоидно-адреналово-половой системе плода, что обусловливает задержку структурного становления репродуктивной системы. Развивающийся комплекс изменений репродуктивной системы потомства может возникнуть в результате массированного проникновения через фетоплацентарный барьер патологических продуктов метаболизма при токсической патологии печени, а также сенсибилизированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфических антител, циркулирующих иммунных комплексов и других гуморальных факторов иммунной системы, что наиболее характерно для аутоиммунного поражения печени. Под влиянием этих факторов происходит нарушение процессов мейоза, усиление дегенеративной гибели половых клеток и уменьшение их суммарного количества. В целом, выявленные нарушения процессов сперматогенеза и фолликулогенеза позволяют говорить, что у самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы рождается потомство с нарушением становления репродуктивной функции.

Литература

1. Брюхин, Г.В. Влияние хронических заболеваний печени матери на развитие потомства в условиях эксперимента / Г.В. Брюхин // Роль патологии печени матери в нарушении развития, реактивности и резистентности потомства в условиях эксперимента: сб. - Челябинск, 2009. - С. 6-16.

2. Брюхин, Г.В. Влияние хронических холе-статических поражений печени матери на по-

Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура», выпуск 30

101

Проблемы здравоохранения

томство в условиях эксперимента / Г.В. Брюхин // Морфология. - 1994. - № 2. - С. 18-21.

3. Венгеровский, А.И. Механизм действия ге-патопротекторов при токсическом поражении печени / А.И. Венгеровский, А.С. Саратиков // Фармакология и токсикология. - 1988. - № 1. -С. 89-93.

4. Волкова, О.В. Морфогенетические основы развития и функции яичников / О.В. Волкова, Т.Г. Боровая. - М., 1999. - 254 с.

5. Егорова, Г.М. Токсикология новых промышленных химических веществ / Г.М. Егорова, Н.Г. Иванов, И.В. Саноцкий. - Л., 1966. - С. 33-36.

6. Моделирование воспалительного процесса в печени /Б.А. Сааков, А.И. Поляк, В.Е. Рычнев и др. // Моделирование, методы изучения и эксперимен-

тальная терапия патологических процессов. - М., 1967. - С. 119-123.

7. Николаева, Л.Б. Первая беременность и первые роды: моногр. / Л.Б. Николаева, Г.А. Ушакова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2011. - 264 с.

8. Ухов, Ю.И. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников / Ю.И. Ухов, А.Ф. Астраханцев // Арх. анат., гис-тол. и эмбриол. - 1983. - № 3. - С. 66-72.

9. Шехтман, М.М. Руководство по экстраге-нитальной патологии у беременных / М.М. Шехтман. - М.: Триада-Х, 2003. - 816 с.

10. Pedersen, T. Proposal for a classification of oocytes and follicules in the mouse ovary / T. Pedersen, H. Peters // J.Reprod. Fertil. - 1968. - Vol. 17. -P. 555-557.

Поступила в редакцию 10 декабря 2011 г