CC BY
47
Тодоров С.С., Сидоров Р.В., Талалаев Е.П., Шлык И.Ф. РОЛЬ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ И ПРОТЕОГЛИКАНОВ В НЕОАНГИОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ
РОЛЬ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ И ПРОТЕОГЛИКАНОВ В НЕОАНГИОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ
Тодоров С.С., Сидоров Р.В., Талалаев Е.П., Шлык И.Ф. УДК: 616.13-004.6
Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Резюме
Цель исследования - сравнительный морфологический, гистохимический, иммуногистохимический анализ атеросклеротических бляшек для уточнения роли гладких миоцитов, протеогликанов в неоангиогенезе. Фрагменты артерий с признаками атеросклероза (бедренная, подколенная, наружная сонная) у 70 больных преимущественно мужского пола в возрасте старше 60 лет. После вырезки фрагментов артерий и их фиксации в забуференном 10% растворе формалина, обычной проводки, заливки в парафин, выполняли микротомию с последующей окраской гистологических препаратов гематоксилином-эозином, по Массону, Хочкиссу с докраской альциановым синим. Иммуногистохимический этап исследования включал окраску готовых гистологических препаратов с использованием антител CD34, CD68, SMA фирмы DAKO аппаратом Bond (Дания). В атеросклеротической бляшке наряду с явлениями атероматоза со скоплением пенистых макрофагов в интиме, микрокальцинозом медии, отмечались явления расслоения слоев, пристеночные смешанные тромбы, новообразование сосудов капиллярного типа. Вокруг зон неоангиогенеза имелась гиперплазия гладких миоцитов с выраженной экспрессией белков SMA, CD34 в мелких сосудах и клеточных элементах, скопление протеогликанов (гликозаминогликанов). Полученные данные позволяют считать, что гладкие миоциты, протеогликаны играют важную роль в не-оангиогенезе атеросклеротической бляшки.
Ключевые слова: атеросклеротическая бляшка, гладкие миоциты, протегликаны, неоангиогенез, гистохимия, иммуногистохимия.
THE ROLE OF SMOOTH MYOCYTES AND PROTEOGLYCANS IN NEOANGIOGENESIS OF ATHEROSCLEROSTIC PLAQUE
Todorov S.S., Sidorov R.V., Talalaev E.P., Shlyk I.F.
The aim of the study was a comparative morphological, histochemical, immunohis-tochemical analysis of atherosclerotic plaques to clarify the role of smooth myocytes, proteoglycans in neoangiogenesis. Fragments of arteries with signs of atherosclerosis (femoral, popliteal, external carotid) in 70 patients predominantly male over the age of 60 years. After cutting out fragments of arteries and fixing them in a buffered 10% formalin solution, the usual wiring, pouring into paraffin, a microtomy was performed followed by the coloring of histological preparations with hematoxylin-eosin, Masson, PAS with alcian blue. The immu-nohistochemical stage of the study included the color of the finished histological preparations using antibodies CD34, CD68, SMA by DAKO Bond of Denmark. In an atherosclerotic plaque, in addition to the phenomena of atheromatosis with accumulation of foamy macrophages in the intima, microcalcinosis of the media, layers stratification, parietal mixed thrombi, and a new formation of capillary vessels were noted. Around the zones of neoangiogenesis there was hyperplasia of smooth myocytes with pronounced expression of SMA, CD34 proteins in small vessels and cellular elements, infiltration by proteoglycans (glycosaminoglycans). The obtained data allow to consider that smoothmyocytes, proteoglycans play an important role in neoangiogenesis of atherosclerotic plaque.
Keywords: atherosclerotic plaque, smooth myocytes, proteoglycans, neoangiogenesis, histochemistry, immunohistochemistry.
На сегодняшний день атеросклеротическое поражение артерий представляет собой грозное прогрессирующее заболевание, ведущее к развитию ишемической болезни сердца, головного мозга, почек, кишечника, нижних конечностей. Морфологическим субстратом атеросклероза является бляшка, которая может стабильной и нестабильной. Нестабильная атеросклеротическая бляшка характеризуется наличием в ней неоангиогенеза, кровоизлияний, тромбоза, расслоения стенок [1].
Известно, что атеросклеротическая бляшка представлена дном и покрышкой. Дно бляшки состоит из кристаллов холестерина, триглицеридов, неэстерифи-цированных жирных кислот, масс детрита, микрокаль-цификатов, окруженных макрофагами, содержащими в цитоплазме продукты распада жиро-белковых масс (пенистые клетки). Покрышка бляшки представлена клеточно-волокнистыми и сосудистыми элементами: гладкими миоцитами, моноцитами, лимфоцитами, кол-лагеновыми волокнами, мелкими сосудами [2].
Однако, до настоящего времени остается открытым вопрос о происхождении данных сосудов в нестабильной бляшке. По мнению одних авторов, неоангиогенез в нестабильной бляшке возникает из сосудов адвентициаль-ной оболочки артерий путем их глубокого прорастания в медию и интиму [3]. Другие исследователи полагают, что новообразованные сосуды могут возникать в инти-
ме, возможно с участием моноцитов и факторов роста [4].
Возникновение и формирование сосудов в нестабильной атеросклеротической бляшке является «ключом» к развитию тромбозов, а, следовательно, может служить источником тромбоэмболических осложнений внутренних органов.
В последние годы, наряду с обсуждением участия моноцитов, макрофагов и их подтипов (М1, М2) в ге-незе атеросклеротической бляшки, большое внимание уделяется гладким миоцитам. Данные экспериментальных исследований позволяют судить о наличии двух фенотипических вариантов гладких миоцитов: контра-ктильного и секреторного. Контрактильные гладкие миоциты имеют веретеновидную форму, содержат актин, способны к сокращению в стенках артерий. Секреторные гладкие миоциты напоминают эпителиодные клетки, содержат факторы роста, в том числе VEGF, TGF-b, могут принимать участие в секреции гликозаминогликанов межуточного вещества артерий [5; 6; 7; 8].
Процесс трансформации гладких миоцитов контра-ктильного в секреторный тип остается до конца неизученным, при этом не исключается роль факторов транскрипции, микроРНК, эпигенетических модификаций [9].
В этой связи изучение роли гладких миоцитов, протеогликанов в неоангиогенезе атеросклеротической
Тодоров С.С., Сидоров Р.В., Талалаев Е.П., Шлык И.Ф.
РОЛЬ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ И ПРОТЕОГЛИКАНОВ В НЕОАНГИОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ
бляшки приобретает свою клиническую актуальность, поэтому целью нашего исследования было проведение сравнительного морфологического, гистохимического, иммуногистохимического исследований атеросклероти-ческих бляшек для уточнения роли гладких миоцитов, протеогликанов в неоангиогенезе.
Материалы и методы
Материалом послужили оперативно удаленные фрагменты артерий с признаками атеросклероза (бедренная, подколенная, наружная сонная) у 70 больных преимущественно мужского пола (75%) в возрасте старше 60 лет. До выполнения операций проходимость сосудов оценивали с помощью УЗИ с допплерометрией, ангиографического исследования. Для морфологического исследования вырезались кусочки артерий в виде колец, которые фиксировали в забуференном 10% нейтральном растворе формалина в течение 12 часов и после обычной спиртовой проводки заливались в парафин. После чего выполняли микротомию с толщиной срезов не более 2,5 мкм и окраской полученных гистологических препаратов гематоксилином-эозином, по Массону, по Хочкиссу с докраской альциановым синим при PH-2.0 для выявления коллагеновых волокон и протеогликанов. Иммуногистохимический этап исследования включал окраску готовых гистологических срезов с использованием readytouse антител CD34, CD68, SMA в иммуноги-стостейнере Bond фирмы DAKO (Дания).
Результаты и обсуждение
Гистологическое исследование артерий выявило наличие атеросклеротической бляшки с признаками атероматоза, микрокальциноза преимущественно медии, скопление пенистых макрофагов в интиме (Рис. 1). При этом обращало внимание отсутствие выраженной вос-
палительной клеточной инфильтрации стенки артерии в области бляшки.
В отдельных участках артерий имелись фокусы расслоения интимы с образованием пристеночных смешанных тромбов, что было характерным для нестабильной атеросклеротической бляшки. В поверхностных отделах бляшки сохранялись пенистые макрофаги, а в медии имелись мелкие скопления кальцификатов, бесструктурных белково-жировых масс (атероматоз) (Рис. 2).
На границе с участками формирования пристеночных тромбов в стенках артерий, преимущественно во внутренней и средней оболочках отмечалось новообразование тонкостенных сосудов капиллярного типа, в просветах которых имелись форменные элементы крови. Данные сосудистые структуры нередко плотно прилежали друг к другу, напоминая кавернозные ангиомы (Рис. 3).
Рис. 2. В интиме артерии - скопление пенистых макрофагов, микрокальци-фикаты, очаговое расслоение стенки с образованием смешанного тромба. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х 100
Рис. 1. Атеросклеротическая бляшка: в интиме артерии отмечается скопление пенистых макрофагов, со стороны медии - атерома, представленная некрозом клеток и волокон с фокусами микро-кальцификации. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х 100
Рис. 3. Новообразованные тонкостенные сосуды капиллярного типа (не-оангиогенез) в интиме и медии артерии при атеросклерозе (по типу кавернозных ангиом). ШИК-реакция с докраской альциановым синим. Ув. х 200
Тодоров С.С., Сидоров Р.В., Талалаев Е.П., Шлык И.Ф. РОЛЬ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ И ПРОТЕОГЛИКАНОВ В НЕОАНГИОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ
Рис. 4. В стенке артерии - очаговое скопление веретеновидных гладких Рис. 6. Экспрессия белка SMA в гладких миоцитах стенки артерии. ИГХ-миоцитов, отек межуточного вещества. Реакция по Массону. х 400 реакция с белком SMA. Ув. х 400
Рис. 5. Гиперплазия гладких миоцитов, новообразованные сосуды капиллярного типа в стенке артерии при атеросклерозе. Реакция по Массону. Ув. х 200
Эти морфологические изменения указывали на наличие неоангиогенеза в атеросклеротической бляшке.
Чаще всего тонкостенные сосудистые полости были окружены клеточными элементами - гладкими миоци-тами, имеющими вытянутую веретеновидную форму, иногда с причудливыми формами и длинными отростча-тыми структурами. Окружающее межуточное вещество было отечным, содержало неравномерное количество, преимущественно за счет кислых гликозаминогликанов (Рис. 4).
В медии артерий, вокруг новообразованных сосудов капиллярного типа отмечалась гиперплазия гладких миоцитов, расположенных в различных направлениях среди отечного ШИК - позитивного межуточного вещества, что указывало на накопление кислых мукополисахаридов в строме (Рис. 5).
Иммуногистохимическое исследование обнаруживало выраженную экспрессию белка SMA в стенках новообразованных сосудов капиллярного типа, гладких миоцитах (Рис. 6, 7). Кроме того, в бляшках артерий,
Рис. 7. Атеросклеротическая бляшка: выраженная экспрессия белка SMA в гладких миоцитах, стенках новообразованных сосудов мелкого калибра. ИГХ-реакция с белком SMA. Ув. х 200
Рис. 8. Экспрессия белка CD34 в новообразованных сосудах капиллярного типа при атеросклерозе. ИГХ-реакция с белком CD34. Ув. х 200
содержащих мелкие сосуды, отмечалась позитивная реакция с CD34, что свидетельствовало о неоангиогенезе (неоваскулогенезе) (Рис. 8).
Тодоров С.С., Сидоров Р.В., Талалаев Е.П., Шлык И.Ф.
РОЛЬ ГЛАДКИХ МИОЦИТОВ И ПРОТЕОГЛИКАНОВ В НЕОАНГИОГЕНЕЗЕ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ
Заключение
Атеросклеротическая бляшка артерий представляет комплекс взаимодействий липидов, клеток (моноциты, макрофаги, пенистые клетки, гладкие миоциты), компонентов соединительной ткани (коллагеновые волокна, протеогликаны, новообразованные сосуды). Гладкие миоциты, по-видимому, играют важную роль в генезе неоангиогенеза, прогрессии роста бляшки, о чем свидетельствует гиперплазия и наличие различных форм данных клеток вокруг зон неоваскуляризации.
Нами обнаружено, что в участках неоваскуляриза-ции атеросклеротической бляшки артерии наблюдается скопление кислых мукополисахаридов, окружающих гладкие миоциты и тонкостенные сосуды капиллярного типа. Мы полагаем, что гладкие миоциты могут приобретать секреторные свойства и участвовать в продукции гликозаминогликанов.
Полученные данные не противоречат результатам экспериментальных исследований, которые подтверждают участие секреторных гладких миоцитов в неоваскуло-генезе, продукции фиброзной ткани атеросклеротической бляшки [10].
В литературе имеются сведения о том, что гладкие миоциты могут служить источником образования макрофагов, миофибробластов, фибробластов в атеросклеротической бляшке путем их сложной трансдифференциров-ки [9-14], что может объяснить увеличение количества пенистых макрофагов в структуре атеросклеротической бляшки.
Мы полагаем, что клеточно-межклеточные взаимоотношения в атеросклеротической бляшке могут помочь уточнить ряд ранних патологических процессов в стенках артерий, например, при интимальной гиперплазии коронарных артерий, что имеет важное значение в оценке степени нарушений кровотока.
В наших работах, по священных изучению интим аль-ной гиперплазии, было показано, что наряду с гиперплазией (пролиферацией) гладких миоцитов внутренней и средней оболочек артерий возникало накопление глико-зоминогликанов (мукополисахаридов) [15-17].
Подобные морфологические изменения могут быть патогенетически связаны с развитием атеросклероза. Однако, это требует дальнейших исследований.
5. Stoger, J.L., Gijbels, M.J., van der Velden, S., Manca, M., van de Loos, C.M., Biessen, E.A., Daemen, M.J., Lutgens, E., de Winther, M.P. Distribution of macrophage polarization markers in human atheroscleros-is. Atherosclerosis 2012; 225(2): 461-468. https://doi.org/10.10167j.atherosclerosis.2012.09.013.
6. Chinetti-Gbaguidi, G., Colin, S., Staels, B. Macrophage subsets in atherosclerosis. Nature Reviews Cardiology. 2015; 12(1): 10-17. https://doi.org/10.1038/nrcard-io.2014.173.
7. Jaipersad, A.S., Lip, G.Y., Silverman, S., Shantsila, E. The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 2014; 63(1): 1-11. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2013.09.019.
8. Gomez, D., Owens, G.K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 2012; 95(2): 156-164. https://doi.org/10.1093/cvr/ cvs115.
9. Sukhovershin RA, Toledano Furman NE, Tasciotti E, Trachtenberg BH. Local inhibition of macrophage and smooth muscle cell proliferation to suppress plaque progression. Methodist DeBakey Cardiovascular Journal. 2016; 12 (3): 141-145. https://doi.org/10.14797/mdcj-12-3-141.
10. Marx, S.O., Totary-Jain, H., Marks, A.R. Vascular smooth muscle cell proliferation in restenosis. Circulation: Cardiovascular Intervention. 2011; 4(1): 104-111. https://doi.org/10.1161/CIRCINTERVENTI0NS.110.957332.
11. Allahverdian, S., Chehroudi, A.C., McManus, B.M., Abraham, T.,
Francis, G.A. Contribution of intimal smooth muscle cells to cholesterol accumulation and macrophage-like cells in human atherosclerosis. Circulation. 2014; 129(15): 1551-1559. https://doi.org/10.1161/CIRCULATI0NAHA.113.005015.
12. Van der Veken, B., De Meyer, G.R., Martinet, W. Intraplaque neovascularization as a novel therapeutic target in advanced atherosclerosis. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 2016; 20(10): 1247-57. https://doi.org/10.1080/14728222. 2016.1186650.
13. O'Brien, K.D., Hippe, D.S., Chen, H., Neradilek, M.B., Probstfield, J.L., Peck, S., Isquith, D.A., Canton, G., Yuan, C., Polissar, N.L., Zhao, X.Q., Ke-rwin, W.S. Longer duration of statin therapy is associated with decreased carotid plaque vascularity by magnetic resonance imaging. Atherosclerosis. 2016; 245: 74-81.https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2015.11.032.
14. Koole, D., Heyligers, J., Moll, F.L., Pasterkamp, G. Intraplaque neovasculari-zation and hemorrhage: markers for cardiovascular risk stratification and therapeutic monitoring. Journal of Cardiovascular Medicine. 2012; 13(10): 635-9. https://doi. org/10.2459/JCM.0b013e3283590cd2.
15. Тодоров, С.С. Патоморфологические изменения аорты при врожденных заболеваниях сердечно-сосудистой системы у детей первого полугодия жизни. Дис. д-ра мед.наук. Новосибирск, 2011.
16. Мурадов, М.М., Молочков, А.В., Иванова, А.Г. и др. / Особенности морфологии внутренней грудной артерии у пациентов с ИБС разных возрастных групп //Вестник национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирого-ва. - 2015. - №4. - С. 13-18.
17. Тодоров, С.С., Сидоров, Р.В., Щетко, В.Н., Шлык, И.Ф., Поспелов, Д.Ю.
Роль клеточно-межклеточных взаимоотношений в развитии интимальной гиперплазии внутренней грудной артерии //Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова 2017. - Т. 12. - № 3. - С. 70-72.
Литература
1. Usman, A., Ribbatti, D., Sadat, U., Gillard, J.H. From lipid retention to immune-mediate inflammation and associated angiogenesis in the pathogenesis of atherosclerosis. Journal of Atheroscler Thromb. 2015; 22(8): 739-749. https://doi. org/10.5551/jat.30460.
2. Chistiakov, D.A., Orekhov, A.N., Bbryshev, Y.N. Contribution of neovascularization and intraplaque haemorrhage to atherosclerotic plaque progression and instability. Acta Phisiologica.2015;213(3):539-53.https://doi.org/10.1111/apha.12438.
3. VanHinsbergh, V.W., Eringa, E.C., Daemen, M.J. Neovascularization of the atherosclerotic plaque: interplay between atherosclerotic lesion, adventitia-derived microvessels and perivascular fat. Current Opinion Lipidology. 2015; 26(5): 405-411. https://doi.org/10.1097/MOL.0000000000000210.
4. Tabas, I., Bornfeldt, K.E. Macrophage phenotype and function in different stages of atherosclerosis. Circulation Research. 2016; 118(4): 653-667. https://doi. org/10.1161/CIRCRESAHA.115/306256.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
344022, г. Ростов-на-Дону, Россия, пер. Нахичеванский, 29
