CC BY
47
Роль гепатоцитарного фактора роста
в регенерации и патогенезе осложнений
после трансплантации печени
Резюме. При изучении вклада гепатоцитарного фактора роста (HGF) в развитие иммунореактивности было установлено, что данные цитокины являются важным промежуточным звеном между повреждением печеночной паренхимы, вызванным различными физическими, химическими и биологическими факторами (в том числе во время ишемически-реперфузионного повреждения), и последующей активацией клеточного компонента иммунного ответа после трансплантации печени. Ключевые слова: гепатоцитарный фактор роста, ранняя дисфункция трансплантата, мезенхимальные стволовые клетки.
В основе ранней дисфункции трансплантата (РДТ) лежит ряд факторов. Традиционно их разделяют на донорские (кондиционирование и качество трансплантата), технические (время ишемии) и реципиента (тяжесть его состояния и ургент-ность трансплантации печени (ТП)). Ишемически-ре-перфузионные повреждения (ИРП) вносят основной вклад в риск РДТ [1-4].
В общепринятой модели РДТ не принимаются во внимание вообще или только косвенно ссылаются на потенциал регенерации печени [5, 8].
Известно, что этот процесс возможен за счет собственно гепатоцитов, прогениторных и внепеченоч-ных прогениторных клеток и гуморальных стимулов. На основании экспериментальных моделей показано, что преимущественным источником регенерации ге-патоцитарного клеточного пула печени являются сами гепатоциты. Существует две теории регенерации печени - праймирования и первичного митогенеза, в реальности оба эти механизма перекрещиваются [6, 7].
Гепатоцитарный фактор роста (ЫОБ) контролирует рост печени в период эмбриогенеза и отвечает за ее
регенерацию, дифференцировку гепатоцитов, эпителия желчных протоков и синусоидальных эндотели-альных клеток у взрослых [8].
Выделенный из плазмы крови человека ЫОБ представляет собой гепаринсвязывающий гетеро-димерный гликопротеин, состоящий из тяжелой (а-альфа) и легкой ф-бета) цепей с молекулярными массами от 58 до 69 кДа и от 30 до 34 кДа соответственно [9-11]. ЫОБ синтезируется в виде предшественника (про-ЫОБ) молекулы и это является преобладающей формой, с помощью которой гепато-цитарный фактор роста присутствует в клеточном матриксе большинства тканей [12].
Фактор роста гепатоцитов, первоначально идентифицированный как сильный митоген для зрелых гепатоцитов, необходим не только во время развития печени [13], но и после острого и хронического повреждения органа [14-16]. Активация ЫОБ индуцирует различные клеточные реакции, включая пролиферацию, дифференцировку и деградацию внеклеточного матрикса (ЕСМ) [17-19]. Все эти виды биологической активности - часть уникальной С-Ме1:-активированной морфогенной реакции, известной как «инвазивный рост», которая работает во время нормального развития и регенерации, но также имеет злокачественный аналог, отвечающий за появление рака и метастазирование [20-24].
Мы выдвигаем гипотезу о роли ЫОБ в патогенезе ранней дисфункции трансплантата печени как защитного фактора при ИРП: сильнее выраженный регенераторный стимул (большее содержание ЫОБ) ассоциирован с более благоприятным клиническим исходом. Есть предположение, что ЫОБ индуцирует ранний переход от альбумин-негативных стволовых клеток к альбумин-позитивным клеткам-предшественницам печени, напоминающим гепатобласты.
Трансплантология
Целью исследования стало изучение влияния HGF на культуру изолированных клеток печени in vitro и оценка его роли в процессе гепатогенной дифферен-цировки мезенхимальных стволовых клеток, а также оценка взаимосвязи между интраоперационным уровнем HGF в воротной вене и возникновением и выраженностью РДТ после трансплантации печени.
Было обработано 15 образцов печени, полученных в процессе мультиорганного забора, и 5 образцов после операции по резекции фрагмента печени, а также проведен протокол дифференцировки мезенхималь-ных стволовых клеток в гепатогенном направлении на 20 культурах.
Изоляцию гепатоцитов из донорской печени осуществляли путем 3-ступенчатой перфузии органа и обработки ферментативным раствором с последующей механической экстракцией. Все растворы нагревали до 37 °С. Во фрагмент печени по предварительно заканюлированным сосудам вводили 500 мл раствора для перфузии 1, состоящего из раствора Хэнкса и 250 ммоль EDTA. Далее осуществляли введение 500 мл раствора Хэнкса (раствор для перфузии 2) и обработку перфузионным раствором 3, содержащим 0,5 г коллагеназы II или IV типа (растворяется в DMEM-F12). Фрагмент печени выдерживали 30 мин в растворе для перфузии 3 при постоянном перемешивании на шейкере при 37 °С, после чего фермент нейтрализовали раствором BME c 10% человеческого альбумина, охлажденным до 4 °С. Обработанную коллагеназой ткань измельчали на мелкие куски путем механической гомогенизации скальпелем, после чего пропускали дважды через слой стерильной марли. Полученную клеточную суспензию центрифугировали в течение 4 мин при 50 об/мин при 4 °C. Супернатант собирали и клеточный осадок ресуспендировали в 50 мл охлажденной среды для отмывки. Процедуру центрифугирования повторяли. Осадок ресуспендировали в 5-10 мл среды для культивирования гепатоцитов. Подсчет клеток и определение их жизнеспособности производили по стандартной методике по исключению трипано-вого синего.
Для гепатогенной дифференцировки мезенхи-мальные стволовые клетки, находящиеся на втором пассаже, высевались в культуральные флаконы в количестве 5х103 клеток на см2 и культивировались до достижения 70-80% конфлюэнтности. После этого в додифференцировочный период в культу-ральную среду IMDM (Германия), не содержащую сыворотки, добавляли 20 нг/мл EGF (эпителиальный фактор роста, «Invitrogen Corp», США), 10 нг/мл bFGF (основной фактор роста фибробластов, Германия) и 1% антибиотика для остановки процесса пролиферации. Далее следовал 2-этапный протокол
дифференцировки. На первом этапе гепатогенная дифференцировка стимулировалась средой IMDM без сыворотки, дополненной 20 нг/мл HGF, 10 нг/мл bFGF, никотинамидом 4,9 ммоль/л и 1% антибиотика. В таких условиях клетки культивировались в течение 7 дней. На втором этапе бессывороточная диф-ференцировочная среда IMDM содержала 20 нг/мл OMS (онкостатин М, Германия), 1 нг/л дексаметазо-на («Sigma-Aldrich», Германия), 10 нг/мл ITS-premix (100 нг/л инсулина, 6,25 нг/мл трансферина, 3,6 нг/л селеновой кислоты, 1,25 нг/мл BSA и 190 нг/л линоле-вой кислоты) (США) и 1% антибиотика. Культивирование продолжалась 14 дней с заменой среды каждые 2-3 дня [29]. Факт гепатогенной дифференцировки подтверждался морфологически, методом проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции в реальном времени (PCR-RT).
Определение уровня белков печени человека проводили методом мультиплексного анализа на приборе Luminex по заранее разработанной методике.
Для изучения взаимосвязи указанного фактора роста с клиническими исходами после трансплантации печени было проведено проспективное клиническое исследование случай-контроль у 80 реципиентов, перенесших трансплантацию печени от доноров со смертью мозга. Период исследования: январь 2014 г. - декабрь 2015 г. Критериями включения явились: трансплантация печени от умершего донора со стандартными критериями (уровень аспар-татаминотрансферазы и аланинаминотрансфера-зы - менее 200, жировой гепатоз - менее 40%, уровень натрия - до 165 мкмоль/л, возраст - до 60 лет, применение вазопрессоров допускалось). Критерии исключения: трансплантация печени от родственного донора, редуцированный графт, возраст реципиента менее 18 лет. Основанием для включения в проспективное сплошное исследование случай-контроль были заключение консилиума о необходимости трансплантации печени и согласие реципиентов на участие в исследовании. Всем этим пациентам пересадка печени выполнялась от доноров со смертью головного мозга и бьющимся сердцем.
Дизайн исследования был направлен на выявление ассоциаций между клиническими исходами (ранняя дисфункция трансплантата, острое отторжение трансплантата, билиарные и инфекционные осложнения) и серологическим предиктором (HGF). На этапе выполнения трансплантации печени делали забор пробы крови (3 мл) из воротной вены через 2 часа после портальной реперфузии для определения концентрации HGF при помощи мультиплексного иммуно-анализа на приборе Luminex 200.
Наличие осложнений после трансплантации печени регистрировали по общепринятым критериям [1-3].
Рис.1. Уровень секреции HGF
Рис. 2. Изменение морфологии МСК
При определении уровня секреции гепатоцитар-ного фактора роста in vitro в образцах, полученных путем дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в гепатогенном направлении, были установлены статистически значимые различия между образцами МСК второго пассажа и дифференцированными в гепатогенном направлении клетками по концентрации HGF (0,25 (0,20; 0,40) по сравнению с 0,37 (0,26; 0,85) нг/мл, р=0,047) (рис. 1). Данный факт говорит о том, что полученные путем направленной дифференцировки клетки секретируют HGF и в совокупности с изменением морфологических и иммунофенотипических характеристик в процессе культивирования HGF индуцируют ранний переход от альбумин-негативных стволовых клеток к альбумин-позитивным клеткам-предшественницам печени, напоминающим гепатобласты (рис. 2).
Это явилось обоснованием для дальнейшего изучения гепатоцитарного фактора роста как индуктора регенерации у пациентов, перенесших ортотопи-ческую ТП.
По результатам клинического раздела исследования было установлено, что общая частота развития РДТ в группе пациентов составила 21,2% (17 из 80), общая частота острого отторжения трансплантата - 15% (12 из 80), билиарных осложнений - 18,8% (15 из 60), послеоперационная летальность - 6,3% (5 из 80).
Значимых ассоциаций между уровнем гепатоцитар-ного фактора роста и острым отторжением, били-арными и инфекционными осложнениями, летальным исходом не обнаружено. Но высокая концентрация гепатоцитарного фактора роста ассоциирована с большей частотой РДТ печени, а уровень HGF в ин-траоперационной пробе (взятой через 2 часа после ре-перфузии из воротной вены) - более 7934 нг/мл (чувствительность - 62%; специфичность - 74%, AUC=0.73; p=0.01) достоверно прогнозировал риск развития ранней дисфункции трансплантата. Таким образом, мы вынуждены опровергнуть выдвинутую в начале исследования гипотезу о протективной роли гепатоци-тарного фактора роста в отношении функции печени после трансплантации и констатировать, что его уровень пропорционален повреждению в результате ИРП, но не ассоциирован с меньшей выраженностью РДТ. То есть данный цитокин, измеренный в системе портального кровотока, является маркером клеточного повреждения, и его биологический регенераторный потенциал не имеет клинического значения, по крайней мере в этой однофакторной модели. СИ
Стаья поступила в редакцию 01.06.2016 г.
А.А. Коритко, Д.Ю. Ефимов, С.В. Коротков, С.И. Кривенко, А.Е. Щерба, О.О. Руммо
РНПЦ трансплантации органов и тканей
на базе 9-й городской клинической больницы, Минск
Summary
It has been shown that and hepatocyte growth factor (HGF) plays an important role in immune response, liver injury and regeneration following liver transplantation (LT).
Литература
1. Rez'a Saídí, Seyed Kamran Hejazi Kenan. Liver Ischemía/Reperfusíon Injury: an Overview // J. Invest. Surg. Early Online. 2014. P. 1-14.
2. Paul J. Chestovich et al. IL-22: Implications for Liver Ischemía/Reperfusíon Injury // Transplantation. 2012. Vol. 93. N5. P. 485-492. // doi:10.1097/TP.0b013e3182449136.
3. OlthoffK. M.et al. Validation of a current definition of early allograft dysfunction inliver transplant recipients and analysis of risk factors // Liver Transplantation. 2010. Vol. N16. P. 943-949.
4. Duncan A. W., Dorrell C., Grompe M. Stems cells and liver regeneration // Gastroenterology. 2009. Vol. 137, N2. P. 466-481. // http://dx.doi.org/10.1053/j-.gastro.2009.05044.
5. Suárez-Causado A. et al. HGF/c-Met signaling promotes liver progenitor cell migration and invasion by an epithelial - mesenchymal transition-independent, phosphatidyl // Biochim. Biophys. Acta. 2015. http:// dx.doí.org/10.1016/j.bba mcr.2015.05.017.
6. Erker L., Grompe M., Signaling networks in hepatic oval cell activation // Stem. Cell. Res. 2007. N2. P. 90-102. // http://dx.doi.org/10.1016/j-.scr.2008.01.002.
7. Sánchez A., Fabregat I., Growth factor- and cytokine-driven pathways governing liver stemness and differentiation // World J. Gastroenterol. 2010. Vol. 16, N41. P. 5148-5161. http://dx.doi.org/10.3748/wjg. v16.i41.5148.
8. Michalopoulos G. K., DeFrances M. Liver regeneration // Science. 1997. N276. P. 60-71.
9. Nakamura T., Nawa K., Ichihara A. et al. Subunit structure of hepatocyte growth factor from rat platelets // FEBS Lett. 1987. N224. P. 311-318.
10. Gohda E., Tsubouchi H., Nakayama H. et al. Partial purification and characterization of hepatocyte growth factor from plasma of patients with fulminant hepatic failure // J. Clin Invest. 1988. N81. P. 414-419.
Полный список литературы размещен на сайте ff See: http://innosfera.by/2016/08/hepatocyte_factor
