CC BY
47
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 577.152.1
РОЛЬ ГЕНОВ luxCDE В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БАКТЕРИЙ
B.C. Данилов, Г.Б. Завильгельский, А.П. Зарубина, М.М. Мажуль
(кафедра микробиологии биологического факультета МГУ,
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИ генетика";
e-mail:vsdanil@mail.ru)
Введение
В настоящее время общепризнано мнение, согласно которому источником одного из субстратов бактериальной люциферы являются альдегиды, образованные в результате восстановления жирных кислот до алифатических альдегидов с помощью комплекса редуктазы жирных кислот (РЖК). Исследование генного аппарата люминесцентных бактерий показало, что эффективное свечение клеток обеспечивается наличием в геноме 5 структурных генов luxCDABE lux-оперона (полный lux-оперон). Гены luxA и luxB кодируют а- и Р-субъедини-цы люциферазы, а гены luxCDE, предположительно, кодируют комплекс РЖК — редуктазу, син-тетазу и трансферазу (Meighen, 1991; Chatterjee, Meighen, 1995). Вместе с тем известно, что образование длинноцепочечных альдегидов может идти иными путями, на других биологических системах они изучены более детально. Это могут быть неферментативное и ферментативное перекисное окисление липидов, дегидрогеназная, оксигеназная и др. реакции (Владимиров, Арчаков, 1972; Gun-salus et al., 1975; Eichhorn et al., 1999; Hastings, Johnson, 2003; Niki et al., 2005). К сожалению, эти пути исследованы на бактериях мало. Но тем не менее по люминесцентным бактериям имеются отдельные работы, свидетельствующие об образовании длинноцепочечных альдегидных субстратов путем перекисного окисления липидов (Исмаилов и др., 1994a, б). Поэтому есть сомнения относительно исключительности функции РЖК в синтезе алифатических альдегидов в бактериальных клетках.
Задача данного исследования — выяснение справедливости наших сомнений относительно образования альдегидного фактора, существенного для свечения клеток, только благодаря функционированию комплекса РЖК. В настоящей работе сравнивали интенсивность свечения интактных клеток "дикого" штамма Vibrio fischeri и рекомбинантно-го штамма Escherichia coli К12 TG1, содержащего как полный lux-оперон, так и исключительно гены luxAB.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования являлись: Vibrio fischeri 6 МГУ, Escherichia coli К12 TG1 (pF1) (содержит структурные гены полного CDABE lux-оперона V. fischeri 6 МГУ), E. coli К12 TG1 (pF2) (содержит структурные гены luxAB полного lux-оперона V. fischeri 6 МГУ) и штамм-хозяин — E. coli К12 TG1 (Чернова, Завильгельский, 1991; Данилов и др., 2002).
Бактерии V. fischeri выращивали на среде Фар-гали на качалке (200 об/мин) при 25° до достижения максимума люминесценции. E. coli, E. coli (pF1) и E. coli (pF2) засевали на среду LB и выращивали на качалке (200 об/мин) при 30° также до достижения максимума люминесценции. Для E. coli (pF1) и E. coli (pF2) в среду LB добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Число бактерий определяли нефелометрически при 590 нм, рассчитывая по предварительно построенной калибровочной кривой. Клетки бактерий осаждали центрифугированием на центрифуге Beckman с ротором JA-20 при 6000g в течение 10 мин. Осадок бактерий V. fischeri и E. coli ресуспендировали соответственно в 2%-м водном растворе NaCl и в физиологическом растворе. Клеточные лизаты объемом по 5—7 мл получали путем разрушения бактериальных клеток в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0 в бюк-сах, помещенных в водяную баню со льдом, с помощью ультразвукового дезинтегратора УДЗН-1 при частоте 44 кГц по 5 с в шестикратной повторности с перерывами на охлаждение по 30 с. Измерение интенсивности биолюминесценции проводили на люминометре 1251 BioOrbit. Интенсивность измеренного свечения бактерий выражали в милливольтах на 108 клеток в 1 мл суспензии или в милливольтах на 1 мг белка в лизатах. Концентрацию белка определяли по методике Брэдфорд (Bradford, 1976). Реактивы: флавинмононуклеотид, n-деканаль, n-тетрадеканаль, дитионит (фирма "Sigma"), реактивы питательных сред (фирма "Difko"), а также отечественные реактивы марки х.ч. и ч.д.а.
Результаты и их обсуждение
Структурные гены lux-оперона различных видов люминесцентных бактерий были клонированы
под соответствующими промоторами во многие организмы, как в прокариоты, так и в эукариоты (Kirchner et al., 1989). Созданные генно-инженерные организмы, в том числе и E. coli, содержащие только гены luxAB, кодирующие белки а- и ß-субъ-единиц люциферазы, для эмиссии света нуждаются в добавлении к ним длинноцепочечного альдегида. Рекомбинантные организмы, содержащие полный lux-оперон, без добавки альдегида интенсивно светят, предположительно за счет функционирования комплекса РЖК (Chatterjee, Meighen, 1995) (рисунок).
В предлагаемом исследовании сравнивали интенсивность свечения клеток V. fischeri и E. coli (pF1) (рекомбинантный штамм, содержащий полный lux-оперон) со свечением клеток рекомби-нантного штамма E. coli (pF2), содержащих только гены luxAB. Яркое свечение интактных клеток V. fischeri и E. coli (pF1) со всей очевидностью отражает поведение нормальной биолюминесцентной системы. В то же время мы наблюдали очень низкую (на четыре порядка меньше) интенсивность свечения клеток рекомбинантного штамма E. coli (pF2) по сравнению с V. fischeri и E. coli (pF1) (табл. 1). Объяснить это недостаточным содержанием люциферазы и восстановленного ФМН в клетках E. coli (pF2) нельзя, поскольку добавление альдегидов к суспензии клеток приводило к практически мгновенному увеличению интенсивности свечения, по величине сопоставимому со свечением "дикого" штамма морских люминесцентных бактерий, т.е. порядка клеток. Интенсивность свечения клеток E. coli (pF2), содержащих только гены luxAB, чрезвычайно низкая, и логично предположить, что в этих клетках практически нет длин-ноцепочечных альдегидов, поскольку в них не были перенесены гены luxCDE.. Отсюда следует вывод, что основной путь синтеза длинноцепочечных альдегидов идет через РЖК, тогда как остальные
Таблица 1
Биолюминесцентная активность нативных клеток и их лизатов различных бактерий
Исследуемые бактерии V. fischeri E. coli (pF2) E. coli (pF1)
Свечение нативных клеток, мв /108 клеток 3,2 х 104 3,0 2,8 х 104
Содержание белка в ли-затах, мг/мл 5,6 5,4 5,4
Удельное свечение (мв/мг белка) лизатов без добавки экзогенных альдегидов 7,0 185 446
Удельное свечение (мв/мг белка) лизатов при добавке деканаля (6,4 х 10-5 М) 8670 89 900 не измеряли
Удельное свечение (мв/мг белка) лизатов при добавке тетрадека-наля (10-5 М) 3559 98 886 не измеряли
пути дают лишь незначительный вклад в их синтез. Это полностью соответствует литературным данным, полученным как на "диких" штаммах люминесцентных бактерий, так и на рекомбинантных, согласно феноменологическим наблюдениям (СИа^ 1ефе, Ме1£Иеи, 1995). Но очевидно, что соединения, которые могут служить субстратами люциферазы, могут синтезироваться помимо участия редуктаз-ного комплекса. Они обязательно присутствуют в бактериальных клетках. Другой вопрос, что их концентрация может быть недостаточной для видимого свечения. Для проверки этого предположения мы провели исследование с нашими объектами и столкнулись с фактом, ранее не описанным в литературе, поскольку предыдущие исследователи останавливались на экспериментах клеточного уровня, а мы пошли дальше, перейдя на изучение лизатов.
Взаимосвязь lux генов и соответствующих белков с реакцией бактериальной биолюминесценции (Chatterjee, Meighen, 1995)
Были проведены измерения интенсивности биолюминесценции в лизатах из клеток E. coli (pF2) и сопоставление с таковыми в лизатах из V. fischeri и E. coli (pF1). Результаты опытов по измерению интенсивности биолюминесцентной активности лиза-тов приведены в табл. 1, в которой каждое значение — это среднее значение свечения из пяти культивирований бактерий V. fischeri и E. coli (pF2). Величина удельной интенсивности свечения лиза-та из E. coli (pF2) не меньше таковой из V. fischeri и E. coli (pF1), что однозначно указывает на наличие в лизатах E. coli (pF2) альдегидов. Тот факт, что интенсивность свечения лизатов из E. coli (pF1) и E. coli (pF2) превышает таковое из V. fischeri, вероятно, можно объяснить разными клетками-хозяевами. Общая светопродукция лизатов во всех штаммах свидетельствует о том, что содержание всех компонентов люциферазной реакции в клетках должно быть достаточным для яркого свечения клеток E. coli (pF2). Так, удельное свечение лизата V. fischeri 7 мв/мг белка соответствует интенсивности свечения целых клеток 3,2 х 104 мв /108 клеток, а удельное свечение лизата E. coli (pF2) 185 мв/мг белка соответствует лишь 3 мв/108 клеток E. coli (pF2) (табл. 1). Почему же при достаточном количестве альдегидов в клетках E. coli (pF2), необходимом для биолюминесценции, они практически не светят, не является ли это следствием методических ошибок при получении лизата? Неоднократное получение лизатов из E. coli (pF2) и сравнение удельной интенсивности их свечения с удельной интенсивностью свечения из V. fischeri свидетельствует в пользу того, что полученные нами результаты скорее всего не являются артефактом. Предположение о том, что альдегиды могли появиться в результате каких-то методических ошибок при получении лизатов, маловероятно, поскольку мы проводили обработку ультразвуком во льду, и по времени вся процедура от его получения до измерения свечения занимала несколько минут. Получение было идентичным как для штаммов, содержащих гены luxCDE (V fischeri и E. coli (pF1)), так и лишенных их (E. coli (pF2)).
Мы не вправе полностью исключить наличие в лизатах окислительных процессов, в том числе перекисного окисления, в результате чего во время их приготовления могли образовываться альдегиды, но тот факт, что при их хранении из всех штаммов (от десятков минут до нескольких часов) на холоде или при комнатной температуре практически не происходило изменения интенсивности свечения, свидетельствует о том, что роль окислительных процессов в образовании алифатических альдегидов С8-С18 за время их приготовления невелика. В качестве примера приведем табл. 2. Измерение интенсивности свечения, независимо от температуры инкубации, проводили при 26°.
Таблица 2
Зависимость интенсивности свечения (мв/мг) лизата клеток E. coli (pF2) от времени, прошедшего с его получения, и температуры инкубации
Время Температура, °С
26° 4°
0 мин 200 200
15 мин 230 236
30 мин 181 296
2 ч 115 286
3 ч 70 177
Следовательно, данные, полученные нами на лизатах из E. coli (F2), содержащих только гены luxA и luxB, не являются результатом методических ошибок. Поэтому можно сделать предположение, что роль генов luxCDE другая, нежели обеспечение бактериальных клеток алифатическими альдегидами, свободно диффундирующими в их пределах. Но несомненно, что комплекс белков, кодируемый генами luxCDE (или их частью), необходим для интенсивного свечения клеток, поскольку в их отсутствии in vivo свечение практически не наблюдается.
Анализируя данные литературы, мы убедились, что существуют мутанты бактерий, содержащие гены luxCDE, но биолюминесценция их клеток очень сходна с E. coli (F2). Ранее полученные альдегидза-висимые (AS) мутанты (Nealson, Markovitz, 1970) можно считать по биолюминесцентным параметрам аналогами рекомбинантного штамма E. coli (pF2). Эти мутанты практически не светят без добавления альдегида. Однако, как и у рекомбинантного штамма E. coli (pF2), имеет место сопоставимая интенсивность свечения лизата из этих мутантов со свечением такового из "дикого" штамма, что свидетельствует о наличии эндогенного альдегида (Lee et al., 1974). Данный пример подтверждает, что само по себе наличие генов luxCDE, независимо от их функций, не обеспечивает яркое свечение бактериальных клеток, нужна их активная экспрессия. Скорее всего, у таких бактерий экспрессия этих генов каким-то образом блокирована, вследствие чего яркое свечение клеток не наблюдается. Возможно, одна из причин чрезвычайно низкой интенсивности свечения в клетках E. coli (pF2) — ингибирование активности бактериальной люцифе-разы. Известно, что практически все гидрофобные соединения оказывают ингибирующее действие как на саму люциферазу, так и на биолюминесценцию целых клеток (Данилов, Егоров, 1990). Не вызывает сомнения наличие у E. coli (pF2) ингибиторов активности люциферазы гидрофобной природы, поскольку метаболизм липидов предполагает наличие таких соединений. Но это должен быть гипер-
синтез таких соединений, поскольку весьма трудно полностью подавить свечение бактериальных клеток. Добавление к целым клеткам алифатических альдегидов снимает ингибирование. Подобную картину можно наблюдать, если мы потушим свечение клеток "диких" штаммов люминесцентных бактерий, например, фенобарбиталом или камфарой (Высоцкий и др., 1981; Исмаилов и др., 1981). Добавление длинноцепочечных альдегидов снимает это ингибирование. Обработанные различными гидрофобными соединениями бактериальные клетки становятся аналогами "альдегидных" мутантов (Высоцкий и др., 1981), хотя они содержат гены luxCDE. Отсюда можно сделать вывод, что у бактерий, содержащих гены luxCDE, роль белков, экспрессиро-ванных на них, может сводиться к снятию эффекта некоего гипотетического ингибитора за счет, например, гидроксилирования природного ингибитора. Однако если бы это было так, то, во-первых, должна была бы иметь место продукция этого природного гидрофобного ингибитора до концентрации порядка 10-4—10-3 М, чтобы практически полностью погасить свечение бактериальных клеток, а, во-вторых, свечение лизатов из E. coli (pF1) и "дикого" штамма V. fischeri было бы несоизмеримо выше, чем у E. coli (pF2), поскольку они содержат гены luxCDE. Поэтому предположение о том, что очень низкое свечение у целых клеток E. coli (pF2) связано с действием какого-то гидрофобного соединения, обладающего ингибиторными свойствами, кажется нам маловероятным. Если отбросить предположение о присутствии в клетках E. coli (pF2) ингибитора, то альдегиды, а их наличие в клетках не вызывает сомнений, должны проявлять себя. Источником альдегидов в какой-то степени может быть пул жирных кислот. Но он настолько мал, что может обеспечить лишь очень низкое свечение, вероятно, как раз такое, которое мы наблюдаем в клетках E. coli (pF2). Собственно поэтому функция комплекса РЖК как мощной помпы, осуществляющей накачку бактериальной клетки альдегидами, была предложена авторами общепринятой схемы (см. рисунок) (Chatterjee, Meighen, 1995). Однако получается несоответствие: с одной стороны, функция люциферазы — это окисление токсичных для клеток альдегидов до жирных кислот, а с другой — комплекс РЖК, вновь поставляющий клеткам токсичные альдегиды, да еще с расходованием восстановительных эквивалентов клеток.
Объяснением того факта, что клетки рекомби-нантного штамма E. coli (pF2) имеют очень низкое свечение, а при их разрушении интенсивность свечения лизатов не меньше, чем свечение лизатов из "дикого" штамма светящихся бактерий, может служить пространственное разобщение в них люцифе-разы и альдегидов. Общепринятый субстрат, т.е. свободные жирные альдегиды, не может объяснить такого разобщения, поскольку они практически бес-
препятственно диффундируют как снаружи внутрь (напомним, что добавление альдегидов к суспензии клеток приводило к практически мгновенному увеличению интенсивности их свечения), так и внутри клетки, согласно физическому закону скорости диффузии (второй закон Фика). Имеются некоторые различия скорости диффузии в зависимости от длины углеродной цепи альдегидов и их концентрации, однако они столь незначительны, что не могут повлиять на ситуацию в клетке в целом (Мар-гания и др., 1989). Если бы длинноцепочечные альдегиды присутствовали в достаточной концентрации в клетках, это не замедлило бы сказаться на их свечении. Общепризнано, как мы писали выше, субстратами люциферазы служат алифатические альдегиды С8—С18, а природным считается С14 (миристиновый) альдегид (Данилов, Егоров, 1990). Однако в литературе до сих пор употребляется более неопределенный термин — альдегидный фактор. Тем самым исследователи, вероятно, предполагают существование и других альдегидных субстратов люциферазы. Этим альдегидным фактором, по нашему мнению, могут быть жирнокислот-ные остатки фосфолипидов, имеющие по С-концу карбонильные группы. Заметим, что тесная связь люциферазы из морских люминесцентных бактерий, являющейся монооксигеназой, с фосфолипи-дами была показана ранее (Ганшин и др., 1990). В люминесцентных бактериях обнаружены фос-фатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, кардио-липин, лизокардиолипин и др. (Lennarsz, 1970). В клетках жирнокислотные остатки фосфолипидов могут подвергаться окислительным реакциям с образованием различных соединений, в том числе и алифатических альдегидов (Ou et al., 1995; Hayas-hi et al., 2004). К сожалению, окисление фосфо-липидов в бактериях изучено пока недостаточно. В клетках, содержащих полный lux-оперон, функцию обеспечения альдегидным фактором люцифе-разы выполняют именно белки, кодируемые генами luxCDE, но такое обеспечение может осуществляться через взаимодействие этих белков с фосфоли-пидным окружением люциферазы, вследствие чего образуется доступный люциферазе альдегидный субстрат. В случае с E. coli (pF2) ранее недоступный альдегидный субстрат, находящийся в мембранах, приобрел доступность для люциферазы в результате разрушения бактериальных клеток, благодаря чему мы наблюдаем высокую интенсивность свечения их лизатов.
Таким образом, ясно, что наличие генов luxCDE необходимо для проявления феномена яркого свечения, но эти гены скорее всего не ответственны за синтез белков, обеспечивающих клетки люминесцентных бактерий альдегидным субстратом по предложенной Мейгеном схеме (Chatterjee, Meighen, 1995), т.е. через комплекс редуктазы жирных кислот. Логическим выводом из данных, приведенных
нами, является предположение о том, что функция белков, кодируемых генами luxCDE, состоит в обеспечении люциферазы альдегидным субстратом,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. 1972. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. 236 с.
Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Меже-викин В.В. 1981. Влияние фенобарбитала на люминесцентную систему светящихся бактерий // Микробиология. 50. № 6. 985-991.
Ганшин В.М., Исмаилов А.Д., Данилов В. С. 1990. Действие фосфолипаз на биолюминесцентную активность люциферазы светляков и бактериальной люциферазы // Биохимия. 55. Вып. 2. 285—291.
Данилов В.С., Егоров Н.С. 1990. Бактериальная биолюминесценция. М. 152 с.
Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошни-ков Г.Е., Соловьева Л.Н., Карташев Ф.В., Завильгельский Г.Б. 2002. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 3. 20—24.
Исмаилов А.Д.,. Баранова Н.А, Данилов В.С., Егоров Н.С. 1981. Ингибирование бактериальной люминесценции субстратами цитохрома Р-450 // Биохимия. 48. Вып. 2. 234—239.
Исмаилов А.Д., Берия Л.В., Данилов В. С. 1994а. Ферментативный и неферментативный процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi // Микробиология. 63. 466—471.
Исмаилов А.Д., Берия Л.В., Данилов В. С. 1994б. Образование альдегидного субстрата бактериальной люциферазы в ходе индуцированного ультрафиолетовым светом перекисного окисления липи-дов // Биохимия. 59. Вып. 4. 519—524.
Маргания В.А., Малков Ю.А., Данилов В. С. 1989. Исследование эффективности проникновения длинноцепочечных альдегидов через бактериальную мембрану // Биол. науки. 4. 79—84.
Чернова Т.А., Завильгельский Г.Б. 1991. Клонирование генов lux-регулона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli // Биотехнология. № 3. 17—18.
Bradford M.M. 1976. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Ann. Biochem. 72. 248—254.
представленным фосфолипидами со связанными с ними окисленными до карбонильных групп жир-нокислотными остатками.
Chatterjee J., Meighen E . A . 1995. Biotech-nological application of bioluminescence (lux) genes // Pho-tochem. Photobiol. 62. N 4. 641—650.
Eichhorn E., van der Ploeg J.R., Lei-singer T. 1999. Characterization of a two-component alkanesulfonate monooxygenase from Escherichia coli // J. Biol. Chem. 274. N 38. 26639—26646.
Gunsalus I.C., Pederson T.C., Sligar S.G. 1975. Oxygenase-catalysed biological hydroxylations // Ann. Rev. Biochem. 44. 377—388.
Hastings J.W., Johnson C.H. 2003. Bioluminescence and chemiluminescence // Methods Enzymol. 360. 75—104.
Hayashi T., Uchida K., Takebe G., Ta-k a h a s h i K . 2004. Rapid formation of 4-hydroxy-2-no-nenal, malondialdehyde, and phosphatidylcholine aldehyde from phospholipid hydroperoxide by hemoproteins // Free Radic Biol. Med. 36. N 8. 1025—1033.
Kirchner G., Roberts J.L., Gustaf-son G.D. 1989. Active bacterial luciferase from a fused gene: expression of a translation fusion in bacteria, yeast and plant cells // Gene. 81. 349—354.
Lee J., Murphy C.L., Fainy G.J., Bau-c o n T . L . 1974. Bacterial bioluminescence and its aplica-tion to analytical procedur // Liquid scintillation counting. Recent development. New York. P. 403—420.
Lennarsz W.J. 1970. Bacterial lipids // Lipids metabolism. New York; London. P. 155—184.
Meighen E.A. 1991. Molecular biology of bacterial bioluminescence // Micr. Rev. 55. N 1. 123—142.
Nealson K.H., Markovitz A. 1970. Mutant analisis and enzyme subunit complementation in bacterial bioluminescence in Photobacterium fischeri //J. Bacteriol. 104. N 1. 300—312.
Niki E., Yoshida Y., Saito Y, Nogu-c h i N . 2005. Lipid peroxidation: Mechanisms, inhibition, and biological effects // Biochem. Biophys. Res. Commun. 338. N 1. 668—676.
Ou Z., Ogamo A., Guo L., Konda Y., Harigaya Y., Nakagava Y. 1995. Identification and quontitation of choline glycerophospholipids that contain aldehyde residues by fluorometric high-performance liquid chromatography // Ann. Biochem. 227. N 2. P. 289—294.
Поступила в редакцию 5.09.07
THE ROLE OF luxCDE-GENES IN BIOLUMINESCENCE OF BACTERIA
V.S. Danilov, G.B Zavilgelsky, A.P. Zarubina, M.M. Mazhul
It is revealed, that in the bacteria with the lack of luxCDE-genes, responsible on the standard scheme for synthesis of aliphatic aldehydes — substrate of the bacterial bioluminescence, there is an aldehyde factor at sufficient concentration for bright luminescence of these bacteria.
