CC BY
105
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
REFERENCES
1. Chissov V.I., Starinskij V.V., Petrova G.V., eds. Condition cancer care in Russia in 2011. M.: FGBU «MNIOI im. P.A. Gercena» Minzdravsocrazvitija Rossii; 2012 (in Russian).
2. Palucka K., Ueno H., Fay J., Banchereau J. Dendritic cells and immunity against cancer. J. Intern. Med. 2011; 269 (1): 64-73.
3. Mohamadzadeh M., Luftig R. Dendritic cells: In the forefront of immunopathogenesis and vaccine development. A review. J. Immune Based Ther. Vaccines. 2004; 2 (1): 1.
4. O’NeillD.W., AdamsS., BhardwajN. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004; 104 (8): 2235-46.
5. Ridgway D. The first 1000 dendritic cell vaccines. Cancer Invest. 2003; 21 (6): 873-8.
6. Bohnenkamp H.R., Coleman J., Burchell J.M., Taylor-Papadimitriou J., Noll T. Breast carcinoma cell lysate-pulsed dendritic cells cross-prime MUC 1-specific CD8+ T cells identified by peptide-MHC-class-I tetramers. Cell. Immunol. 2004; 231 (1-2): 112-25.
7. Chiang C.L., Maier D.A., Kandalaft L.E., Brennan A.L., Lanitis E., Ye Q. et al. Optimizing parameters for clinical-scale production of high IL-12 secreting dendritic cells pulsed with oxidized whole tumor cell lysate. J. Transl. Med. 2011; 9: 198. doi: 10.1186/1479-5876-9-198.
8. Delirezh N., Moazzeni S.M., Shokri F., Shokrgozar M. A., Atri M., Kokhaei P. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce T cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. Cell. Immunol. 2009; 257 (1-2): 23-31.
9. Kass R., Bellone S., Palmieri M., Cane S., Bignotti E., Henry-Tillman R. et al. Restoration of tumor-specific HLA class I restricted cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes of advanced breast cancer patients by in vitro stimulation with
tumor antigen-pulsed autologous dendritic cells. Breast Cancer Res. Treat. 2003; 80 (3): 275-85.
10. Pandolfi F., Cianci R., Pagliari D., Casciano F., Bagala C., As-tone A. et al. The immune response to tumors as a tool toward immunotherapy. Clin. Dev. Immunol. 2011; 2011: 894704. doi: 10.1155/2011/894704.
11. Jeras M., Bergant M., Repnik U. In vitro preparation and functional assessment of human monocyte-derived dendritic cells-po-tential antigen-specific modulators of in vivo immune responses. Transplant. Immunol. 2005; 14 (3-4): 231-44.
12. Boudreau J.E., Bonehill A., Thielemans K., Wan Y. Engineering dendritic cells to enhance cancer immunotherapy. Mol. Ther. 2011; 19 (5): 841-53.
13. Colomb M.P., Trinchieri G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2002; 13 (2): 155-68.
14. Yang Y., Huang C.T., HuangX., PardollD.M. Persistent Toll-like receptor signals are required for reversal of regulatory T cell-mediated CD8 tolerance. Nature Immunol . 2004; 5 (5): 508 -15.
15. Jakushenko E.V., Lopatnikova Ju.A., Sennikov S.V Interleukin-18 and its role in the immune response. Medicinskaja immunologija. 2005; 7 (4): 355-64 (in Russian).
16. Iinuma H., Okinaga K., Fukushima R., Inaba T., Iwasaki K., Oki-naga A. et al. Superior protective and therapeutic effects of IL-12 and IL-18 gene-transduced dendritic neuroblastoma fusion cells on liver metastasis of murine neuroblastoma. J. Immunol. 2006; 176 (6): 3461-9.
17. Voskoboinik I., Dunstone M.A., Baran K., Whisstock J.C., Trapani J.A. Perforin: structure, function, and role in human immu-nopathology. Immunol. Rev. 2010; 235 (1): 35-54.
18. Zhou F. Perforin: more than just a pore-forming protein. Int. Rev. Immunol. 2010; 29 (1): 56-76.
Поступила 15.03.13
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.36-002.2-022-053.2:575.174.015.3
С.В. Романова, Т.А. Видманова, Е.А. Жукова, И.В. Маянская, Н.И. Толкачева,
Е.В. Ермолина, Т.А. Тимченко
роль генетического полиморфизма tlr3 при хронических вирусных гепатитах в и с У детей
ФГБУ Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Минздрава России, 603950, г Нижний Новгород, Россия
В статье представлены результаты исследования взаимосвязи полиморфизма гена TLR3 с особенностями клинического течения хронических вирусных гепатитов В (ХгВ) и С (ХгС) у 43 детей в возрасте от 6 до 17 лет. Выявление полиморфизма гена TLR3 Phe 412 Leu проводили методом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции, детекцию продуктов амплификации осуществляли с помощью горизонтального электрофореза. Замена Phe на Leu в положении 412 гена TLR3 у детей с ХгВ и ХгС была ассоциирована со снижением эффективности адаптивного иммунитета в виде уменьшения численности СD3-лимфоцитов (р = 0,037), гиперпродукцией интерлейкина (IL)-ip и IL-6 и иммуноглобулинов IgG (р = 0,025) и IgA (р = 0,011) на фоне низкого уровня виремии НВV и 4CV (р = 0,034), что может способствовать длительному торпидному течению заболевания с отсутствием элиминации возбудителя и активацией аутоагрессивных реакций. Кроме того, гетерозиготы и патологические гомозиготы по данному полиморфизму характеризовались достоверно более частыми гематологическими осложнениями при проведении им противовирусной терапии.
Ключевые слова: полиморфизм генов, толл-подобные рецепторы, хронические вирусные гепатиты, дети
Романова Светлана Владимировна (Romanova Svetlana Vladimirovna), е-mail: krigina@mail.ru
- 330 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Romanova S.V., Vidmanova Т.А., Zhukova E.A., Mayanskaya I.V., Tolkacheva N.I., Ermolina E.V., Timchenko I.A.
THE ROLE OF TLR3 GENE POLYMORPHISM IN CHRONIC VIRAL HEPATITES В AND С IN CHILDREN
Federal State Budgetary Institution “Nizhny Novgorod Research Institute of Children Gastroenterology”, Ministry of Health of the Russian Federation, Nizhny Novgorod, 603950, Russia
The article represents the findings of the research on the interaction of TLR3 gene polymorphism with the peculiarities of clinical progression of chronic viral hepatitis В (CHB) and C (CHC) in 43 children aged from 6 to 17 years. The polymorphism of gene TLR3 Phe 412 Leu was detected by allele-specific polymerase chain reaction, amplified products were revealed using horizontal electrophoresis. The substitution of Phe for Leu in 412 location of gene TLR3 in children with CHB and CHC was associated with the reduced efficiency of adaptive immunity in the decreased number of CD3-lymphocytes (p = 0.037), hyperproduction of interleukins IL-ip and IL-6 and immunoglobulin IgG (p = 0.025) and IgA (p = 0.011) against the background of low HBV и HCV viremia level (p = 0.034) that can contribute to a long torpid course of the disease with no elimination of an agent and activation of auto-aggressive reactions. Moreover, heterozygotes and pathological homozygotes on this polymorphism were characterized by significantly more frequent hematological complications when performing antiviral therapy.
Key words: gene polymorphism, toll-like receptors, chronic viral hepatites, children
За последнее десятилетие понимание механизмов развития хронических вирусных гепатитов существенно углубилось. В исследованиях, проведенных с момента идентификации HBV и HCV, выявлено, что помимо целого ряда вирусных и внешних факторов ведущая роль в определении течения и исходов хронических вирусных гепатитов B (ХГВ) и C (ХГС) принадлежит факторам организма-хозяина. При этом перспективным является изучение генетических факторов, способных влиять на хронизацию гепатотропных инфекций и скорость прогрессирования заболеваний, детерминировать ответ на противовирусное лечение и его переносимость.
Известно, что эффективная работа иммунной системы при взаимодействии с бактериальным или вирусным патогенном зависит от согласованной последовательной активации всех ее компонентов - рецепторных систем, клеточных и гуморальных реакций, процессов фагоцитоза, обеспечивающих элиминацию возбудителя.
Первой линией защиты организма, осуществляющей быстрый запуск иммунного ответа, является система врожденного иммунитета. Пусковым моментом является распознавание высококонсервативных структур (липополисахариды, флагеллин, нуклеиновые кислоты), свойственных большой группе микроорганизмов (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), а также специфических антигенов, разных для каждого микроорганизма (PAMPs), с помощью рецепторов врожденной иммунной системы - образраспознающих рецепторов (PRRs) [1].
Среди нескольких групп образраспознающих рецепторов, найденных у человека, наиболее значимыми являются толл-подобные рецепторы (TLRs) [2]. На сегодняшний день у млекопитающих и человека обнаружено 13 видов TLRs. Они локализуются на моноцитах/макрофагах, нейтрофиль-ных гранулоцитах, дендритных клетках (ДК), различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогенитального тракта [3]. Некоторые из них, распознающие структуры бактерий, - TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 [4], экспрессируются преимущественно на поверхности клетки, в то время как TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, способные связываться с нуклеиновыми кислотами, располагаются внутриклеточно на поверхности эндосом [5]. После связывания TLR c лигандом происходит запуск каскада внутриклеточных реакций с активацией адаптерного белка MyD88, ядерного транскрипционного фактора NF-kB, инициирующих выработку медиаторов воспаления и антимикробных пептидов. Кроме того, TLR3 и TLR4 способны потенциировать иммунный ответ посредством адаптерного белка, индуцирующего интерферон (IFN)-ip (TRIF). Это приводит к последующей выработке интерфе-ронов I типа, экспрессии интерферониндуцируемых генов [1, 6] с возрастанием образования провоспалительных цитокинов, развитием воспалительной реакции, усилением фагоцитоза и клеточных эффекторных функций [7], направленных на элиминацию патогена. Нарушение функционирования различных компонентов системы врожденного иммунитета
может приводить к развитию более высокой восприимчивости к инфекционным заболеваниям, в том числе к вирусным инфекциям, а также к реализации более тяжелого течения воспалительного процесса, развитию аутоиммунных и аллергических заболеваний, атеросклероза [8, 9]. При этом изменения могут быть обусловлены как дефектом самих TLRs с нарушением распознавания лигандов, экспрессии TLR, передачи сигнала, активации адаптерных белков, блокирующих продукцию цитокинов, так и всех последующих компонентов сигнального пути вплоть до эффекторного звена [10].
В настоящее время установлена значимость системы TLR в развитии заболеваний печени. Так, имеются работы, устанавливающие роль TLRs в продукции провоспалительных цитокинов и формировании фиброза печени при различной этиологии болезни - гепатите С, неалкогольном и алкогольном стеатогепатите, первичном билиарном циррозе и муко-висцидозе [11, 12]. Выявлены высокий уровень экспрессии TLR3 у больных ХГС, корреляция уровня TLR2 и TLR7 со степенью некро-воспалительного процесса и связь экспрессии TLR7 с поздней стадией фиброза печени [13]. В другом исследовании стимуляция с лигандами для TLR2, TLR3 и TLR9 вызвала значительное повышение уровня IL-6, хемо-кинов CCL3 и CXCL10 и снижение содержания IFNa у детей с ХГВ по сравнению с таковыми у здоровых [14].
Одним из основных медиаторов противовирусного иммунного ответа является TLR3, распознающий двухцепочечную РНК вирусов. Данный рецептор находится на внешней плазматической мембране клетки и мембране эндосом ДК и В-лимфоцитов. Таким образом, клетка отвечает на проникновение вирусной РНК внутрь нее в процессе эндоцитоза. Двухцепочечная РНК самой клетки не попадает в зону действия TLR3, так как находится в цитоплазме. Вместе с тем при разрушении соседних клеток высвобождающаяся РНК может вступить во взаимодействие с TLR3 и вызывать аутоиммунные реакции организма.
TLR3 распознают РНК целого ряда вирусов, таких как вирус простого герпеса, вирус папилломы человека, вирус гепатитов B и С, цитомегаловирус, ВИЧ. Результаты недавних исследований показали, что TLR3 также играет важную роль в патофизиологии различных заболеваний печени [15, 16] и присутствуют во всех типах печеночных клеток, включая гепатоциты [17], клетки Купфера, эпителий желчных протоков, а также иммунные клетки [18].
В настоящее время известно более 136 однонуклеотидных (SNP) полиморфизмов TLR3, которые могут вызвать нарушение конфигурации, в результате чего изменяется функциональная способность кодируемых белков со снижением их активности либо инверсией характерных свойств. Установлено, что SNP-полиморфизмы Y 307 D и S 737 T существенно не влияют на стабильность протеина, в то же время мутации TLR3 L 412 F и N 284 I сопряжены с изменением структуры белка и концентрации или активности продукта гена [19].
Несмотря на большое количество исследований, касающихся роли TLR3 в формировании и течении заболеваний
- 331 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
печени, их результаты противоречивы [20]. Клиническая значимость TLR3-полиморфизмов при вирусных гепатитах продемонстрирована в ряде исследований: выявлена связь по-лимофизма rs13126816 с разрешением Hcv-инфекции [21], мутации L412F TLR3 с худшими результатами при проведении трансплантации печени у больных ХГС [22]. Влияние полиморфизма в -705A/G гена TLR3 на предрасположенность к инфекции Hcv установлено у пациентов с хронической инфекцией Hcv [23]. В другой работе найдена корреляция мутации 412 Leu Leu TLR3 с восприимчивостью к инфекции HBv, а также с тяжелым течением заболевания [24]. В то же время результаты, полученные другими авторами, не показали существенной ассоциации инфекции НВУ, прогрессирования в цирроз и развития гепатоцеллюлярной карциномы с изучаемыми полиморфизмами TLR3 (rs5743311, rs5743312, rs1879026, rs5743313, rs5743314, rs5743315, rs111611328, rs78726532, rs 184322913). Только один SNP - rs1879026 (G/T) - показал различия в распределении между больными ХГВ и здоровыми лицами (р = 0,0480; OR = 0,809, 95% CI = 0,655-0,999) [25]. Еще одна группа исследователей сделала вывод о том, что SNP-полиморфизмы TLR3 - rs5743305 (T/A) и rs3775291 (C/T) - не играют роли в прогрессировании заболевания при хронической инфекции HCV [26].
Возможно, нарушения экспрессии TLRs в печени вследствие генетической предрасположенности способствуют формированию различных типов ответа на вирусные антигены, что обусловливает варианты клинического течения болезни.
В связи с этим целью исследования стало изучение взаимосвязи генетических особенностей рецепторов врожденного иммунитета с клинико-иммунологическими параметрами ХГВ и ХГС у детей, а именно с активностью воспаления, уровнем репликации вируса, а также особенностями ответа на противовирусное лечение.
Материалы и методы. Работу выполняли с разрешения локального этического комитета. Все пациенты и их родители дали информированное согласие на проведение исследования и использование их медицинской документации.
Критериями включения пациентов в исследование стали возраст с 6 до 17 лет, выявление маркеров ХГВ и ХГС в сыворотке крови в течение 6 мес и более; наличие информированного согласия. Критерии исключения - диагностика иных, кроме вирусных, гепатитов; наличие сопутствующего острого респираторного заболевания.
Всего обследовали 43 ребенка обоих полов (21 мальчик и 22 девочки) в возрасте от 6 до 17 лет (средний возраст 12 лет) с диагнозом хронического вирусного гепатита. Из них 16 с ХГВ и 27 с ХГС. Давность заболевания до 5 лет отмечена у 15 (34,9%) больных, от 5 до 7 лет - у 7 (16,3%), более 7 лет - у 21 (48,8%). У 39 (90,6%) обследованных выявили виремию ДНК MV или РНК HCV У 25 (58,1%) пациентов обнаружили цитолиз.
Диагноз хронического гепатита устанавливали на основании клинических и общепринятых лабораторноинструментальных исследований. Для верификации диагноза определяли маркеры H8V и HCV методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород); ДНК HBV и РНК HCV в сыворотке крови выявляли методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Степень активности гепатита определяли по уровню АЛАТ (DiaSys Diagnostic Systems Gmbn, Germany с помощью анализатора СА-180 Furuno, Япония). Повышение уровня АЛАТ до 2-4 норм соответствовало низкой активности гепатита, свыше 4 норм - высокой. Инструментальную оценку степени фиброза печени проводили на аппарате «Fibroscan» («Echosens», Франция) с разграничением стадии по шкале Metavir от F0 до F4. Содержание IL определяли методом ИФА, используя тестсистемы производства ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Полученные значения IL-1p, IL-6 сравнивали с показателями у здоровых детей, тождественных по полу и возрасту, не имеющих заболеваний пищеварительного тракта. Иммунофенотипирование лимфоцитов (CD) прово-
дили иммуноцитохимическим методом с помощью реагентов фирмы DAKO (Дания). Уровень IgG и ^А определяли с помощью реактивов «Моно-РИД-G, A, М» (ФГУП «НПО Микроген», Москва).
Кровь для изучения полиморфизма гена TLR3 получали утром, натощак, путем венепункции локтевой вены. Кровь собирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА. Для выделения ДНК использовали термо-коагуляционный метод. Изучали полиморфизм гена TLR3 (Phe412Leu). Амплификацию генов цитокинов проводили методом аллельспецифич-ной ПЦР; детекцию продуктов амплификации осуществляли с помощью горизонтального электрофореза, используя реактивы «Литех» (Москва).
21 ребенок получал противовирусное лечение с использованием парентеральных IFN и аналогов нуклеозидов в течение 24 нед при ХГВ и 48 нед при ХГС.
Статистический анализ. Полученные данные подвергнуты статистической обработке при помощи пакета прикладных статистических программ «STATISTICA 6.1» (StatSoft®). Нормальность признаков оценивали по методу Шапиро-Уилкса. В связи с отсутствием нормального распределения исследуемых признаков для обработки использовали методы непараметрической статистики. Определяли ряд параметров описательной статистики (медиана, квартили), для сравнения групп применяли критерий Манна-Уитни. Статистическую значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивали при помощи точного критерия Фишера, однофакторного корреляционного анализа с расчетом непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение. Функциональное значение в детерминации генетической предрасположенности пациента к той или иной патологии могут иметь как аллельные варианты, так и генотипы. Результаты проведенного анализа полиморфизма Phe 412 Leu гена TLR3 показали, что частота встречаемости у детей с ХГВ и ХГС аллеля Phe составляет 67,4% (п = 29), патологический аллель Leu определяли соответственно в 32,6% (п = 14). Распределение частоты генотипов у пациентов оказалось следующим: преобладали гетерозиготные носители мутаций Phe/Leu (п = 22, или 51,2%); нормальный генотип Phe/Phe установили у 18 (41,8%) больных, полные мутации TLR3 с генотипом Leu/ Leu - у 3 (7%). Данные литературы о встречаемости данного полиморфизма TLR3 противоречивы. Так, имеются результаты исследований, свидетельствующие о выявлении мутации Phe 412 Leu гена TLR3 в европейской популяции у 27% детей, в мире - у около 20%, в то же время есть работы, где данная мутация обнаружена у 50,4% [19]. Такой широкий диапазон частоты встречаемости данного вида полиморфизма в разных исследованиях, вероятно, связан с особенностями разных популяций.
У всех обследованных больных установили высокий уровень продукции провоспалительных цитокинов в сыворотке крови - содержание IL-1P и IL-6 статистически значимо отличалось от таковых у здоровых детей (табл. 1). При этом при разделении пациентов по генетическим вариантам полиморТаблица 1
Уровень продукции цитокинов IL-1P и IL-6 у детей с хроническими вирусными гепатитами в зависимости от полиморфных вариантов гена TLR3 (медиана (квартили (25-75%))
Полиморфизм гена TLR3 Phe IL-1p IL-6
412 Leu
Генотип Phe/Phe 402,00 (48,10-998,29)* 37,43 (24,07-55,00)*
Генотип Phe/Leu 206,10 (29,06-510,50)* 26,70 (13,22-45,83)*
Генотип Leu/Leu 478,90 (153,80-892,60)* 23,28 (15,08-26,98)
Примечание. * - достоверность различий показателей у здоровых детей
- 332 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 2
Изменение показателей клеточного и гуморального иммунитета в зависимости от наличия полиморфизма Phe 412 Leu гена TLR3 у детей с ХГв и ХГс (медиана (квартили (25-75%))
Полиморфизм Phe 412 Leu гена TLR3 CD3 (*109/мл) CD19 (*109/мл) IgG (г/л) IgA (г/л)
Генотип Phe/Phe 1,53 (1,38-1,73) 0,48 (0,39-0,66) 14,17 (12,40-17,92) 2,01 (1,40-2,29)
Генотип Phe/Leu 1,13 (1,04-1,51); р1 = 0,037 0,51 (0,36-0,61) 14,17 (10,63-15,05) 2,15 (1,6-2,70)
Генотип Leu/Leu 1,36 (0,99-1,65) 0,56 (0,53-0,56) 17,92 (17,71-19,49); р2 = 0,025 3,15 (2,87-4,16); р2 = 0,017; р3 = 0,011
Примечание. р1 - достоверность различий между показателями у больных с генотипами Phe/Phe и Phe/Leu; р2 - между показателями у больных с генотипами Phe/Leu и Leu/Leu; р3 - между показателями у больных с генотипами Phe/Phe.
Таблица 3
Изменение активности и виремии в зависимости от распределения генотипов гена TLR3 у больных ХГв и ХГс
Полиморфизм гена TLR3 Активность воспаления Репликация вируса р
неактивный активность АЛАТ до 2-4 норм активность АЛАТ выше 4 норм виремия виремия 102-104 МЕ/мл виремия 105 и выше МЕ/мл
Генотип Phe/Phe 7 (38,9) 7 (38,9) 4 (22,2) 0 3 (16,7) 15 (83,3)
Генотип Phe/Leu 8 (36,4) 10 (45,4) 4 (18,2) 2 (9) 5 (22,7) 15 (68,3) > 0,05
Генотип Leu/Leu 1 (33,3) 2 (66,7) 0 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,3)
Примечание. р - достоверность различий между показателями у больных ХГВ и ХГС с различной степенью активности воспалительного процесса и репликации вируса. Здесь и в табл. 5: в скобках указан процент.
физма гена TLR3 установили, что у носителей нормального генотипа Phe/Phe достоверно чаще отмечали умереннкю экспрессию IL-ip (р = 0,029); высокие и очень высокие значения IL-1 выявили у единичных пациентов. У детей с мутацией в гене TLR3 в гетерозиготном состоянии Phe/Leu и полной мутацией Leu/Leu, напротив, преобладали те, кто имел гиперпродукцию данного цитокина - свыше 30 норм. Это может свидетельствовать о том, что точечная мутация в экзоне 4 гена TLR3, приводящая к замене аминокислоты Phe на Leu, способствует повышению экспрессии рецептора врожденного иммунитета, вызывает активацию и усиленное высвобождение IL. С учетом того, что своевременное снижение уровня провоспалительных цитокинов важно для индукции тканевой репарации, их избыточная продукция, вызывающая дополнительное повреждение тканей, может замедлять репаративные процессы и обусловливать неадекватное развитие воспалительного процесса с формированием агрессивных вариантов, в том числе аутоагрессии и осложнений. Это позволяет рассматривать механизмы активации TLR в системе противовирусного иммунитета не только как защитные, но и как патогенные, определяющие характер клинического течения хронического вирусного гепатита.
Ранее считалось, что Т- и В-лимфоциты, обеспечивающие функционирование адаптивного иммунитета, не имеют TLRs. В последние годы получены данные о том, что, кроме клеток врожденного иммунитета (макрофаги, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, TLRs присутствуют на Т-лимфоцитах [27] и В-лимфоцитах [28]. В связи с этим мы оценили влияние полиморфизма TLR3 на интенсивность Т - и В-клеточного иммунного ответа. При определении показателей клеточного иммунитета у детей с хроническими вирусными гепатитами в репликативной
Т аблица 4
Уровень (в МЕ/л) виремии у детей с ХГв и ХГс в зависимости от полиморфных вариантов гена TLRs Phe 412 Leu (медиана (квартили (25-75%))
Полиморфизм гена TLR3 Phe 412 Leu Уровень виремии р
Генотип Phe/Phe 8,3 • 105 (1 • 105 - 5 • 106)
Генотип Phe/Leu 1,1 • 106 (5,8 • 104 - 7,5 • 106) 0,034
Генотип Leu/Leu 4,3 • 103 (0 - 1 • 105)
Примечание. Здесь и в табл. 5: р - достоверность различий между показателями у больных с генотипами Phe/Phe и Leu/Leu.
фазе оказалось, что состояние Т-клеточной реактивности ассоциировано с генетическим вариантом мутации гена TLR3 (табл. 2). При этом нормальный генотип характеризовался наиболее высоким абсолютным количеством СD3-лимфоцитов (в среднем 1,53 • 109/мл), в то время как гетерозиготный и мутантный генотипы - существенно меньшим содержанием Т-клеток (в среднем 1,13 • 109/мл (р1 = 0,037) и 1,36 • 109/мл соответственно). Снижение реактивности Т-лимфоцитов при наличии мутации гена TLR3 свидетельствует о важной роли TLRs в регуляции системного иммунного ответа и может приводить к длительной персистенции вирусных антигенов.
Значимых различий в количестве СD19-клеток у больных с разными генотипами не наблюдали (см. табл. 2). В то же время изменение их эффекторных функций ассоциировано с генетическим полиморфизмом TLR3. Отчетливое усиление продукции IgG и IgA по сравнению с таковым дикого генотипа отметили у пациентов с гетерозиготным носитель-ством мутации TLR3 Phe/Leu и при полной мутации Leu/Leu (р = 0,025; р = 0,017; р = 0,011). Такая чрезмерная активация эффекторного потенциала в сочетании с ослабленной Т-реактивностью может приводить к развитию аутоиммунных реакций, что нередко осложняет клиническое течение хронических вирусных гепатитов.
При оценке влияния полиморфизма Phe 412 Leu гена TLR3 на клиническое течение ХГВ и ХГС у детей, в частности на степень активности и наличие репликации вируса, достоверных различий частоты встречаемости вариантных генотипов и аллелей гена TLR3 у пациентов с различными характеристиками заболевания не получили (табл. 3). В то же время выявили отличия уровня вирусной нагрузки у носителей дикого и мутантного генотипа (табл. 4). Более высокими значениями
Таблица 5
Наличие гематологических побочных эффектов при проведении противовирусной терапии у детей с ХГВ и ХГС в зависимости от полиморфных вариантов гена TLR3 Phe 412 Leu
Полиморфизм гена TLR3 Phe 412 Leu Гематологические осложнения (лейкопения, нейтропения) р
Генотип Phe/Phe 5 из 12 (41,6)
Генотип Phe/Leu 9 из 9(100) 0,007
Генотип Leu/Leu 2 из 2(100)
- 333 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
виремии характеризовались пациенты с генотипом Phe/Phe и Phe/Leu (в среднем 8,3 • 105 и 1,1 • 106 МЕ/мл соответственно) по сравнению с генотипом Leu/Leu (в среднем 4,3 • 103 МЕ/мл; р = 0,034). Это может отражать потерю высокой репликативной способности вируса к синтезу РНК или ДНК при сохранении текущего воспалительного процесса в ткани печени. Данное предположение подтверждает и результаты сопоставления уровня виремии и показателей активности гепатита - АЛАТ и АЛАТ - у больных с разными генетическими вариантами TLR3. Так, у пациентов с нормальным генотипом Phe/Phe выявили положительную корреляцию вирусной нагрузки - АЛАТ и АСАТ (R = 0,54; р = 0,019 и R = 0,48; р = 0,040); в группе с гетерозиготной мутацией Phe/Leu эта связь ослабевала (R = 0,47; р = 0,023 и R = 0,16; р = 0,46), при полной замене Leu/Leu не была статистически значимой (R = -0,5; р = 0,66 и R = 0,50; р = 0,66), что свидетельствовало об отсутствии параллельных изменений репликативной активности и маркеров активного воспаления.
Учитывая тот факт, что TLRs экспрессируются на всех клетках, участвующих в формировании неспецифической резистентности, - моноцитах/макрофагах, ДК, различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогенитального тракта, а также на нейтрофильных гранулоцитах [3], мы проследили характер возникающих в ходе проведения противовирусной терапии побочных явлений в зависимости от полиморфизма Phe 412 Leu гена TLR3 (табл. 5). У детей с диким генотипом Phe 412 Phe гена TLR3 частота гематологических нежелательных осложнений в виде лейко-пении/нейтропении на фоне применения комбинированной противовирусной терапии составила 41,6%. Между тем при гетерозиготном генотипе, а также полной мутации данные явления отметили у всех детей - 100% (р = 0,007). Частота аутоиммунных реакций в ответ на интерферонотерапию статистически не различалась у больных с разными генотипами.
Заключение. Наличие полиморфизма генов TLRs, в частности TLR3, вносит определенный вклад в формирование особенностей противовирусной защиты от гепатотропных вирусов. Изменение характера взаимодействия организма с патогеном на уровне первичного звена иммунной системы может детерминировать характер клинико-иммунологических проявлений болезни.
Замена Phe на Leu в положении 412 гена TLR3 у детей с ХГВ и ХГС ассоциирована со снижением эффективности адаптивного иммунитета в виде уменьшения численности СD3-лимфоцитов, гиперпродукцией ГЬ-ф и IL-6 и IgG и IgA на фоне низкого уровня виремии HBV и HCV, что может способствовать длительному торпидному течению заболевания с отсутствием элиминации возбудителя и активацией аутоагрессивных реакций. Кроме того, гетерозиготы и патологические гомозиготы по данному полиморфизму характеризовались достоверно более частыми гематологическими осложнениями при проведении им противовирусной терапии. Полученные данные свидетельствуют о важной роли TLRs в механизмах развития хронических вирусных гепатитов и отражают не только защитные, но и патогенные функции TLRs в индукции воспалительного ответа, что требует дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный. М: Практическая медицина; 2008.
REFERENCES
1. Akhmatova N.K., Kiselevsky M.V. Congenital immunity: antitumour and anti-infective. М: Practical medicine; 2008 (in Russian).
2. Kumar H., Kawai T., Akira S. Pathogen recognition by the innate
immune system. Int. Rev. Immunol. 2011; 30 (1): 16-34. doi: 10.3109/08830185.2010.529976.
3. Claudine R.R., Wilkie B.N. Toll-like receptor, MHC II, B7 and cytokine expression by porcine monocytes and monocyte-derived dendritic cells in response to microbial pathogen-associated molecular patterns. Vet. Immunol. Immunopathol. 2005; 107 (3): 23247-56.
4. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn TR, Yi E.C., Goodlett D.R. et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 2001; 410 (6832): 1099-103.
5. Diebold S.S., Kashino T., Hemmi H., Akira S., Reis e Sousa C. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science. 2004; 303 (5663): 1529-31.
6. Akira S., Hoshino K. Myeloid differentiation factor 88-dependent and independent pathways in toll-like receptor signaling. J. Infect. Dis. 2003; 187 (2): 356-63.
7. Qian F., Bolen C.R., Jing C., WangX., Zheng W., Zhao H. et al. Impaired toll-like receptor 3-mediated immune responses from macrophages of patients chronically infected with hepatitis c virus. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (2): 146-55. doi: 10.1128/ CVI.00530-12. Epub 2012 Dec 5.
8. Nahum A., Dadi H., Bates A., Roifman C.M. The biological significance of TLR3 variant, L412F, in conferring susceptibility to cutaneous candidiasis, CMV and autoimmunity. Autoimmun. Rev. 2012; 11 (5): 341-7. doi: 10.1016/j.autrev.2011.10.007. Epub 2011 Oct 17.
9. Santana-de Anda K., Gomez-Martm D., Soto-SoUs R., Alco-cer-Varela J. Plasmacytoid dendritic cells: Key players in viral infections and autoimmune diseases. Semin. Arthr. Rheum. 2013; Feb 22. pii: S0049-0172(13)00005-X. doi: 10.1016/j. semarthrit.2012.12.026. Epub ahead of print.
10. Picard C., Puel A., BonnetM., Ku C.L., Bustamante J/, Yang K. et al. Pyogenic bacterial infections in humans with IRAK-4 deficiency. Science. 2003; 299 (28): 2076-9.
11. YangL., SekiE. Toll-like receptors in liver fibrosis: cellular crosstalk and mechanisms. Front. Physiol. 2012; 3: 138. doi: 10.3389/ fphys.2012.00138. Epub 2012 May 22.
12. Askar E., Bregadze R., Mertens J., Schweyer S., Rosenberger A., Ramadori G. et al. TLR3 gene polymorphisms and liver disease manifestations in chronic hepatitis C. J. Med. Virol. 2009; 81 (7): 1204-11.
13. Tarantino G., Di Cristina A., Pipitone R., Almasio P.L., Di Vita G., Craxi A. et al. In vivo liver expression of TLR2, TLR3 and TLR7 in chronic hepatitis C. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2013; 27 (1): 233-9.
14. Heiberg I.L., Winther T.N., Paludan S.R., Hogh B. Pattern recognition receptor responses in children with chronic hepatitis B virus infection. J. Clin. Virol. 2012; 54 (3): 229-34. doi: 10.1016/j. jcv.2012.04.013. Epub 2012 May 11.
15. Seki E., Brenner D.A. Toll-like receptors and adaptor molecules in liver disease: update. Hepatology. 2008; 48 (1): 322-35.
16. Mencin A., Kluwe J., Schwabe R.F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 2009; 58 (5): 704-20.
17. Wang N., Liang Y., Devaraj S., Wang J., Lemon S.M., Li K. Toll-like receptor 3 mediates establishment of an antiviral state against hepatitis C virus in hepatoma cells. J. Virol. 2009; 83 (19): 9824-34.
18. Xiao X., Zhao P., Rodriguez-Pinto D., Qi D., Henegariu O., Alexopoulou L. et al. Inflammatory regulation by TLR3 in acute hepatitis. J. Immunol. 2009; 183 (6): 3712-9.
19. Trizzino A. L’immunita innata e l’insorgenza delle patologie ematologiche maligne in eta pediatrica: studio dei polimorfismi dei geni TLRs e prospettive di immunoterapia. Borsa di studio fondazione alazio; 2009.
20. SchroderM., BowieA.G. TLR3 in antiviral immunity: key player or bystander? Trends Immunol. 2005; 26 (9): 462-8.
21. Qian F., Bolen C.R., Jing C., Wang X., Zheng W., Zhao H. et al. Impaired toll-like receptor 3-mediated immune responses from macrophages of patients chronically infected with hepatitis C virus. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20 (2): 146-55. doi: 10.1128/ CVI.00530-12. Epub 2012 Dec 5.
- 334 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
22. Lee S.O., Brown R.A., Razonable R.R. Association between a functional polymorphism in Toll-like receptor 3 and chronic hepatitis c in liver transplant recipients. Transplant. Infect. Dis. 2012; Dec 13. doi: 10.1111/tid.12033. Epub ahead of print.
23. Medhi S., Deka M, Deka P., Swargiary S.S., Hazam R.K., Sharma M.P. et al. Promoter region polymorphism expression profile of toll like receptor-3 (TLR3) gene inchronic hepatitis c virus (HCV) patients from India. Indian J. Med. Res. 2011; 134: 200-7.
24. Rong Y., Song H., You S., Zhu B., Zang H., Zhao Y. et al. Association of toll-like receptor 3 polymorphisms with chronic hepatitis B and hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure. Inflammation. 2013; 36 (2): 413-8. doi: 10.1007/s10753-012-9560-4.
25. Al-QahtaniA., Al-AhdalM., Abdo A., SanaiF., Al-AnaziM., Kha-laf N. et al. Toll-like receptor 3 polymorphism and its association
with hepatitis B virus infection in Saudi Arabian patients. J. Med. Virol. 2012; 84 (9): 1353-9. doi: 10.1002/jmv.23271.
26. Askar E., Bregadze R., Mertens J., Schweyer S., Rosenberger A., Ramadori G. et al. TLR3 gene polymorphisms and liver disease manifestations in chronic hepatitis C. J. Med. Virol. 2009; 81 (7): 1204-11.
27. Gibson J., Gow N., Wong S.Y. Expression and function of innate pattent recognition receptors in T and B cells. Immun., Endocr. Metab. Agents Med. Chem. 2010; 10: 11-20.
28. TremlL.S., Carlesso G., HoekK.L., Stadanlick J.E., Kambayashi T., Bram R.J. et al. TLR stimulation modifies BLyS receptor expression in follicular and marginal zone B cells. J. Immunol. 2007; 178: 7531-9.
Поступила 14.04.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-056.43-02:613.2-053.2]-078.33
ТА. Евдокимова1, О.С. Федорова1, Л.М. Огородова1, Ф.И. Петровский2, М.М. Федотова1, О.С. Кобякова\ И.А. Деев1
ХАРАКТЕРИСТИКА РАННЕЙ И ПОЗДНЕЙ ФАЗ IGE-ОПОСРЕДОВАННОЙ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ У детей: РЕЗУЛЬТАТЫ Исследования EuRoPREvALL
1ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава РФ, 634050, г Томск, Россия; 2ГБОУ ВПО Ханты-Мансийского автономного округа - Югры Ханты-Мансийская государственная медицинская академия, 268011, г. Ханты-Мансийск, Россия
Пищевая аллергия (ПА) - актуальная проблема здравоохранения, что связано со значительной распространенностью и сложностью контроля. Вариабельность тяжести и временной компонент развития симптомов зависит от ряда факторов, включая характеристику причинно-значимых пищевых аллергенов.
Цель - сравнить клинические проявления ранней фазы ПА (РФПА) и поздней фазы ПА (ПФПА) и определить ведущие белки пищевых аллергенов у детей Томской области.
Проведено одномоментное эпидемиологическое исследование в выборке детей 7-10 лет (EuroPrevall, №FP6-2006 -TTC-TU-5 Proposal 045879). Скрининговый этап включал анкетирование с использованием стандартизованного вопросника (n=13010); клинический этап (n=1288) - интервьюирование родителей/опекунов, кожное прик-тестирование (ALK-Abello, Испания), оценку уровня специфического IgE сыворотки и компонентную аллергодиагностику (ImmunoCAP, Phadia, Швеция). Сформированы группы пациентов: РФПА (n=58) и ПФПА (n=19).
Ведущими пищевыми аллергенами у больных РФПА и ПФПА являются яйцо, рыба, яблоко, морковь. Клинические проявления у больных РФПА представлены оральным аллергическим (87%) и кожным синдромом (78%); у больных ПФПА - кожными (87%) и гастроинтестинальными проявлениями (38%). У пациентов РФПА выявлена большая частота сенсибилизации к аллергену березы Bet v 1 отношение шансов (ОШ) 5,33; доверительный интервал (ДИ) 95% 1,4-20,29; р=0,018). Развитие орального аллергического синдрома сопряжено с сенсибилизацией к аллергенам яблока Mal d 1 (ОШ 2,93; ДИ 95% 1,27-6,74; р=0,017) и персика Pru p 1 (ОШ 2,67; ДИ 95% 1,16-6,13; р=0,031). Тяжелые системные проявления (отек Квинке, бронхообструктивный синдром, отек гортани) регистрируются у больных РФПА и связаны с сенсибилизацией к аллергенам рыбы Gad m 1 (ОШ 3,31; ДИ 95% 0,92-12; р=0,099) и Cyp c 1 (ОШ 3,6; ДИ 95% 1-13,01; р=0,072).
Ключевые слова: пищевая аллергия, пищевые аллергены, белки аллергенов, ранняя фаза пищевой аллергии, поздняя фаза пищевой аллергии, синдром перекрестной реактивности
T.A. Evdokimova1, O.S. Fedorova1, L.M. Ogorodova1, F.I. Petrovskiy2, M.M. Fedotova1, O.S. Kobjakova1, I.A. Deev1
CHARACTERISTIC C>F THE EARLY AND LATE PHASES C>F IGE-MEDIATED FGC>D ALLERGY IN CHILDREN: THE RESULTS GF THE STUDY EURGPREVALL
‘Siberian state medical university, Ministry of health of the Russian Federation, 634050, Tomsk, Russia; “Khanty-Mansiysk Autonomous Area - Ugra, «Khanty-Mansiysk state medical Academy», 268011, Khanty-Mansiysk, Russia Introduction. Food allergy to peanuts and nuts is an actual problem of health care, associated with significant prevalence of this disease and difficulty of the control. Aim: to compare the clinical manifestations of early and late phases of the food allergy (EFFA, LFFA), and to identificate the main food allergen proteins in children of Tomsk Gblast (Russia). Patients and methods. The cross-sectional study was performed in random sample of primary schoolchildren aged 7-10 years (EuroPrevall, №FP6-2006-TTC-TU-5 Proposal 045879). The screening stage was performed using a standardized questionnaire (n=13010), the clinical stage included the completion of a clinical questionnaire, skin-prick test (ALK-Abello, Spain), serum specific IgE measurement and component-resolved diagnostic (ImmunoCAP, Phadia, Sweden). sample was recruited for the second stage (n=1288). There were formed two groups of patients: EFFA (n=58) and LFFA (n=19). Results. The most prevalent food allergens in children with EFFA and LFFA are egg, fish, apple, carrot. Ога! allergy syndrome and skin syndrome are the main clinical manifestations in patients with EFFА (87% and 78%, correspondingly), whereas for LFFA patients cutaneous manifestations (87%) and gastrointestinal syndrome (38%) are more prevalent. High proportion of patients sensitized to birch protein Bet v 1 was revealed in EFFA group ^R 5,33; CI95% 1,4-20,29;
- 335 -
