CC BY
9ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ф
Новости клинической цитологии России Russian News of Clinical Cytology
2021, т.25, №4 с. 05-08 2021, vol.25, № 4, pp. 05-08
https://doi.org/10.24412/1562-4943-2021-4-0001
РОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГИСТ0НА H2A.Z В ГЕНЕЗЕ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЗПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕ0ПЛАЗИИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ГЕНОТИПА
В.А.ЕРШОВ
Санкт-Петербургское государственное бюджетноеучреждение здравоохранения 'Тородской клинический онкологический диспансер". Санкт-Петербург, Российская Федерация.
Резюме
Цель исследования. Анализ экспрессии гистона H2A.Z и его роли в генезе цервикальной интраэпите-лиальной неоплазии, ассоциированной с ВПЧ 16 генотипа.
Материал и методы. Биоптаты шейки матки 46 женщин с цервикальными интраэпителиальными не-оплазиями, ассоциированными с ВПЧ 16 генотипа, исследованы цитологическим, иммуноцитохимическим, гистологическим, иммуногистохимическим методами и методом ПЦР.
Результаты. Верифицированы ВПЧ16-позитивные ЦИН I (10,9%), ЦИН II (4,3%), ЦИН III: тяжелая диспла-зия (80,5%) и Cr in situ (4,3%). При ЦИН I, ЦИН II - в 91,9% исследований тяжелой дисплазии (ЦИН III) экспрессии H2A.Z в атипичных клетках не обнаружили. В 8,1% исследований тяжелой дисплазии (ЦИН III) в 11,3±0,9% атипичных клеток и во всех случаях Cr in situ в 10,5±1,2% атипичных клеток выявлена экспрессия гистона H2A.Z.
Заключение. Отсутствие экспрессии гистона H2A.Z в атипичных клетках ЦИН I, ЦИН II и ЦИН III (91,9%) характеризовало ЦИН как гиперпластический процесс. В 8,1% ВПЧ16-позитивной тяжелой диспла-зии и во всех случаях Cr in situ наличие в атипичных клетках гистона H2A.Z свидетельствовало о сохранении у них свойств стволовых клеток - асимметричного митоза, "бессмертных" хромосом.
Ключевые слова: стволовая клетка, гистон H2A.Z, асимметричный митоз, ВПЧ.
Информация об авторах:
Ершов В.А. - доктор медицинских наук, заведующий цитологической лабораторией СПб ГБУЗ "Городской клинический онкологический диспансер". https://orcid.org/0000-0002-8641-1489.
Автор, ответственный за переписку: Ершов Владимир Анатольевич - e-mail: [email protected].
Как цитировать:
Ершов В.А. Роль экспрессии гистона H2A.Z в генезе цервикальной интраэпителиальной неоплазии, ассоциированной с вирусами папилломы человека 16 генотипа. Новости клинической цитологии России. 2021;25(4):05-08.
https://doi.org/10.24412/1562-4943-2021-4-0001
Введение
Регенерацию поврежденной слизистой оболочки шейки матки осуществляют резервные (РК) и базальные (БК) клетки цервикального эпителия. Они относятся к стволовым клеткам (СК) взрослого организма, содержащихся в каждой ткани и служащими источником образования функционально зрелых клеток любой тканевой специфичности [1]. РК и БК являются стволовыми клетками эпителия шейки матки. Как СК они способны к пролиферации, самоподдержанию, асимметричному митозу, производству большого количества дифференцированного функционального потомства, сохранению в тканевых нишах [1]. Олигопо-тентные РК являются источником развития высокопризматического или многослойного плоского эпителия шейки матки [2], унипотентные БК формируют плоский эпителий [1].
В ходе регенерации РК и БК используют симметричный и асимметричный варианты деления.
При симметричном митозе клетка делится на две генетически идентичные клетки - клетки-предшественники ("progenitor cells"), которые, в свою очередь, способны в дальнейшем только к симметричному митозу [3]. РК и БК, используя данный вариант деления, формируют участки гиперплазии.
Асимметричный митоз является одним из признаков стволовой клетки [4]. Его маркером для культивируемых клеток служит экспрессия гисто-на H2A.Z [4]. Используя данный вид деления, СК поддерживают свою популяцию в тканевых нишах и производят большое количество дифференцированного потомства [1, 3]. Характерное для асимметричного митоза неравномерное распределение
детерминант клеточной судьбы двух дочерних клеток [3] в культуре клеток проявляется асимметрией при разделении наборов "бессмертных" хромосом ("immortal chromosomes"), несущих исходные цепи ДНК, с характерным для них отсутствием укорочения теломерных участков, и "смертных" хромосом ("mortal chromosomes"), содержащих "дочерние" цепи в наборе ДНК [5]. При этом гистон H2A.Z выявляется на "бессмертных" хромосомах, а его присутствие на "смертных" хромосомах скрыто от иммунологического обнаружения [6]. Установка оси полярности клетки относительно оси тела достигается благодаря локализованному на ее апикальной поверхности белку ядерного митотического аппарата - nuclear mitotic apparatus protein (NuMAl) [7], который в ходе митоза вместе с белком динеином [8] формирует необходимое для сегрегации хромосом митотическое веретено [8].
В результате асимметричного деления одна из дочерних клеток занимает место родительской, сохраняет свойства СК, в частности, существующие в родительской клетке гистоны [9], и переходит в фазу покоя - фазу G0. После получения митогенного сигнала она способна к запуску клеточного цикла.
Вторая клетка, содержащая недавно синтезированные гистоны [9], покидает нишу СК и начинает процесс дифференцировки, в ходе которого, изменяя свою форму, размеры, свойства межклеточной адгезии, перемещается к поверхности плоского эпителия, где спустя 28-30 дней разрушается в результате апоптоза.
Внедрившись в РК и БК, вирус папилломы человека (ВПЧ) осуществляет свой жизненный цикл [10]. В ряде случаев это может привести к развитию цервикальной неоплазии. В ее генезе, кроме вызываемого гиперэкспрессией вирусных белков Е6 и Е7 угнетения продукции семейства клеточных белков р16, р21, р53, pRb [11, 12], играет роль и нарушение митотического аппарата. Так, связь белка Е7 ВПЧ с динеином и NuMA1 повреждает митотическое веретено, нарушает механизм асимметричного митоза РК и БК [7] и, как следствие, дифференцировку их дочерних клеток.
Целью исследования являлось изучение роли экспрессии гистона H2A.Z в генезе цервикальной интраэпителиальной неоплазии, ассоциированной с ВПЧ 16 генотипа.
Материал и методы
Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, им-муногистохимического и молекулярно-генетиче-ского методов исследования эпителия шейки матки 46 женщин 22-60 лет, находившихся на лечении по поводу цервикальной интраэпителиальной нео-плазии в СПб ГБУЗ "Городской клинический онкологический диспансер" в период с января по июль 2018 года.
Цитологические препараты экто- и эндоцер-викса готовили методом жидкостной цитологии и окрашивали по методу Папаниколау.
Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в изопропиловых спиртах, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
В 20 случаях провели иммуноцитохимическое исследование и в 26 случаях провели иммуноги-стохимическое исследование с использованием системы детекции "NovolinkTM" (Leica Biosystems Newcastle Ltd., Великобритания), моноклональ-ных кроличьих антител к гистону H2A.Z (EPR6172, Abcam, США).
Молекулярно-генетическое выявление и геноти-пирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени на приборе Rotor Gene ("Corbett Research', Австралия) с использованием наборов реагентов АмплиСенс® (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием критерия Стью-дента.
Результаты и обсуждение
В результате морфологического исследования у 5 (10,9%) женщин 22-30 лет - верифицирована цер-викальная интраэпителиальная неоплазия I степени (ЦИН I), у 2 (4,3%) 42 и 43 лет - ЦИН II, у 37 (80,5%) 25-60 лет - ЦИН III (тяжелая дисплазия), у 2 (4,3%) 30 и 31 лет - ЦИН III (Carcinoma in situ).
ВПЧ 16 генотипа определили в 32 (69,6%) случаях, его сочетания с ВПЧ 31 или 33 генотипов филогенетической группы (ФГГ) а9 - в 12 (26,1%), с ВПЧ 18, 39, 45 генотипов ФГГ а7 - в 2 (4,3%) случаях.
В интерфазе и М фазе атипичных клеток во всех исследованиях ЦИН I степени (МИ=2,3±0,1%, p<0,01) и ЦИН II степени (МИ=3,6±0,6%, p<0,01) гистона H2A.Z не обнаружили, что говорило в пользу симметричного варианта деления атипичных клеток, характерного для гиперпластического процесса при патологической регенерации эпителия шейки матки. Наблюдаемая экспрессия гистона H2A.Z в интерфазе резервных клеток в 20% (n=1) случаев ЦИН I степени свидетельствовала о наличии у них "бессмертных" хромосом, характерных для СК.
В 8,1% (n=3) случаев тяжелой дисплазии шейки матки (ЦИН III) в интерфазе 11,3±0,9% атипичных клеток определили экспрессию H2A.Z (вклейка 1, рис.1-3), подтверждающую наличие у них одного из свойств СК - "бессмертных" хромосом. Из них в 5,4% (n=2) случаев тяжелой дисплазии в М фазе (МИ=4,2±0,4%, p<0,01) атипичных клеток отметили экспрессию гистона H2A.Z - маркера асимметричного митоза.
В остальных 91,9% (n=34) исследований тяжелой дисплазии (ЦИН III) продукции гистона H2A.Z в атипичных клетках не обнаружили, в том числе в М фазе, что характеризовало симметричный вари-
ант их деления (МИ=4,9±0,9%, p=0,01) и позволило рассмотреть данное нарушение дифференцировки плоского эпителия шейки матки как гиперпластический процесс. Из них в 8,1% (n=3) случаев наличие гистона H2A.Z отметили в БК расположенных в пограничных с диспластическими участками многослойного плоского эпителия.
При интраэпителиальном раке (ЦИН III) в клетках опухолевого участка во всех фазах клеточного цикла обнаружили экспрессию гистона H2A.Z (10,5±1,2%, p<0,01).
Заключение
Развитие цервикальной интраэпителиальной не-оплазии, ассоциированной с вирусами папилломы человека 16 генотипа, обусловлено способом деления стволовых клеток эпителия шейки матки - резервных и базальных клеток. При использовании ими и их дочерними атипичными клетками только симметричного митоза, характеризующегося отсутствием экспрессии гистона H2A.Z, изменения эпителия при ЦИН I, ЦИН II и ЦИН III (91,9%) протекали как гиперпластический процесс. В 8,1% тяжелой дисплазии и во всех случаях Cr in situ наличие в атипичных клетках экспрессии гистона H2A.Z, маркера "бессмертных" хромосом и асимметричного варианта митоза, характеризовало сохранение у них свойств, свойственных стволовым клеткам.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Репин В.С., Сабурина И.Н. Клеточная биология развития. М.: Институт стволовых клеток человека. 2010, 300 с. [Repin V.S., Saburina I.N. Cellular biology of development. Moscow: Institute human stem cells; 2010. (In Russ.)]
2. Martens JE, Smedts FM, Ploeger D, Helmerhorst TJ, Ramaekers FC, Arends JW, Hopman AH. Distribution pattern and marker profile show two subpopulations of reserve cells in the endocervical canal. Int J Gynecol Pathol. 2009 Jul;28(4):381-8. https://doi.org/10.1097/pgp.0b013e31819932f8
3. Попов Б.В. Введение в клеточную биологию стволовых клеток: учебно-методическое пособие. СПб.: СпецЛит, 2010. 319 с. [Popov B.V. Introduction in cellular biology stem cells: the study-methodical grant. Saint-Petersburg: SpecLit, 2010.319 p. (In Russ.)]
4. Huh YH, Noh M, Burden FR, Chen JC, Winkler DA, Sherley JL. Sparse feature selection identifies H2A.Z as a novel, pattern-specific biomarker for asymmetrically self-renewing distributed stem cells. Stem Cell Res.2015;14(2):144-54. https://doi.org/10.1016Aj.scr.2014.12.007
5. Huh YH, Sherley JL. Decreased H3K27 and H3K4 trimethylation on mortal chromosomes in distributed stem cells. Cell Death Dis.2014;5:e1554. https://doi.org/10.1038/cddis.2014.522
6. Huh YH, Sherley JL. Molecular cloaking of H2A.Z on mortal DNA chromosomes during nonrandom segregation. Stem Cells.2011;29(10):1620-7. https://doi.org/10.1002/stem.707
7. Nguyen CL., Münger K. Human papillomavirus E7 protein deregulates mitosis via an association with nuclear mitotic apparatus protein 1. J Virol.2009;83(4): 1700-07. https://doi.org/10.1128/JVI.01971-08
8. Horne-Badovinac S, Bilder D. Dynein regulates epithelial polaryti and the apical localization of stardust A mRNA. PloS Genet.2008;4(1):e8. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0040008
9. Kahney EW, Ranjan R, Gleason RJ, Chen X. Symmetry from Asymmetry or Asymmetry from Symmetry? Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2017; 82: 305-318.2018.
https://doi.org/10.1101/sqb.2017.82.034272
10. Doorbar J. The papillomavirus life cycle. J Clin Virol. 2005 Mar;32 Suppl 1:S7-15. https://doi.org/10.1016/jj.jcv.2004.12.006
11. Pyeon D, Pearce SM, Lank SM, Ahlquist P, Lambert PF. Establishment of human papillomavirus infection requires cell cycle progression. PLoS Pathog. 2009;5(2):e1000318.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000318
12. Griesser H, Sander H, Walczak C, Hilfrich RA. HPV vaccine protein L1 predicts disease outcome of high-risk HPV+ early squamous dysplastic lesions. Am J Clin Pathol.2009;132(6):840-5. https://doi.org/10.1309/ajcpcu0hbfffgdtv
ROLE OF EXPRESSION OF HISTONE H2A.Z IN GENESIS OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA ASSOCIATED WITH HUMAN PAPILLOMA VIRUS 16 GENOTYPE
V.A. ERSHOV
Municipal Clinical Oncology Dispensary, St.Petersburg, Russian Federation
Abstract
Aim.Analysis of H2A.Z histone expression and its role in the genesis of cervical intraepithelial neoplasia associated with HPV 16 genotype.
Material and methods. Biopsies of the cervix of 46 women with cervical intraepithelial neoplasia associated with HPV genotype 16 were examined by cytological, immunocytochemical, histological, immunohistochemical methods and PCR.
Results. HPV16-positive CIN I (10.9%), CIN II (4.3%), CIN III: severe dysplasia (80.5%) and Cr in situ (4.3%) were verified. In CIN I, CIN II - in 91.9% of examination of severe dysplasia (CIN III), H2A.Z expression in atypical cells was not found. In 8.1% of examination of severe dysplasia (CIN III) in 11.3±0.9% of atypical cells and in all cases of Cr in situ in 10.5±1.2% of atypical cells, histone H2A.Z expression was detected.
Conclusion. The absence of H2A.Z histone expression in atypical CIN I, CIN II, and CIN III cells (91.9%) characterized CIN as a hyperplastic process. In 8.1% of HPV16-positive severe dysplasia and in all cases of Cr in situ, the presence of H2A.
Z histone in atypical cells indicated that they retained the properties of stem cells - asymmetric mitosis, "immortal" chromosomes.
Keywords: stem cell, histon H2A.Z, asymmetric mitosis, HPV.
Information about the authors:
Ershov V.A. - https://orcid.org/0000-0002-8641-1489 Corresponding author: ErshovVladimir Anatolevich - e-mail: [email protected], +79523576820
To cite this article: Ershoo V.A. Role of Expression of His tone H2A.Z in Genesis of Cervical Intraepithelial Neoplasia Associated with Human Papilloma Virus 16 Genotype. Russian News of Clinical Cytology 2021;25(4):05-08. https://doi.org/10.24412/1562-4943-2021-4-0001 The author declares no conflict of interest.
Иллюстрации к статье «РОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГИСТОНА Н2А7 В ГЕНЕЗЕ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ГЕНОТИПА». Ершов В.А., стр. 5
¡Illustrations for the article «ROLE OF EXPRESSION OF HISTONE H2A.Z IN GENESIS OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA ASSOCIATED WITH HUMAN PAPILLOMA VIRUS 16 GENOTYPE». Ershov V.A., page 5
Рис. 1. Цитологический препарат. Экспрессия гистона H2A.Z в атипичных клетках ЦИН3. Иммунопероксидазное окрашивание, х200. Fig. 1. Cytological slide.
H2A.Z histone expression in atypical CIN3 cells. Immonoperoxidase staining, х200.
Рис. 2. Гистологический препарат.
Экспрессия гистона H2A.Z в атипичных клетках ЦИН3.
Иммунопероксидазное окрашивание, х50.
Fig. 2. Histological slide.
H2A.Z histone expression in atypical CIN3 cells.
Immonoperoxidase staining, х50.
Рис. 3. Гистологический препарат.
Экспрессия гистона H2A.Z в атипичных клетках ЦИН3.
Иммунопероксидазное окрашивани, х400.
Fig. 3. Histological slide.
H2A.Z histone expression in atypical CIN3 cells.
Immonoperoxidase staining, х400.
