CC BY
35
роль ef-hand CA^УMG^+-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ТЕСКАЛЦИНА в процессах пролиферации И ДИффЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК
К.Г. Колобынина 1, В.В. Соловьева 1, В.З. Слепак 2, А.А. Ризванов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Россия
2 Медицинская школа Миллера при Университете Майами, США
The role of EF-hand Са2+/Mg2+-binding tescalcin protein in cell proliferation and differentiation
KG. Kolobynina 1, V.V. Solovyeva 1, VZZ. Slepak 2, AA. Rizvanov1
1 Kazan (Volga Region) Federal University, Russia, Kazan
2 University of Miami Miller School of Medicine, USA, Miami
EF-hand Са2+-связывающие белки принимают участие во многих важных процессах в организме, включая передачу сигналов, регуляцию ионных токов и дифференцировку . Идентификация и анализ EF-hand мотивов в геноме привели к открытию новых Са2+-связывающих белков, которые потенциально применимы для биомедицинских показаний . Одним из таких молекул является тескалцин, белок с молекулярной массой 24 кДа, имеющий один EF-hand мотив . Тескалцин играет важную роль в дифференцировке гемопо-этических клеток, а также взаимодействует с субъединицей 4 сигналосомы С0Р9, №+/Н+-антипортом 1 типа и контролирует экспрессию факторов транскрипции семейства Ets через РМА-индуцированный ERK-путь. Недавно были описаны потенциальные возможности применения тескалцина для диагностики онкологических заболеваний
Ключевые слова: тескалцин, EF-hand кальций-связы-вающие белки, дифференцировка клеток, С0Р9, CSN комплекс, онкологические заболевания
EF-hand Ca2+/Mg2+-binding proteins are involved in many important processes in the body . Identification and analysis of the EF-hand motifs in the genome led to the discovery of novel Ca2+-binding proteins, which are potentially useful for biomedical applications . One of such molecules is tescalcin — 24 kDa protein with one EF-hand motif . Tescalcin plays an important role in differentiation of hematopoietic cells by regulating the expression of Ets family transcription factors via PMA-induced ERK-pathway . At the molecular level, it was shown to interact with subunit 4 of signalosome COP9 and Na+/H+-exchanger . Recently a potential use of tescalcin for cancer diagnostics was demonstrated
Keywords: tescalcin, EF-hand calcium-binding proteins, cell differentiation, COP9, CSN complex, oncological diseases
Введение
Кальций — один из важнейших металлов в живом организме . В качестве универсального вторичного посредника он играет важнейшую роль в сигнальной системе клетки и, таким образом, вовлечен в регуляцию жизненно важных процессов: мышечное сокращение, пролиферацию и дифференцировку клеток, клеточный цикл, апоптоз и прочие физиологические процессы В основе работы кальция в качестве вторичного посредника, или мессенджера, лежит динамика изменений концентрации свободного Са2 + с субмикромолярных значений (~10-7 моль) до миллимолярных (~10-5 моль) в возбужденной клетке под влиянием внеклеточного импульса [1]. Изучение EF-hand Са2+-связывающих белков связано с их исключительной ролью в детекции флуктуа-ций внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция Создаются и совершенствуются программы поиска и предсказания еще не открытых белков с EF-hand мотивами, которые могут стать мишенью исследований и лекарственного воздействия [2]. Одним из интересных EF-hand Са2+-связывающих белков является тескалцин, который участвует в процессах пролиферации и дифференцировки клеток . Также было предложено использовать тескалцин в качестве маркера диагностики и эффективной онкомишени (англ . oncotarget) в случае рака толстой кишки [3].
EF-hand Ca2+-связывающие белки
Суперсемейство EF-hand Са2+-связывающих белков насчитывает свыше 66 подсемейств . EF-hand белки структурно похожи, но функционируют в са-
e-mail: Albert . Rizvanov@kpfu . ru
мых различных биологических процессах . Наиболее часто среди всех Са2+-связывающих мотивов встречается ЕР-ЬапС [4], впервые описанный в 1973 году на примере Са2+-связывающего белка парвальбуми-на [5]. ЕР-ЬапС состоит из 29 аминокислотных остатков (а . о), представляющих собой Са2+-связывающую петлю, фланкированную двумя спиралями — Е и Р [6]. Каноничная Са2+-связывающая петля занимает 12 а . о . и предоставляет 6 лигандов для связывания Са2+, которые обычно обозначают как X, Y, Z, -X, ^ , где X первый лиганд, а ^ последний . Аминокислотные остатки, участвующие в связывании ионов кальция и создании Са2+-связывающей петли, высоко консервативны [7]. Структура «белок-Са2+» дополнительно стабилизируется множеством водородных связей прочих а о , напрямую не участвующих в качестве лигандов [8].
Разнообразие EF-hand мотивов
Помимо ЕР-ЬапС мотива с каноничным типом Са2+-связывающей петли, встречаются другие типы ЕР-петли, которые можно разделить на четыре группы, три из которых сохраняют пентагональную бипи-рамидальную конфигурацию связи с Са2+ [9].
Первая группа с неканоничным строением ЕР-ЬапС петли представлена белками, Са2+-связывающая петля которых имеет каноничную длину в 12 а о , однако либо короче и компактнее обычных (в случае если последним лигандом в позиции 12 является аспартат), либо имеет увеличенное количество карбонильных групп полипептидной цепи (например, у белка AгabiCopsis ^аНапа, схожего с кальцинейри-ном В) [10].
Вторая группа неканоничных EF-hand петель представлена так называемыми псевдо-EF-hand «ф-hand» петлями, у которых есть 14 а . о . вместо обычных 12 (позиции лигандов 1, 4, 6, 9) . Псевдо-EF-hand-петля связывает кальций в основном за счет лигандов полипептидной цепи, а не боковых цепей и предоставляет для связывания Са2+ необычные лиганды +Х, + Y, +Z [7].
К третьей группе относят EF-hand последовательности, которые короче канонической (11 а.о . ). Эти петли связывают Са2 + благодаря альтернативной конформации, возможной за счет участия в качестве лигандов атомов кислорода основной полипептидной цепи и образованию дополнительной водородной связи через молекулу воды [11].
Существует еще один способ связывания Са2 + неканоническими EF-hand петлями . Этот способ заключается в смене координационной геометрии комплекса «белок-Са2 + »: вместо пентагональной бипирамидальной образуется октаэдрическая кон-формация . Обычно в этом случае в связывании кальция участвует только вконец EF-петли [12]. N и С-концы EF-hand Са2+-связывающей петли различны . вконец петли более вариабелен среди белков подсемейств, в то время как С-конец всегда высокоструктурирован и связан с Са2+-связывающей петлей парного мотива [13].
функционирование EF-hand мотивов
Белки с одиночным EF-hand мотивом встречаются очень редко: такой одиночный мотив был обнаружен среди белков А . ^аНапа, а также в белке тескалци-не, которому посвящен этот обзор Структурной единицей одиночных EF-hand мотивов остается мотив, а не домен из пары Это было доказано в ходе эксперимента по созданию химерного белка: отдельный EF-hand мотив был перенесен в структуру белка-хозяина, в норме не содержащего EF-hand мотива . После переноса Са2+-связывающая способность мотива сохранилась [7, 10].
Подавляющее большинство EF-hand мотивов объединено в пары, и только в парах они взаимодействуют наиболее эффективно, связывая ионы кальция . Пара представляет собой продолжительную полипептидную цепь, связанную короткой линкерной последовательностью, формируя пучок из 4 амфи-патических спиралей, скрывающих в центральной части гидрофобное ядро [14]. Сообща пара мотивов связывает два иона кальция, располагающихся на расстоянии 11 А друг от друга [15]. Самым маленьким белком, содержащим всего одну пару EF-hand мотивов, является кальбиндин й9К [16]. Подавляющее большинство белков содержит 2 пары EF-hand (кальмодулин), 4 пары, 6 пар и т . д . Существуют белки с нечетным числом EF-hand мотивов: три-EF-hand (парвальбумин, онкомодулин), пента-EF-hand белки (кальпаин, гранкальцин) . Все они имеют одну не-спаренную EF-hand . Интересно, что этот одиночный мотив участвует в образовании димеров: неспарен-ные EF-hand мотивы каждой частицы образуют пару . Склонность к образованию пары у EF-hand мотива настолько высока, что в искусственно созданной смеси субъединиц димеризация спонтанна, причем гетеродимеры образуются чаще гомодимеров [16]. Для тескалцина также описана способность к диме-ризации [1].
Пара EF-hand мотивов связана между собой функционально и структурно . Две Са2+-связывающих петли соединяются коротким антипараллельным Р-листом, а два EF-hand мотива связываются обширным гидрофобным соединением между спиралями [13]. Спаривание EF-hand мотивов увеличивает сродство каждой EF-hand к кальцию и помогает кооперации двух мотивов в связывании Са2 + . Кооперативный эффект является положительным, если связывание первого Са2 + белком увеличивает сродство ко второму иону Са2 + . Для большинства EF-hand белков характерен положительный кооперативный эффект . Это особенно важно для Са2+-сенсоров, EF-hand белков, связывающих растущие концентрации кальция в клетке . Положительный кооперативный эффект Са2+-связывающего домена способствует быстрой смене состояний: белок остается неактивным до тех пор, пока концентрация Са2+ в цитоплазме не достигнет порогового значения [17]. Интересно, что псевдо-EF-hand мотивы всегда составляют пару только с каноничным EF-hand мотивом, в то время как каноничные могут объединяться как с псевдо-, так и с себе подобными структурами [7]
Кальций-связывающая способность EF-hand
белков
Семейство EF-hand белков на основании Са2+-связывающей способности подразделяется на две группы: белки с низкой Са2+-связывающей способностью, так называемые Са2+-буферы (структурные; например, парвальбумин), которые связывают кальций со сродством менее 100 нМ и не подвергаются каким-либо серьезным конформационным изменениям, в то время как Са2+-сенсоры, EF-hand белки с высокой Са2+-связывающей способностью (регуляторные; например, кальмодулин), обладают способностью связывать растущие концентрации кальция в пределах 10-5—10-6 М и претерпевают Са2+-индуцированные конформационные изменения, что позволяет им взаимодействовать с целевыми белками и передавать сигнал дальше по цепи [1]. Са2+-сенсоры вовлечены в большое количество процессов, где выполняют различные функции: регуляция ионных каналов, моделирование ферментативной активности, сокращение мышц Са2+-буферы модулируют Са2 + -сигнал во времени и пространстве, связывают свободный кальций, чтобы провести его через клетку или удалить потенциально опасный катион из цитоплазмы, поддерживают гомеостаз этого иона К тому же основное сродство к Са2+ выше у буферов, чем у сенсоров [18]. Функционирование белка в качестве буфера или сенсора зависит от характеристик его EF-hand Са2+-связывающих доменов, а те, в свою очередь, от типа и особенностей составляющих их EF-hand мотивов [19]. Стоит отметить, что тескалцин является, скорее всего, сенсором .
Также на связывание Са2+ влияют следующие факторы: собственная связывающая способность EF-hand мотива, кооперативный эффект пары EF-hand мотивов, избирательность к Мд2+ и другим двухвалентным ионам, взаимодействие с целевым белком [9]. Рентгеноструктурный анализ белка в свободном состоянии и в соединении с Са2+ показывает, что после связывания Са2+ конформация белка меняется: EF-hand домен обнажает обширную гидрофоб-
ную поверхность; через которую и идет соединение . Специфичность к целевому белку этой гидрофобной площадки достигается набором аминокислотных остатков на ее поверхности . Такие процессы как кон-формационные изменения в ответ на связывание ионов, взаимодействие с целевым белком и сродство к Са2+ энергетически взаимосвязаны . Энергетический баланс соединения играет важнейшую роль и определяет механизм взаимодействия [20].
Некоторые EF-hand домены могут также связывать и другие двухвалентные катионы помимо кальция, такие как Mg2+ и Zn2+ . Это определяется их свойством избирательности к связыванию ионов Условно разделяют смешанные Са2+-связывающие петли и Са2+-специфичные . Смешанные петли связывают Mg2+ в физиологических условиях субми-кромолярных концентраций . Ион магния похож на ион кальция, но гораздо меньше его размером . Поэтому Mg2+ обычно связывается шестью лигандами в конфигурации октаэдра, и последний бидентатный лиганд глутамата или аспартата, ключевой для связывания Са2 + , не принимает участия в связывании Mg2+ . Для смешанных петель концентрации Mg2+ оказывают влияние на связывание Са2 + . Например, в кальмодулине физиологические концентрации Mg2+ ослабляют связывание кальция EF-hand доменом N-конца в отсутствии целевого белка [21]. В соответствии с результатами измерений аффино-сти рекомбинантного тескалцина с Са2+ было выдвинуто предположение, что тескалцин имеет сродство к ионам магния и находится в клетке в Мд2+-связанной форме [1]. Белки подсемейства S100 связывают, в отличие от других EF-hand белков, ионы Zn2+ и Cu2+ . Кроме того, они могут составлять олигомеры более высокого порядка, связанные дисульфидными мостиками [22].
Ген тескалцина и структура белка, гомологи
Тескалцин, также известный как гомологичный кальцинейрину В белок 3 (англ . Calcineurin B homologous protein 3, CHP3), в организме человека кодируется геном TESC и представляет собой белок с молекулярной массой 24 кДа . Он принадлежит к семейству EF-hand Ca2+- и Мд2+-связывающих белков, подсемейству кальцинейрина B. Ген TESC содержит 8 экзонов и локализуется на 12 хромосоме человека Впервые тескалцин был открыт в эмбриональном яичке мыши на 11,5 день после оплодотворения Открытая рамка считывания гена TESC мыши включает 642 пар нуклеотидов (п . н . ), кодирующих белок из 214 а . о . [18]. Возможны, по меньшей мере, три изоформы тескалцина, моделируемые с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК) этого гена [23]. Кроме EF-hand Ca2+-связывающего домена структура тескалцина мыши также содержит N-концевой миристоиловый мотив и несколько сайтов фосфорилирования [18]. Наличие сайтов миристоилирования показано с использованием рекомбинантного тескалцина, несущего на конце гексагистидиновую метку . Экспрессия этого рекомбинанта в клетках Escherichia coli вместе с дрожжевой N-миристиолтрансферазой 1 приводила к специфичному присоединению [3Н]миристино-вой кислоты [1]. N-миристоилирование тескалцина может запускать Ca2+-индуцированный меристоило-вый переключатель, что облегчает взаимодействие с эффекторами или мембранными компартментами
Ca2+-индуцированный меристоиловый переключатель описан также в других Ca2+-связывающих белках, например у рековерина [24].
Значительная степень гомологии тескалцина была обнаружена к трем Са2+-связывающим белкам: гомологичный кальцинейрину белок 1 (CHP1), гомологичный кальцинейрину белок 2 (CHP2) и кальцинейрин B (CnB) . Все три вышеперечисленных белка ацилированы N-миристиоловым остатком и предполагается, что благодаря этому они могут выполнять функции, связываясь с мембраной [1, 25]. Кроме того, тескалцин человека имеет 96,7% идентичности с тескалцином мыши [25] и, по-видимому, является прямым ортологом . Было показано, что тескалцин высококонсервативен среди многих позвоночных организмов [23]. Тескалцин отличается от CHP1 и CHP2, поскольку в его последовательности отсутствует сигнал ядерной локализации . Он имеет только один функциональный EF-hand мотив, в то время как cHP1 имеет два мотива Все три белка отличаются по своему расположению в организме, в отличие от CHP1, CHP2 был обнаружен и в опухолевых тканях Последовательность cHP1 высоко консервативна, этот белок широко экспресси-руется в тканях Он участвует в транспорте везикул во время экзоцитоза, а также их слиянии с мембраной cHP2 был впервые найден в тканях пациентов с раком печени Сверхэкспрессия cHP2 изменяет опухолеродную способность клеток HEK293 in vivo . Клетки, экспрессирующие cHP2, были более агрессивны, осуществляя инвазию в печень, селезенку и почки, что не наблюдалось в контроле cHP2 и cHP3 обнаружены только у позвоночных, в отличие от cHP1 [26]
Связывание металлов, конформация
На первый взгляд тескалцин имеет только один EF-hand домен, но при более детальном рассмотрении было выявлено, что его структура содержит дополнительные три спираль-петля-спираль участки, имеющие умеренную гомологию к EF-hand домену Предполагается, что они стабилизируют структуру основного Са2+-связывающего участка . EF-hand домен находится ближе к С-концу белка (110— 145 а . о . ) и имеет вторичную структуру вида спираль-петля-спираль длиной в 29 а о , координирующую всего один катион Са2 + шестью консервативными аминокислотными остатками «петли» (1, 3, 5, 6, 8 и 12) в пентагональной бипирамидальной конфигурации . «Спирали» представлены а-спиралями по 9 а . о . каждая [1, 25].
С . Gutierrez-Ford с соавт . (2003) доказали наличие в структуре тескалцина Са2+-связывающего EF-hand домена, заменив ключевой аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты в позиции X предполагаемого EF-hand домена на аланин (D123A). Тескалцин дикого типа показал Са2+-индуцированный сдвиг флуоресценции триптофана, а мутант D123A не дал таких результатов Эти исследования показали, что за Са2+-связывающую способность тескал-цина ответственен именно EF-hand домен Кроме того, экспрессия мутанта D123A в клетках яичника китайского хомячка CHO-K1, трансфицированных им, была на значительно более низком уровне, чем экспрессия тескалцина дикого типа. Авторы исследования предположили, что связывание кальция стабилизирует структуру тескалцина, что мутантному
белку по причине отсутствия функции недоступно [1]. Впоследствии те же авторы показали, что мутация D123A ингибирует взаимодействие тескалцина с его партнером — субъединицей 4 сигналосомы COP9 (CSN) [27].
Конформационные изменения в структуре тескалцина дикого типа также подтверждены результатами спектроскопии циркулярного дихроизма . Анализ результатов показал, что мутация D123A существенно не изменяет вторичную структуру тескалцина, и подтвердил отсутствие функции связывания кальция у мутантного белка: изменения спектра по причине связывания иона кальция тескалцином дикого типа отсутствовали в аналогичных спектрах мутанта D123A [1]. Сродство тескалцина к ионам кальция находится в микромолярном диапазоне EC50 . Таким образом, тескалцин, скорее всего, сенсор кальция. Также была показана афинность тескалцина к ионам магния Авторы предположили, что в покоящейся клетке тескалцин находится в Мд2+-связанной форме, что может представлять собой неактивную конфигурацию . По-видимому, во время резкого повышения концентрации ионов кальция в клетке ионы магния в Мд2+-связывающем сайте могут заменяться ионами кальция [1].
В экспериментах с рекомбинантным белком было показано, что тескалцин человека может существовать как в мономерной, так и в гомодимерной форме, причем связь субъединиц в димере осуществляется за счет дисульфидного мостика . Обе формы показали свою стабильность, и мономеры могут спонтанно димеризоваться . В отличие от других EF-hand Са2+-связывающих белков, электрофоретическая подвижность тескалцина не изменяется в присутствии Са2+ . Кроме того, способность тескалцина связывать кальций не изменяется в присутствии дитиотреола [1].
Субклеточная и тканевая локализация
тескалцина
Тескалцин является преимущественно растворимым белком цитозольной фракции. Было показано, что трансфицированный тескалцин в наибольшей степени сосредоточен вокруг ядра, в перинуклеар-ном пространстве и в непосредственной близости от эндоплазматического ретикулума . Особенно богаты тескалцином мембранные области ламеллоподий, складок и выростов мембраны (англ . Membrane ruffles) в присутствии сыворотки и активного Rac-1 (англ . Ras-related С3 botulinum toxin substrate 1) белка . На субклеточную локализацию тескалцина в траснфицитрованных клетках не оказали влияния мутации EF-hand или N-меристиолового мотива [1]. Интересно, что в клетках линии K562 со сверхэкспрессией тескалцина, основной пул рекомбинант-ного тескалцина находился в ядре. Это позволяет предположить, что тескалцин может быть вовлечен в такие ядерные процессы как транскрипция и реконструкция хроматина [28].
Тканевая локализация тескалцина довольно разнообразна Было показано, что в эмбрионе мыши наибольшая концентрация тескалцина наблюдается в яичке, тогда как в организме взрослых животных — в тканях сердца, желудка и мозга . Тескалцин экспрес-сируется исключительно в эмбриональных половых органах самца и никогда — самки [18]. Тескалцин человека имеет сходную преимущественную локализацию: наибольшая концентрация тескалцина в
организме взрослого человека наблюдается в тканях сердца, меньшая — в слюнных железах, наименьшая — в половых железах, хотя тескалцин был также обнаружен в поджелудочной железе, костном мозге и надпочечных железах, а также в некоторых опухолевых культурах клеток (НeLa, НL-60) и плаценте [25, 27, 29]
Взаимодействие тескалцина
с ^У^-антипортом 1 типа (N№1)
NНE1 представляет собой интегральный белок, состоящий из двух доменов: цитоплазматического С-домена, в виде а-спирали взаимодействующего с сигнальными молекулами, и мембранного ^домена, создающего ионообменный канал . Взаимодействие с тескалцином было отрыто с использованием дву-гибридной дрожжевой системы, где С-концевой домен NНE1 использовался в качестве «наживки» . Тескалцин, как и гомологичные ему СНР1 и СНР2, взаимодействует с тем же юкстамембранным доменом цитоплазматического С-конца NНE1 [25, 30].
Взаимодействуя с NНE1, тескалцин влияет на важнейшие физиологические функции: стабилизацию рН внутри клетки, активацию NНE1 в ответ на злокачественное перерождение клетки, обеспечение необходимого количества Н+ в тканях сердца
[31]. Тескалцин оказывает положительное действие на NНE1, увеличивая его активность, интенсивность перемещения ионов, полупериод его существования в клеточной мембране, тем самым обеспечивая регуляцию таких процессов, как клеточная пролиферация, дифференцировка и опухолевая трансформация
[32]. Однако некоторые исследования подчеркивают эффект ингибирования активности NНE1 тескалцином в неактивной клетке [30]. Также было показано, что NНE1 вовлечен в адаптацию к внутриклеточному ацидозу в случае ишемии . Тескалцин в связи с NНE1 оказывает такое же действие, что делает его возможной мишенью для предотвращения таких неблагоприятных последствий, как некроз и аритмия [25].
Совсем недавно появились результаты исследования участия тескалцина в развитии головного мозга человека . Было выяснено, что тескалцин взаимодействует с геном RELN (гэ2299403; ри-лин) и, хотя молекулярные основы взаимодействия еще не известны, было показано, что в периоды раннего развития мозга наблюдается значительный уровень экспрессии генов тескалцина и рили-на . Рилин — протеаза, экспрессирующаяся в тканях мозга, ответственная за направление нейронной миграции и сигнализации в период развития; впоследствии было обнаружено, что рилин играет роль в развитии таких психических заболеваний как шизофрения, биполярное расстройство на ранних стадиях возникновения, а также оказывает влияние на высшие когнитивные процессы [33]. Хотя до сих пор неясно, как тескалцин влияет на структуру серого вещества гиппокампа взрослых людей, была высказана мысль, что тескалцин играет важную роль в клеточной дифференцировке и пролиферации для создания объема гиппокампа и развития мозга . В период развития тескалцин экспрессиру-ется во всех частях мозга, но особенно большой уровень продукции наблюдается в развивающихся конечном мозге, среднем мозге и желудочках мозга [33] Авторы исследования использовали технику мультимодальной визуализации . Одним из
исследуемых параметров стал объем гиппокампа. Уменьшение объема гиппокампа оказалось одним из самых явных визуализированных маркеров глубокой депрессии и посттравматического стресса по сравнению со всеми остальными нервно-психическими расстройствами. Поскольку тескалцин напрямую взаимодействует с NHE1, который вовлечен в клеточную пролиферацию, дифференци-ровку, миграцию, а также влияет на объем клетки и организацию цитоскелета, авторы предположили, что влияние тескалцина на NHE1 и есть тот самый путь, через который тескалцин осуществляет воздействие на изменение объема гиппокампа [33]. В настоящее время нет достаточно данных, чтобы объяснить молекулярный механизм воздействия тескацина на дифференцировку . Это может быть связано и с его эффектом на траснкрипционные факторы, и взаимодействием с NHE1.
участие тескалцина в процессах
дифференцировки и пролиферации клеток
В ходе исследований тескалцина в клеточных линиях HL60 и К562 было замечено изменение его уровня в процессе дифференцировки В последствии было показано, что тескалцин является необходимым фактором дифференцировки первичных мегакариоцитов и клеток линии К562 . Сверхэкспрессия тескалцина в опухолевой культуре клеток K562 приводит к спонтанной диффе-ренцировке по мегакариотическому пути, индуцируя такие события, как полиплоидизацию, синтез характерных антигенов на поверхности клетки и пролиферацию В то же время нокдаун тескалцина путем РНК-интерференции значительно замедляет дифференцировку [28]. Более поздние исследования на мышах с нокаутом тескалцина не показали аналогичных изменений в системе кроветворения, и вообще не нашли фенотипических изменений Авторы предположили, что гомологи тескалцина CHP1 и CHP2 могут компенсировать нокаут тескалцина [34]. Существует другое объяснение, почему физиологический эффект нокаута не проявился в фенотипе мышей: в генотипе мышей нокдаун был неполный и приводил к транскрипции мРНК, содержащей комбинацию экзонов 1, 2, 7 и 8, так что в клетках образовывался белок, содержащий уникальный C-конец тескалцина [27]. Для понимания роли тескалцина в дифференцировке клеток необходимы дополнительные исследования, включающие более детальный анализ фенотипа нокаутных мышей Например, необходимо сравнить динамику восстановления популяции мегакариоцитов после потери крови, или в эмбриональном развитии Не исключено, что она будет замедлена Действительно, нокдаун тескалцина в клетках не приводил к полной остановке дифференцировки, а только к существенному замедлению процесса
Тескалцин контролирует экспрессию факторов транскрипции семейства Ets через PMA-индуцированный сигнальный ERK-путь (англ . Extracellular signal-regulated kinase). Например, в эритролейкемических линиях клеток К562 и HEL, испытывающих недостаток тескалцина, блокирован синтез таких факторов транскрипции как Fli-1, Ets-1, и Ets-2 Эти транскрипционные факторы участвуют не только в гемопоэзе, но и в развитии нервной и сердечнососудистой систем [27—28]. Следова-
тельно, в процессе мегакариотической диффе-ренцировки тескалцин необходим для координированного взаимодействия активации ERK-каскада и экспрессии Ets генов . Кроме того, тескалцин вовлечен в процесс дифференцировки и созревания полиморфно-ядерных гранулоцитов под контролем сигнального ERK-пути . Интересно, что регуляция экспрессии тескалцина может происходить как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне; клеточная дифференцировка может протекать и с увеличением, и с уменьшением активного тескалцина в клетке, что в некоторой степени связано с типом вещества-индуктора сигнального ERK-пути [29].
Тескалцин является одним из факторов, позволяющих из одного типа клеток-предшественников в процессе дифференцировки получить различные специализированные типы клеток Это определяет интерес к его возможному использованию в клеточной терапии
Взаимодействие тескалцина с субъединицей
4 сигналосомы COP9
Действительно, совсем недавно был обнаружен еще один белок, с которым взаимодействует тескал-цин — это субъединица 4 сигналосомы COP9 (CSN) . COP9 сигналосома — эволюционно консервативный мультибелковый комплекс, состоящий из 8 субъединиц, обозначаемых CSN1-8 (с номерами от одного до восьми), и имеющий чрезвычайную гомологию по отношению к регуляторной частице 26S протеасомы . CSN первоначально была определена как репрессор фотоморфогенеза у арабидопсиса В настоящее время показано участие CSN во многих клеточных процессах и этапах развития различных эукариоти-ческих организмов [35].
Большая часть субъединиц комплекса содержат уникальный PCI (Proteasome-Cop9-eIF3) домен . Исследования cOP9 комплекса у разных организмов охарактеризовали сигналосому в качестве модулятора широкого спектра жизненно необходимых процессов: эмбриогенез, клеточный цикл, репарация ДНК, сигнальный путь MAPK (митоген-активируе-мая протеинкиназа, англ . Mitogen-activated protein kinase) и сигнальная система стероидных гормонов, аксональный транспорт, дифференцировка . Регулируя эти процессы, CSN влияет на транскрипцию, фосфорилирование и стабильность белков [36].
cOP9 комплекс также регулирует деградацию белка, так как может влиять на активность cullin-RING-E3 убиктивиновой лигазы . С CSN взаимодействует свыше 50 белков, но только два с субъединицей CSN4: торсин А и тескалцин [27]. Тескалцин специфично взаимодействует с cSN4 через ее PcI домен по кальций-зависимому механизму Белок-белковое взаимодействие было показано при использовании рекомбинантных очищенных белков с помощью двугибридной дрожжевой системы и культур эукариотических клеток . Нокдаун тескалцина стимулирует активность CSN . Гомологи тескалцина CHP1 и CHP2 не взаимодействуют с COP9 комплексом В исследовании также показано, что тескалцин может взаимодействовать с CSN5, но взаимодействие слабее по сравнению с cSN4 Нокдаун те-скалцина вызывал изменение в уровне экспрессии факторов транскрипции p53 и c-Jun в эритролейкемических линиях клеток К562 и HEL [27].
Ассоциация тескалцина с онкологическими
заболеваниями
Потенциальное использование тескалцина в качестве маркера для диагностики и как эффективной онкомишени в случае рака толстой кишки (колоте-ральный рак, англ . ^^rectal cancer, CRC) получило недавно экспериментальное подтверждение ген TESC имеет высокий уровень экспрессии в тканях рака толстой кишки по сравнению с нормальными тканями человека В тканях и сыворотках, пораженных CRC, тескалцин сверхэкспрессируется, в то же время нокдаун TESC ингибирует Akt-зависимый NF-kB путь, предотвращая фосфорилирование основных белков пути, что не наблюдается в случае с контрольной киРНК. Akt-фосфорилирование и активация NF-kB и p65 снижены . Нокдаун тескал-цина уменьшает выживаемость раковых клеток in vitro . Применение киРНК, вызывающей нокдаун гена TESC, на 80% снижает развитие опухоли в случае рака толстой кишки [3]. Уровень экспрессии те-скалцина в раковых тканях значительно коррелирует с клинико-патологическими повреждениями тканей раковых больных: поражение лимфатических узлов, стадия Дюкса, глубина инвазии, степень дифферен-цировки опухоли В образцах сыворотки концентрация тескалцина в раковых тканях была больше, чем в нормальных, но между образцами разных стадий рака не было разницы в концентрациях тескалцина [3]
Тескалцин каким-то пока неясным образом влияет на экспрессию PTEN, супрессора большинства опухолей В то же время он влияет на клеточную пролиферацию, клеточный рост и онкогенность опухоли CRC . Авторы выдвигают гипотезу, что тескалцин может регулировать пролиферативную активность клеток рака толстой кишки через Akt-зависимый NF-kB сигнальный путь . Это позволяет предположить будущее использование тескалцина в качестве белка-он-комишени [3]
На данный момент отсутствует должная степень прогнозирования рака толстой кишки, и использование уровня экспрессии тескалцина в качестве маркера диагностики могло бы послужить увеличению эффективности прогнозирования CRC . Так, общая средняя выживаемость больных раком толстой киш-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Gutierrez-Ford C ., Levay K ., Gomes A .V . et al . Characterization of tescalcin, a novel EF-hand protein with a single Ca2+-binding site: metal-binding properties, localization in tissues and cells, and effect on calcineurin . Biochemistry 2003; 42(49): 14553-65 .
2 . Zhou Y ., Yang W ., Kirberger M . et al . Prediction of EF-hand calcium-binding proteins and analysis of bacterial EF-hand proteins . Proteins 2006; 65(3): 643-55 .
3 . Kang Y. H ., Han S . R ., Kim J .T . et al . The EF-hand calcium-binding protein tescalcin is a potential oncotarget in colorectal cancer . Oncotarget 2014; 5(8): 2149-60 .
4 . Henikoff S ., Greene E .A ., Pietrokovski S . et al . Gene families: the taxonomy of protein paralogs and chimeras . Science 1997; 278(5338): 609-14 .
5 . Kretsinger R . H ., Nockolds C . E . Carp muscle calcium-binding protein . II . Structure determination and general description . J . Biol . Chem . 1973; 248(9): 3313-26 .
6 . Lewit-Bentley A ., Rety S . EF-hand calcium-binding proteins . Curr . Opin . Struct . Biol . 2000; 10(6): 637-43 .
7 . Kawasaki H ., Nakayama S ., Kretsinger R . H . Classification and evolution of EF-hand proteins . Biometals 1998; 11(4): 277-95 .
8 . Falke J . J ., Drake S . K ., Hazard A. L . et al . Molecular tuning of ion binding to calcium signaling proteins . Q. Rev . Biophys . 1994; 27(3): 219-90
9 . Gifford, J . L ., Walsh M . P . , Vogel H . J . Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs . Biochemical J . 2007; 405(2): 199-221.
ки с высоким уровнем экспрессии тескалцина ниже выживаемости больных с низким уровнем экспрессии этого белка [3]
Взаимодействие тескалцина с NHE1 вовлечено в патогенез острого миелоидного лейкоза (FLT3-ITD + AML). Было показано, что в клеточных линиях острого миелоидного лейкоза MOLM-13 и MV4-11 тескалцин сверхэкспрессируется, а его нокдаун с помощью киРНК вызывает ацидоз и апоптоз раковых клеток . Кроме того, TESC — один из генов, экспрессия которого наблюдается в период формирования устойчивости раковых клеток к противоопухолевому препарату сорафенибу (Sorafenib) . Ингибирование NHE1 также вызывает подавление устойчивости и более продолжительный эффект от лечения сора-фенибом [37]
Заключение
Таким образом, показана ассоциация тескалци-на с онкологическими заболеваниями и возможность его применения в качестве диагностического онкомаркера Исследования показали его участие в развитии головного мозга человека и, на клеточном уровне, в процессе дифференцировки определенных клеток . Описано взаимодействие тескалцина с субъединицей 4 сигналосомы COP9, NHE1 и его участие в сигнальных путях митоген-активируемой протеин-киназы и регулируемой транскрипции генов . Для более глубокого понимания возможных молекулярных механизмов регуляции клеточных функций тескал-цина необходимы дальнейшие исследования
Благодарности
Работа финансировалась за счет гранта Российского фонда фундаментальных исследований 15-44-02509 р_поволжье_а. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности.
10 . Nagae M ., Nozawa A ., Koizumi N . et al . The crystal structure of the novel calcium-binding protein AtCBL2 from Arabidopsis thaliana. J . Biol . Chem . 2003; 278(43): 42240-6 .
11. Blanchard H ., Grochulski P ., Li Y . et al . Structure of a calpain Ca(2 + )-binding domain reveals a novel EF-hand and Ca(2 + )-induced conformational changes . Nat . Struct . Biol . 1997; 4(7): 532-8 .
12 . Jia J . , Tarabykina S . , Hansen C . et al . Structure of apoptosis-linked protein ALG-2: insights into Ca2+-induced changes in penta-EF-hand proteins . Structure 2001; 9(4): 267-75 .
13 . Grabarek Z . Structural basis for diversity of the EF-hand calcium-binding proteins . J . Mol . Biol . 2006; 359(3): 509-25 .
14 . Malmendal A ., Evenas J ., Forsen S . et al . Structural dynamics in the C-terminal domain of calmodulin at low calcium levels . J . Mol . Biol . 1999; 293(4): 883-99 .
15 . Biekofsky R . R ., Feeney J . Cooperative cyclic interactions involved in metal binding to pairs of sites in EF-hand proteins . FEBS Lett . 1998; 439(1-2): 101-6 .
16 . Finn B . E . , Kordel J ., Thulin E . et al . Dissection of calbindin D9k into two Ca(2 + )-binding subdomains by a combination of mutagenesis and chemical cleavage . FEBS Lett . 1992; 298(2-3): 211-4 .
17 . Linse S ., Forsen S . Determinants that govern high-affinity calcium binding . Adv . Second Mess . Phosph . Res . 1995; 30: 89-151.
18 . Perera E . M ., Martin H ., Seeherunvong T. et al . Tescalcin, a novel gene encoding a putative EF-hand Ca(2 + )-binding protein, Col9a3, and renin are expressed in the mouse testis during the early stages of gonadal differentiation . Endocrinology 2001; 142(1): 455-63
19 . Potter J . D . , Gergely J . The calcium and magnesium binding sites on troponin and their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase . J . Biol . Chem . 1975; 250(12): 4628-33 .
20 . Bhattacharya S ., Bunick C . G ., Chazin W . J . Target selectivity in EF-hand calcium binding proteins . Biochim . Biophys . Acta . 2004; 1742(1-3): 69-79 .
21. Malmendal A ., Linse S . , Evenäs J . et al . Battle for the EF-hands: magnesium-calcium interference in calmodulin Biochemistry 1999; 38(36): 11844-50 .
22 . Brodersen D . E ., Nyborg J ., Kjeldgaard M . Zinc-binding site of an S100 protein revealed . Two crystal structures of Ca2+-bound human psoriasin (S100A7) in the Zn2+-loaded and Zn2+-free states . Biochemistry 1999; 38(6): 1695-704 .
23 . Perera E . M ., Bao Y ., Kos L . et al . Structural and functional characterization of the mouse tescalcin promoter Gene 2010; 464(1-2): 50-62 .
24 Zozulya S , Stryer L Calcium-myristoyl protein switch PNAS USA 1992; 89(23): 11569-73 .
25 . Mailander J ., Muller-Esterl W . , Dedio J . Human homolog of mouse tescalcin associates with Na( + )/H( + ) exchanger type-1. FEBS Lett . 2001; 507(3): 331-5 .
26 . Li G . D ., Zhang X ., Li R . et al ., CHP2 activates the calcineurin/ nuclear factor of activated T cells signaling pathway and enhances the oncogenic potential of HEK293 cells . J . Biol . Chem . 2008; 283(47): 32660-8
27 . Levay K ., Slepak V . Z . Regulation of Cop9 signalosome activity by the EF-hand Ca2+-binding protein tescalcin . J . Cell . Sci . 2014; 127(Pt 11): 2448-59 .
28 . Levay K ., Slepak V.Z . Tescalcin is an essential factor in megakaryocytic differentiation associated with Ets family gene expression . J . Clin . Invest . 2007; 117(9): 2672-83 .
29 . Levay K ., Slepak V . Z . Up- or downregulation of tescalcin in HL-60 cells is associated with their differentiation to either granulocytic or macrophage-like lineage . Exp . Cell . Res . 2010; 316(7): 1254-62 .
30 . Li X., Liu Y., Kay C . M . et al ., The Na+/H+ exchanger cytoplasmic tail: structure, function, and interactions with tescalcin Biochemistry 2003; 42(24): 7448-56 .
31. Malo M . E ., Fliegel L . Physiological role and regulation of the Na+/ H+ exchanger. Can . J . Physiol . Pharmacol . 2006; 84(11): 1081-95 .
32 . Zaun H . C ., Shrier A ., Orlowski J . Calcineurin B homologous protein 3 promotes the biosynthetic maturation, cell surface stability, and optimal transport of the Na+/H+ exchanger NHE1 isoform . J . Biol . Chem . 2008; 283(18): 12456-67 .
33 . Dannlowski U ., Grabe H . J ., Wittfeld K . et al . Multimodal imaging of a tescalcin (TESC)-regulating polymorphism (rs7294919)-specific effects on hippocampal gray matter structure . Mol . Psychiatry . 2015; 20(3): 398-404 .
34 Ukarapong S , Bao Y , Perera E M et al Megakaryocyte development is normal in mice with targeted disruption of Tescalcin . Exp . Cell . Res . 2012; 318(5): 662-9 .
35 Wei N , Deng X W The COP9 signalosome Annu Rev Cell Dev . Biol . 2003; 19: 261-86 .
36 Kato J Y , Yoneda-Kato N Mammalian COP9 signalosome Genes Cells . 2009; 14(11): 1209-25 .
37 . Man C . H . , Lam S . S ., Sun M . K . et al . A novel tescalcin-sodium/ hydrogen exchange axis underlying sorafenib resistance in FLT3-ITD + AML . Blood . 2014; 123(16): 2530-9 .
Поступила: 06.12.2014
