CC BY
12
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2021; 66(8) DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-8-485-488
ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Куст А.В., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Воронин Д.Н.
РОЛЬ CD20+IL-10+ В-ЛИМФОЦИТОВ В ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ПРИВЫЧНОМ НЕВЫНАШИВАНИИ БЕРЕМЕННОСТИ
ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздрава РФ, 153045, Иваново, Россия
Цель работы - оценить уровень CD20+IL-10+ В-лимфоцитов у беременных женщин с угрозой прерывания беременности в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе и сопоставить полученные данные со сроком завершения гестации. Проведено обследование 65 женщин в сроке беременности 5-12 недель. Основную группу составили 33 женщины с угрожающим привычным выкидышем на момент обследования, группу сравнения - 10 первобеременных женщин с угрожающим спорадическим выкидышем на момент обследования, группу контроля составили 22 беременные женщины без признаков угрожающего выкидыша. Основная группа в зависимости от исходов беременности разделена на 2 подгруппы: подгруппа А - беременность закончилась самопроизвольным выкидышем или неразвивающейся беременностью (9 женщин), подгруппа В - беременность завершилась родами (24 женщины). Методом проточной цитофлуориметрии на FACSCanto II (Becton Dickinson, США) определялось относительное содержание CD20+IL-10+ В-лимфоцитов. Женщины основной группы имели значительно более низкий уровень CD20+IL-10+ В-лимфоцитов по сравнению с остальными обследованными. При ретроспективном анализе выявлено, что среди женщин подгруппы А отмечалось резкое снижение CD20+IL-10+ клеток по сравнению с подгруппой В. Прогнозирование неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша до 22 недель гестации у беременных с угрожающим самопроизвольным выкидышем и привычным невынашиванием беременности в анамнезе возможно при относительном содержании CD20+IL-10+ равном или менее 4,5 % (чувствительность 100%, специфичность 82,6%, точность 87,9%).
Ключевые слова: беременность; привычное невынашивание беременности; угроза прерывания; В-лимфоциты. Для цитирования: Куст А.В., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Воронин Д.Н. Роль CD20+IL-10+ В-лимфоцитов в иммунорегуляторных процессах при привычном невынашивании беременности. Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66 (8): 485-488. DOI: http: //dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-8-485-488
KustA.V., SotnikovaN.Y., MalyshkinaA.I., VoroninD.N.
ROLE OF CD20 + IL-10 + B-LYMPHOCYTES IN IMMUNOREGULATORY PROCESSES IN WOMEN WITH RECCURENT MISCARRIAGE
V.N. Gorodkov Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood, Ministry of Health of Russia, Ivanovo
To determine the level of CD20 + IL-10 + B-lymphocytes in pregnant women with the threat of termination ofpregnancy at 5-12 weeks and recurrent miscarriage in history and compare the data obtained with the end of gestation. A survey of 65 women at a gestational age of 5-12 weeks was carried out. The main group consisted of 33 women with a threatening recurrent miscarriage at the time of the examination, the comparison group consisted of 10 pre-pregnant women with a threatening sporadic miscarriage at the time of the examination, the control group consisted of 22 pregnant women without signs of a threatening miscarriage. The main group, depending on the outcomes of pregnancy, is divided into 2 subgroups: subgroup A - pregnancy ended in undeveloped pregnancy or miscarriage (9 women), subgroup B - pregnancy ended in childbirth (24 women). The relative content of CD20 + IL-10 + B-lymphocytes was determined by flow cytometry on FACSCanto II (Becton Dickinson, USA). Women in the main group had a significantly lower level of CD20 + IL-10 + B-lymphocytes in comparison with the rest of the surveyed. A retrospective analysis revealed that among women of subgroup A there was a sharp decrease in CD20 + IL-10 + cells compared with subgroup B. Prediction of a non-developing pregnancy and spontaneous miscarriage up to 22 weeks of gestation in pregnant women with threatened spontaneous miscarriage and a history of recurrent miscarriage is possible with the relative content of CD20 + IL-10 + equal to or less than 4.5%% (sensitivity 100%, specificity 82.6%, accuracy 87.9%).
Key words: pregnancy; recurrent miscarriage; threat of interruption; B-lymphocytes.
For citation: Kust A.V., Sotnikova N.Y., Malyshkina A.I., Voronin D.N. Role of CD20 + IL-10 + B-lymphocytes in immunoreg-ulatory processes in women with reccurent miscarriage. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66 (8): 485-488 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-8-485-488
For correspondence: KustA.V., graduate student of the Laboratory of Clinical Immunology; e-mail: avkMD@yandex.ru
Information about authors:
Kust A.V., http://orcid.org/0000-0002-1355-7225;
Sotnikova N.Y., http://orcid.org/0000-0002-0608-0692;
Malyshkina A.I., http://orcid.org/ 0000-0002-1145-0563;
Voronin D.N., http://orcid.org/ 0000-0003-2836-8694.
Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Received 05.03.2021 Accepted 05.05.2021
Для корреспонденции: Куст Алена Валерьевна, аспирант лаб. клинической иммунологии; е-mail: avkMD@yandex.ru
IMMUNOLOGY
Введение. Привычное невынашивание беременности остается актуальной проблемой современной репродуктивной медицины. В последние годы много внимания уделяется иммунологическим аспектам привычной потери беременности, затрагивающим различные звенья иммунной системы беременной женщины и занимающим лидирующее место в этиологии необъяснимых репродуктивных потерь [1]. В структуре иммунных нарушений при привычном невынашивании беременности выделают ауто - и аллоиммуные факторы. Аутоиммунный генез рецидивирующей потери беременности связан с утратой толерантности к аутоантигенам и усилением воспалительной реакции материнского организма [2].
Аллоиммунные причины привычного невынашивания обусловлены нарушением материнского алло-иммунного ответа, приводящие к отторжению полуал-логенного плода [3]. Проблема аллоиммунного генеза привычного невынашивания беременности, несмотря на пристальное внимание многих исследователей, в настоящее время остается нерешенной. Поскольку плод является полуаллогенным по отношению к материнскому организму, иммунная система беременной женщины должна поддерживать его толерантность, в то же время, обеспечивая его защиту от инфекционных агентов. Нарушение адаптации к иммунным реакциям, сопровождающим прикрепление, имплантацию, дальнейший рост и развитие плода может привести к возникновению осложнений беременности, в том числе и возникновению спорадического или привычного выкидыша [4].
В-лимфоциты являются важнейшим компонентом иммунной системы, выполняя функции выработки антител, антигенпредставляющую способность и секрецию иммуномодулирующих цитокинов. Доказано, что В-клетки с регуляторной функцией подавляют или снижают регуляцию негативных иммунные ответов, посредством продукции цитокинов, в частности IL-10, и взаимодействия с другими клетками врожденной и адаптивной иммунных систем. Представление о том, что продуцирующие IL-10 В-лимфоциты модулируют воспалительные процессы аутоиммунитета, позволяет предположить важную роль этих клеток в иммунологической адаптации при беременности [5]. По данным Esteve-Sole и соавт. [6], IL-10-продуцирующие В-лимфоциты, обладающие супрессорными свойствами, обеспечивают периферические механизмы толерантности к антигенам плода. Утверждалось, что IL-10 реализует свои имму-норегулирующие свойства при беременности за счет ингибирования синтеза провоспалительных цитокинов, в особенности TNF-a, а также отрицательной регуляции цитотоксичности маточных NK (uNK) клеток [7]. В литературе имеются данные существовании отдельной популяции В-лимфоцитов с регуляторными свойствами (Breg) [8,9].
В связи с этим, изучение уровня циркулирующих В-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-10 у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе в соответствии со сроком пролонгирования настоящей беременности, позволит судить об эффективности иммунорегуляторных механизмов в поддержании толерантности к полуалло-генному плоду.
Цель настоящего исследования: оценить уровень CD20+IL-10+ В-лимфоцитов у беременных женщин с угрозой прерывания беременности в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе и сопоставить полученные данные со сроком завершения гестации.
Материал и методы. Нами были обследованы 65 беременных женщин в сроке 5-12 недель. Основную группу составили 33 женщины с угрожающим привычным выкидышем на момент обследования, группу сравнения составили 10 первобеременных женщин с угрожающим спорадическим выкидышем на момент обследования, группу контроля составили 22 беременные женщины без признаков угрожающего выкидыша при постановке на учет по беременности. Основная группа в зависимости от исходов беременности разделена на 2 подгруппы: подгруппа А - беременность закончилась самопроизвольным выкидышем или неразвивающейся беременностью (9 женщин), подгруппа В - беременность завершилась родами (24 женщины). Все обследуемые дали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено на заседании Локального этического комитета ФГБОУ «Ивановского НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздрава РФ от 21.11.2018 г.
В исследование включены женщины, имеющие спонтанно наступившую одноплодную беременность, не имеющие тяжелой экстрагенитальной патологии, аутоиммунных заболеваний, обострения хронических и тяжелых аллергических заболеваний, острого инфекционного процесса на момент обследования. Из периферической венозной крови производилось выделение моно-нуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-уро-графин (d-1,078). Выделенные промытые лимфоциты окрашивались с помощью моноклональных антител анти-CD20, коньюгированные с FITC (Beckman Coulter, Франция) и анти-^-10 коньюгированные с РЕ (Beckman Coulter, Франция). Оценка внутриклеточной экспрессии IL-10 оценивалась в популяции CD20+ клеток в соответствии со стандартным протоколом внутриклеточного окрашивания с использованием набора для пермеа-билизации Intra Prep Permeabilizaton Reagent (Beckman Coulter, (Франция). В каждом образце анализировалось не менее 10 000 клеток. Анализ результатов проводили в программе BDFACS Diva Software (Bector Dickinson, США).
Статистическая обработка полученных данных производилась при помощи прикладных лицензионных программ: Microsoft Office 2010, Statistica for Windows 13.0. Данные представлены в виде средней величины (М) и стандартной ошибки средней (m), Расчет статистически значимых различий между данными с нормальным распределением оценивали по критерию Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Поиск точки разделения, расчет чувствительности и специфичности проводился на основании построения кривой операционных характеристик (ROC-анализ).
Результаты. Во всех исследуемых группах в CD20+ лимфоцитарном гейте В-лимфоцитов определялись клетки с фенотипом CD20+IL-10+. Женщины с привычным невынашиванием беременности и угрожающим выкидышем на момент обследования имели значительно более низкий уровень CD20+IL-10+ (5,43±0,49) по сравнению с группой контроля (11,6±1,2) и первобере-менными с угрожающим спорадическим выкидышем (6,77±1,26) (рис. 1).
По данным ретроспективного анализа, в периферической крови женщины подгруппы А отмечалось резкое снижение CD20+IL-10+ В-лимфоцитов 3,84±0,71 по сравнению с подгруппой В 6,07±0,40, (р<0,05). Такая
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2021; 66(8) РО!: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-8-485-488
ИММУНОЛОГИЯ
Рис. 1 Относительное содержание ГЬ-10+ В-лимфоцитов в периферической крови у женщин с угрозой прерывания беременности и привычным невынашиванием в анамнезе. По оси ординат - процентное соотношение CD20+IL-10+ в пуле CD20+ В-лимфоцитов.
существенная разница позволила разработать способ прогнозирования неразвивающейся беременности и самопроизвольного выкидыша в сроке до 22 нед беременности у женщин с угрожающим выкидышем в 5-12 нед и привычным невынашиванием в анамнезе - при уровне СБ20+^-10+ В-лимфоцитов равном или менее 4,5%, определенном в периферической крови в момент госпитализации прогнозируется неблагоприятный репродуктивный исход беременности - самопроизвольный выкидыш или неразвивающаяся беременность до 22 недель. По результатам ROC-анализа, площадь под ROC-кривой (АиС) составила 0,961 (рис.2), чувствительность способа составляет 100%, специфичность 82,6%, точность 87,9%) [10].
В группах контроля и сравнения также происходили неблагоприятные исходы беременности в виде самопроизвольных выкидышей и замерших беременностей, однако уровень СБ20+^-10+ В-лимфоцитов при этом не имел достоверных различий внутри групп по сравнению с беременными, чья беременность завершилась родами.
Обсуждение. ГЬ-10 является важным модулятором реакций врожденного и в адаптивного иммунного ответа, регуляция которых может приводить к развитию иммунной толерантности или ослаблению воспалительных реакций. ^-10 производится в основном моноцитами, регуляторными Т-клетками (Т^), регуляторными В-клетками (Breg), небольшой фракцией естественных киллеров (ЫК), макрофагами, дендритными (БС) клетками и врожденными лимфоидными клетками (ТЬС). Клетки Breg представляют собой субпопуляцию имму-носупрессивных В-клеток, регулируюющие чрезмерное воспаление за счет высвобождения ГЬ-10, который, в свою очередь, индуцирует дифференцировку регулятор-ных Т-клеток, ингибирует провоспалительные реакции
Рис. 2. ЯОС-анализ показателя относительного содержания СБ20+ГЬ-10+ лимфоцитов у женщин с угрозой прерывания беременности и привычным невынашиванием в анамнезе, беременность которых с репродуктивными потерями (самопроизвольным выкидышем или неразвивающейся беременностью) до 22 недель гестации.
и увеличивает выработку IgG4, а также подавляет активацию тучных клеток и выработку цитокинов [11].
Известно, что хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) оказывает стимулирующее влияние на В-лимфоциты, индуцируя продукцию ими ГЬ-10. В мировой литературе имеются экспериментальные данные об угнетении продукции ^-10 иммунными клетками трофобласта вследствие нейтрализации ХГЧ с помощью антител. Добавление рекомбинантного ХГЧ повышало синтез ^-10 Breg. Таким образом, ХГЧ играет важную роль в переключении В-клеток на регуляторный фенотип, необходимый для поддержания беременности [5]. В то же время, имеются данные, что количество Breg увеличивается в первом триместре беременности, подавляя тем самым нежелательные иммунные ответы материнских эффекторных Т-клеток. В то время как было выявлено, что у женщин, перенесших самопроизвольный выкидыш, имелось значительно более низкое содержание Breg по сравнению с женщинами, имеющими неосложненную беременность в первом триместре [12].
Заключение. Мы предполагаем, что дефицит продукции ^-10 В-лимфоцитами затрудняет дифферен-цировку до зрелых эффекторных форм - плазмоцитов, являющихся источником, в том числе и блокирующих антител класса G (aIgG) - факторов защиты семиалло-генного плода от реакций клеточной цитотоксично-сти и фагоцитов материнского организма [13]. Таким образом, выявленное существенное снижение ИЛ-10 продуцирующих В-лимфоцитов с регуляторными свойствами может лежать в патогенезе аллоиммунного выкидыша. Степень снижения СБ20+^-10+ клеток в периферической крови является отражением нарушений в репродуктивной системе материнского организма: меньший уровень ассоциировался с повторной потерей беременности.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
IMMUNOLOGY
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп .2-13 см .REFERENCES)
1. Батрак Н.В., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В. Роль CD178+ мононуклеарных клеток в развитии угрожающего позднего выкидыша у женщин с угрозой прерывания беременности в I триместре и привычным невынашиванием в анамнезе. Акушерство и гинекология. 2020; 5: 70-7.
10. Малышкина А.И. Сотникова Н.Ю., Воронин Д.Н., Куст А.В., Таланова И.Е. Способ прогнозирования репродуктивных потерь в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе. Патент РФ № 2746033; 2021.
REFERENCES
1. Batrak N.V., Malyshkina A.I., Sotnikova N.Yu., Kroshkina N.V. The role of cd178+ mononuclear cells in the development of threatened late abortion in women with first-trimester threatened pregnancy interruption and a history of recurrent miscarriage. Akusherstvo i Ginekologiya. 2016;7:5-10. (in Russian)
2. Grimstad F., Krieg S. Immunogenetic contributions to recurrent pregnancy loss. J. Assist. Reprod. Genet. 2016; 33(7):833-47. doi: 10.1007/s10815-016-0720-6.
3. Mekinian A., Cohen J., Kayem G., Carbillon L., Nicaise-Roland P., Gaugler B., Darai E., Bornes M., Fain O. Fausses couches précoces récurrentes inexpliquées : quelle est la place de l'immunomodulation? [Unexplained recurrent early miscarriages: Role of immunomodulation?]. Rev. Med. Interne. 2017 Apr; 38(4): 264-8. French. doi: 10.1016/j.revmed.2016.08.001.
4. Luo L., Zeng X., Huang Z., Luo S., Qin L., Li S. Reduced frequency and functional defects of CD4+CD25highCD127low/- regulatory T cells in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. ReprodBioLEndocrinol. 2020;18(1):62. doi: 10.1186/s12958-020-00619-7.
5. Fettke F., Schumacher A., Canellada A., Toledo N., Bekeredjian-Ding I., Bondt A., Wuhrer M., Costa S. D., Zenclussen A.C. Mater-
nal and Fetal Mechanisms of B Cell Regulation during Pregnancy: Human Chorionic Gonadotropin Stimulates B Cells to Produce IL-10 While Alpha-Fetoprotein Drives Them into Apoptosis. Front. Immunol. 2016; Dec 8;7:495. doi: 10.3389/fimmu.2016.00495.
6. Esteve-Solé A., Luo Y., Vlagea A., Deyá-Martínez Á., Yagüe J., Plaza-Martín A.M., Juan M., Alsina L. B Regulatory Cells: Players in Pregnancy and Early Life. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(7) :2099.
7. Danaii S., Ghorbani F., Ahmadi M., Abbaszadeh H., Koushae-ian L., Soltani-Zangbar M.S., Mehdizadeh A., Hojjat-Farsangi M., Kafil H.S., Aghebati-Maleki L., Yousefi M. IL-10-producing B cells play important role in the pathogenesis of recurrent pregnancy loss. Int. Immunopharmacol. 2020 Oct; 87: 106806. doi: 10.1016/j.in-timp.2020.106806.
8. Hosseini A., Dolati S., Hashemi V., Abdollahpour-Alitappeh M., Yousefi M. Regulatory T and T helper 17 cells: Their roles in pre-eclampsia. J. Cell. Physiol. 2018;233(9):6561-73. doi: 10.1002/ jcp.26604.
9. Furuzawa-Carballeda J., Hernández-Molina G., Lima G., Rivera-Vicencio Y., Férez-Blando K., Llorente L. Peripheral regulatory cells immunophenotyping in primary Sjogren's syndrome: a cross-sectional study. Arthritis. Res. Ther. 2013; 15(3): R68. doi: 10.1186/ ar4245.
10. Malyshkina A.I., Sotnikova N.Y., Voronin D.N., Kust A.V., Talanova I.E. A method for predicting reproductive losses before 22 weeks of pregnancy in women with threatened miscarriage and recurrent miscarriage in history. Patent RF № 2746033; 2021. (in Russian)
11. Boonpiyathad T., Satitsuksanoa P., Akdis M., Akdis C.A. Il-10 producing T and B cells in allergy. Semin. Immunol. 2019 Aug; 44: 101326. doi: 10.1016/j.smim.2019.101326.
12. Rolle L.1., Memarzadeh Tehran M., Morell-García A., Raeva Y., Schumacher A., Hartig R. et al. IL-10-producing regulatory B cells in early human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2013 Dec; 70(6): 448-53.
13. Gu J., Lei Y., Huang Y., Zhao Y., Li J., Huang T. et al, Fab fragment glycosylated IgG may play a central role in placental immune evasion. Hum. Reprod. 2015 Feb; 30(2): 380-91. doi: 10.1093/humrep/ deu323.
Поступила 05.03.21 Принята к печати 05.05.21
