CC BY
39
D4-14 a.qxd 02.12.2014 18:07 Page 19
THE ROLE OF MULTIWALL CARBON NANOTUBES IN THE GENOME DESTABILIZATION OF 3T3 CELLS
Mikhailenko V.M., Kovaleva O.A., Stepanenko N.S., Makovetska L.I.
РОЛЬ БАГАТОШАРОВИХ ВУГЛЕЦЕВИХ НАНОТРУБОК У ДЕСТАБІЛІЗАЦІЇ ГЕНОМУ КЛІТИН ЛІНІЇ 3Т3
МИХАЙЛЕНКО В.М., КОВАЛЬОВА О.А., СТЕПАНЕНКО Н.С., МАКОВЕЦЬКА Л.І.
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. РЄ. Кавецького НАН України, м. Київ
УДК575.224.23:620.3:661.8...62
Ключові слова: вуглецеві наночастинки, багатошарові вуглецеві нанотрубки, мікроядра, хромосомні аберації', дестабілізація геному.
ерспективи використання на-нотехнологій і наночастинок у побуті та медичній практиці значно підвищують ймовірність їх надходження до організму, накопичення та тривалий контакт з клітинами, що зумовлює актуальність досліджень їхньої токсичності і біосумісності. За даними BBC Research nanotechnology report, обсяг глобального ринку вуглецевих нанотрубок (ВНТ) у 2014 р. може скласти понад 1 млрд. доларів, з яких на частку багатошарових ВНТ (БшВНТ) припадає близько 90%. Якщо раніше ВНТ використовувалися переважно у виробництві електроніки, автомобільній, аерокосмічній та оборонній промисловості, то нині з'явилися такі нові сфери їх застосування, як одяг спеціального призначення, медицина та спортивні товари, на які сумарно припадатиме вже понад 30% від їхнього загального обігу.
Дані щодо біологічних ефектів ВНТ суперечливі. Вони мо-
жуть залежати від розміру, хімічного складу та модифікацій поверхні частинки. Розмір та форма наночастинки впливають на прояви специфічних фі-зико-хімічних та транспортних їхніх властивостей, нівелюючи або ж посилюючи поверхневі ефекти, хоча пріоритет у розвиткові токсичних ефектів за малих доз належить саме формі частинки [1]. Так, нанороз-мірний діаметр ВНТ та їхня голкоподібна форма роблять їх схожими на волокна азбесту, інгаляційна дія яких призводить до виникнення раку легень. Результати, отримані в експериментальних та епідеміологічних дослідженнях щодо впливу нанорозмірних забруднювачів повітря (пилу, мінеральних частинок та волокон), свідчать про високу ймовірність токсичної та/або канцерогенної дії новостворених на-ночастинок [2]. Їх медичне застосування та поширення у побуті і на робочому місці у комбінації з іншими шкідливими
РОЛЬ МНОГОСЛОЙНЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК В ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ГЕНОМА КЛЕТОК ЛИНИИ 3Т3 Михайленко В.М., Ковалева О.А., Степаненко Н.С., Маковецкая Л.И.
Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, г. Киев Целью работы было исследование цитогенетических изменений в клетках эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 (клон 31), подвергшихся воздействию многослойных углеродных нанотрубок. Материалы и методы исследования.
3T3 клетки обрабатывали многослойными углеродными нанотрубками в двух дозах (100 и 400 мкг/мл) в течение 24 и 48 часов. Цитогенетическое исследование включало анализ митотического режима, патологий митоза, подсчет клеток с преждевременной конденсацией хромосом, микроядрами, ядерными протрузиями. В метафазных пластинках были учтены модальный класс хромосом, полиплоидия, количество клеток
с хромосомными аберрациями и двойными минихромосомами, мультиаберрантные клетки. Результаты. Выявлено, что многослойные углеродные нанотрубки оказывали выраженное генотоксическое действие на клетки эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3, проявлявшееся в формировании микроядер и различных аномалий формы ядра. Высокие дозы многослойных углеродных нанотрубок приводили к торможению пролиферативной активности на стадии G2/M клеточного цикла и накоплению хромосомных аберраций и мультиаберрантных клеток. Через 48 ч многослойные углеродные нанотрубки вызывали задержку клеточного деления в профазе и метафазе, при увеличении дозы этот эффект усиливался. Выявленные цитогенетические изменения свидетельствуют о формировании генетической нестабильности в клетках при действии углеродных наночастиц.
Ключевые слова: углеродные наночастицы, многослойные углеродные нанотрубки, микроядра, хромосомные аберрации, дестабилизация генома.
© Михайленко В.М., Ковальова О.А., Степаненко Н.С., Маковецька Л.І. СТАТТЯ, 2014.
19 Environment & Health № 4 2014
D4-14 a.qxd 02.12.2014 18:07 Page 20
факторами можуть мати непе-редбачувані негативні наслідки для здоров'я, зокрема підвищувати ризик розвитку онкологічних захворювань.
БшВНТ здатні зв'язуватися з плазматичною мембраною макрофагів та порушувати цілісність мембран [3]. На клітинному рівні агрегати наночасти-нок спостерігають в ендосо-мах, мітохондріях та цитоплазмі, у тому числі і у навколоя-дерному просторі, що свідчить про переважно ендоцитозний шлях їх потрапляння. Певну кількість наночастинок було виявлено в ядрі та ядерці, де вони можуть взаємодіяти з ДНК. Наночастинки здатні викликати зміни енергетичного метаболізму, рівня вільних радикалів, пошкодження дНк, прямо або опосередковано сприяючи розвиткові оксида-тивного стресу та запальної відповіді [4]. При накопиченні у цитоплазмі клітин вони можуть контактувати з ДНК під час мітозу, коли цілісність ядерної
мембрани порушується, викликати аберації хромосом та оксидативний стрес, інгібувати процеси реплікації і транскрипції ДНК [5].
Мета роботи: дослідити вплив БшВНТ на цитогенетич-ні характеристики клітин ембріональних фібробластів миші лінії 3Т3.
Матеріали та методи.
БшВНТ були синтезовані в Інституті хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України. Їх отримували у вигляді агломератів — переплутаних між собою трубок з розмірами 20-500 мкм, середній діаметр складав 1020 нм, кількість шарів — 5-10. Для приготування суспензії БшВНТ гомогенізували у фізіологічному розчині за допомогою ультразвукового диспергатора УЗДН-2.
Клітини лінії 3Т3 (фібробласти миші, клон А31) перебували у контакті з різними дозами суспендованих БшВНТ (100 мкг/мл (БшВНТ100) та 400 мкг/мл (БшВНТ400) протягом 24 та 48 годин.
Для цитогенетичного аналізу 3Т3 клітини інкубували 40 хв у гіпотонічному розчині KCl (0,54%) ("Реахім", Україна) за температури +37°C. Клітини фіксували сумішшю метилового спирту ("Реахім", Україна) і оцтової кислоти ("Хімлаборре-актив", Україна) (3:1), тричі змінюючи фіксатор. Усі фіксовані клітинні суспензії капали на холодні мокрі скельця, висушували і фарбували барвником Гім-
за ("Sigma", ФРН). Цитогене-тичні препарати аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопа Сarl Zeiss, AxioStarPlus (ФРН) при збільшенні у 1000 разів.
Цитогенетична характеристика клітин передбачала визначення кількості мітозів, клітин з передчасною конденсацією хромосом (ПКХ), клітин з мікроядрами (КМЯ) та клітин з ядерними протрузіями (КЯП) (рис. 1), які розраховували на 1000 клітин і виражали у про-мілях (%о).
Мітотичний режим та патології мітозу розраховували на 300 мітозів і виражали у відсотках (%). У метафазних пластинках було враховано модальний клас хромосом, поліплоїдія, кількість клітин з хромосомними абераціями, подвійними мі-крохромосомами та мультиа-берантні клітини.
Статистичну достовірність оцінювали за t-критерієм Ст'юдента.
Результати та обговорення. Інтактні клітини лінії 3Т3 характеризуються цитогене-тичною нестабільністю, яка виражається у підвищеному рівні клітин з мікроядрами та клітин з аномаліями форми ядра. За дії БшВНТ100 вже за 24 години спостерігали достовірне накопичення КМЯ та формування ядерних протру-зій (табл. 1).
Відомо, що мікроядра утворюються у процесі клітинного поділу з ацентричних фрагментів, які виникають при розриві хромосом (кластогенний ефект), а також з відстаючих хромосом (анеугенний ефект). Мікроядра можуть також утворюватися шляхом немітотичної екструзії хроматину з інтерфазного ядра. Вони не містять ядерної оболонки, здатні до лізису або можуть включатися в ядро при подальшому мітозі. Накопичення КМЯ протягом 24 год не корелювало з дозою БшВНТ, однак більш тривала дія БшВНТ
Рисунок 1
Цитогенетичні характеристики клітин лінії 3Т3 за дії БшВНТ: а) мітоз, б) клітина з передчасною конденсацією хромосом, в) клітина з мікроядром, г) ядерна протрузія
Таблиця 1
Цитогенетичні характеристики клітин лінії 3Т3 за дії різних доз БшВНТ (%о)
ІК БшВНТ 100 БшВНТ400
24 год. 48 год. 24 год. 48 год. 24 год. 48 год.
ПКХ (ПКХ/мітоз) 3,0±1,0 (13%) 5,7±1,5 (60%) 5,0±1,0 (21%) 4,3±0,6 (72%) 9,7±3,2* (43%) 2,3±0,6* (88%)
КМЯ 8,7±3,0 5,0±1,0 21,0±2,6* 9,7±2,0* 6,3±2,5 10,3±2,5*
Мітоз 20,3±4,5 3,7±1,2 17,3±2,5 1,7±0,6 13,0±1,7 0,3±0,6*
КЯП 12,7±0,5 15,3±2,5 43,0±4,5* 27,7±2,0* 31,3±2,0* 31,7±2,5*
Примітка: * — Р<0,05.
№ 4 2014 Environment & Health 20
D4-14 a.qxd 02.12.2014 18:07 Page 21
THE ROLE OF MULTIWALL CARBON NANOTUBES IN THE GENOME DESTABILIZATION OF 3T3 CELLS Mikhailenko V.M., Kovaleva O.A.,
Stepanenko N.S., Makovetska L.l.
R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology. Oncology and Radiobioloav NAS of Ukraine. Kyiv The Objective to study the cytogenetic changes in the cells of mouse embryonic 3T3 fibroblasts (clone 31). exposed to multiwall carbon nanotubes. Materials and methods. 3T3 cells were treated with multiwall carbon nanotubes in two doses (100 and 400 mkg/ml) during 24 and 48 hours. Cytogenetic study involved an analysis of the mitotic regime and pathology of mitosis. fraction of cells with premature chromosome condensation. micronuclei and nuclear protrusions. Metaphase plates were analyzed for modal class of chromosomes. polyploidy. the number of cells with chromosome aberrations. double minichromosomes and
multiaberrant cells.
Results. Multiwall carbon nanotubes have a pronounced genotoxic effect on mouse embryonic 3T3 fibroblasts. which was accompanied by formation of micronuclei and various abnormalities of nuclear shape. High doses of multiwall carbon nanotubes caused inhibition of the proliferative activity on phase G2/M of cell cycle and accumulation of chromosome aberrations and multiaberrant cells. Multiwall carbon nanotubes caused the dose-dependent delay of cell division in prophase and metaphase during 48 hours. Registered cytogenetic changes indicate the formation of genomic disorders and genomic instability in the cells exposed to carbon nanoparticles.
Keywords: carbon nanoparticles, multiwall carbon nanotubes, micronuclei, chromosome aberrations, genome destabilization.
супроводжувалася збільшенням кількості КМЯ майже вдвічі.
До ядерних протрузій належать ядра з центральною круговою насічкою, гантелеподібні ядра, ядра атипової форми, ядерні структури за межами основного ядра, які з'єднуються з основним ядром. За даними літератури, знайдено пряму кореляційну залежність між частотою клітин з численними хромосомними абераціями і
клітинного циклу може призводити до збільшення частки анеу- і поліплоїдних клітин. Співвідношення клітин з ПКХ до загального пулу клітин, які діляться, було запропоноване як додаткова цитогенетична характеристика у прогнозі генетичної нестабільності клітинних популяцій [7]. У нашому дослідженні при збільшенні дози БшВНТ через 24 год відсоток клітин з ПКХ щодо загаль-
ної кількості мітозів збільшувався у 3,3 рази порівняно з контролем. Низька частота клітин з МЯ за високої дози БшВНТ може бути пов'язаною з затримкою клітинного поділу на стадії G2/M.
Більш тривала (48 год) експозиція клітин з БшВНТ призводила до дозозалежного пригнічення проліферативної активності 3Т3 клітин (табл. 1). Менша доза (100 мкг/мл) виклика-
Таблиця 2
Мітотичний режим та частота патологій мітозу клітин лінії 3Т3 за дії різних доз БшВНТ (%)
ІК БшВНТю0 БшВНТ400
24 год. 48 год. 24 год. 48 год. 24 год. 48 год.
Профаза 24,7±1,5 26,3±2,6 24,7±3,8 58,3±2,6* 22,0±2,6 75,5±2,0*
Метафаза 61,7±5,5 64,3±2,5 60,3±4,6 41,6±1,2* 64,3±4,0 24,3±2,0*
Анафаза 10,3±2,5 8,0±1,0 12,3±0,6 1,3±0,6* 10,3±3,5 1,0
Телофаза 3,3±1,5 1,7±0,6 2,7±1,5 0,3±0,6 3,3±1,5 0,3±0,6
Патології мітозу 6,7±1,5 н.в. 5,7±1,2 н.в. 5,7±1,2 н.в.
Примітка: н.в. — не визначали; * — Р<0,05.
частотою клітин з аномальною формою ядра [6]. Ядерні вирости пов'язують з механізмами позбавлення клітин надлишкової ампліфікованої ДНК. За дії БшВНТ400 протягом 24 годин достовірно збільшується частота ядерних протрузій та клітин з ПКХ порівняно з контролем. Поява клітин з ПКХ є одним з початкових етапів мітотичної катастрофи (МК), яка пов'язана з дефектом "точки перевірки" на стадії G2/M клітинного циклу (дисфункції білка р53, накопичення цикліну B1, активації cdc2 — циклін-залежної кінази) і є одним із джерел генетичної гетерогенності, імморталізації й адаптації клітинних популяцій пухлин до різних впливів. Ця патологія
21 Environment & Health № 4 2014
Рисунок 2
Співвідношення (48/24 год) частки клітин лінії 3Т3 у фазах мітозу за дії різних доз БшВНТ
D4-14 a.qxd 02.12.2014 18:07 Page 22
ла достовірне збільшення клітин з мікроядрами та ядерними протрузіями, однак не таке масове, як через 24 години, ймовірно, за рахунок затримки клітинного поділу. За дії більшої дози БшВНТ цитотоксичні та генотоксичні ефекти посилювалися.
При дослідженні мітотичного режиму інтактних клітин не виявлено змін у різні терміни їх культивування, як і не спостерігалося будь-яких змін у розподілі мітотичних клітин за фазами мітозу через 24 години експозиції клітин з різними дозами БшВНТ Однак через 48 годин зі збільшенням дози БшВНТ збільшується частка клітин на стадії профази, і, навпаки, зменшується частка клітин на стадіях метафази та анафази, а також майже зовсім не зустрічаються телофазні клітини (табл. 2, рис. 2).
Патології мітозу характеризували за наявністю кільцевих метафаз, відставанням однієї
або групи хромосом (Хр), розсіюванням, розтягуванням Хр, хроматидних мостів (рис. 3). Рівень патологій мітозу за дії різних доз БшВНТ через 24 год культивування майже не відрізнявся від значень в інтактних 3Т3 клітинах. У свою чергу, через 48 год культивування спостерігали досить низьку кількість мітозів і, таким чином, їхні патології не враховувалися.
Нами було також проведено аналіз каріотипових особливостей у метафазних пластинках лінії 3Т3 під впливом БшВНТ За даними літератури (http://www. atcc.org/ATCCAdvancedCatalog-Search/ProductDetails/ta-bid/452/Default.aspx?ATCCNum =CCL-92&Template=cellBiology), лінія 3Т3 — гіпер-триплоїдна лінія миші (2N=40), модальний клас нечіткий, кількість хромосом на метафазу коливається від 60 до 75.
У контрольних умовах за каріо-типовими характеристиками лінія 3Т3 відповідала даним літе-
ратури (68% метафаз містили від 62 до 74 Хр, а поліплоїдія складала 9%, (табл. 3, рис. 4, а).
У інтактних клітин лінії 3Т3 відмічено значний рівень хромосомних аберацій, до яких належать хромосомні, хрома-тидні аберації (рис. 5, а), кільцеві хромосоми, фрагменти (рис. 5, б), фрагментація Хр (рис. 5, в). Зустрічалися також метафази з подвійними мік-рохромосомами (рис. 5, в).
Згідно з даними літератури порушення нормальної структури хромосом і підвищений рівень рекомбінації у клітинах призводять до утворення даного типу аберацій [8]. З невисокою частотою у контрольній популяції зустрічаються також мультиаберантні метафази (рис. 4, б, в).
За дії БшВНТ100 вдвічі збільшувалася частота клітин з хромосомними абераціями та мі-ніхромосомами, а за дії БшВНТ400 — частота клітин з хромосомними абераціями та кількість мультиаберантних метафаз (табл. 3). Зі збільшенням дози звужувався модальний клас хромосом за рахунок збільшення кількості анеупло-їдних клітин.
Отже, зміна клітинної морфології, поява мультиаберантних клітин, зростання рівня хромосомних аберацій, які відбуваються вже через 24 год після дії БшВНТ, відображають початок МК, що відбувається за допомогою інших, ніж при апоптозі, внутрішньоклітинних механізмів. Феномен ПКХ, який тісно пов'язаний з клітинною загибеллю, вважається попередником МК. Клітини, з дефектом "точки перевірки” у періоді G2/M і зупинкою у мітозі, далі мають два шляхи: загибель у МК або затримку у фазі G2 з подальшою поліплоїдізацією і відновленням здатності до клітинного поділу [9]. Хоча і відомо, що частка клітин, які пережи-
Таблиця 3
Цитогенетичні аномалії у метафазах клітин лінії 3Т3 за дії різних доз БшВНТ
24 год ІК БшВНТю0 БшВНТ400
Модальний клас 62-74Хр(68%) 67-74Хр(65%) 68-74Хр(45%)
Поліплоїдія 9% 9,3% 8%
Клітини з ХА 24% 52%* 49%*
Клітини з мікроХр 10% 20%* 12%
Мультиаберантні 3% 3% 13%*
Примітка:* — Р<0,05.
Рисунок 3
Патології мітозу у клітинах лінії 3Т3 за дії БшВНТ: а) кільцева метафаза, б) відставання однієї Хр, в) відставання групи Хр, г) розсіювання Хр, д) розтягування Хр, е) хроматидний міст
в
№ 4 2014 Environment & Health 22
D4-14 a.qxd 02.12.2014 18:07 Page 23
ли блок у період G2/M клітинного циклу, дуже невелика, але феномен ПКХ може призвести до появи генетично гетерогенних популяцій, нових клонів з підвищеною стійкістю до зовнішніх умов.
Висновки
1. БшВНТ здійснювали виражений генотоксичний вплив на клітини ембріональних фібробластів миші лінії 3Т3, що проявлявся у формуванні мікроя-дер та різноманітних аномалій форми ядра. Високі дози БшВНТ викликали накопичення мультиаберантних клітин.
2. Тривала дія БшВНТ призводила до гальмування проліфе-ративної активності за рахунок затримки клітинного поділу на стадії G2/M клітинного циклу.
ЛІТЕРАТУРА
1. Cellular toxicity of carbon-based nanomaterials / Magrez A., Kasas S., Salicio V. et al. // Nano Lett. — 2006. — Vol. 6. — P.1121-1125.
2. Reviewing the environmental and human health knowledge base of carbon nanotubes / A. Hel-land, P Wick, A. Koehler et al. // Environ Health Perspect. — 2007. — Vol. 115 (8). — P 1125-1131.
3. Hirano S. Multi-walled carbon nanotubes injure the plasma membrane of macrophages /
S. Hirano, S. Kanno, A. Furuya-
ma // Toxicology and Applied Pharmacology. — 2008. — Vol. 232. — P 244-251.
4. Carbon Nanoparticles Impact on Energy Metabolism, Ge-notoxicity and Free Radicals Level / V. Mikhailenko, L. Ieleiko, A. Glavin, J. Sorochinska // Handbook of Free Radicals: Formation, Types and Effects / D. Kozyrev, V. Slutsky (eds.). — Nova Science Publishers, Inc. — 2009.— P 523-538.
5. The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt-chromium alloy on human fibroblasts in vitro / I. Papageorgiou, C. Brown, R. Schins et al. // Biomaterials. — 2007. — V. 28, №19. — P 2946-2958.
6. Ковалева О.А. Нехромосомный цитогенетический анализ соматических клеток млекопитающих / О.А. Ковалева, Н.А. Безденежных, Ю.И. Кудря-вец // Biopolymers and Cell. — 2013. — Vol. 29, № 1. — P 33-41.
7. Spontaneous premature condensation of chromosomes in normal and transformed mammal cells / O.A. Kovaleva,
T.T. Glazko, T.P Kochubey et al. // Experimental oncology. — 2007. — V. 29, № 1.— Р 18-22.
8. The consequences of structural genomic alterations in humans: genomic disorders, genomic instability and cancer /
R. Colnaghi, G. Carpenter, M. Volker, M. O'Driscoll // Semin Cell Dev Biol. — 2011. — Vol. 22, № 8. — P 875-885.
9. Erenpreisa J. Mitotic death: a mechanism of survival? A review / J. Erenpreisa, M.S. Cragg // Cancer Cell International. — 2001. — V. 1. — Р 1-7.
REFERENCES
1. Magrez A., Kasas S., Salicio V., Pasquier N., Jin Won Seo, Ce-lio M. et al. Nano Lett. 2006; 6 : 1121-1125.
2. Helland A., Wick P, Koehler A., Schmid K., Som C. Environ Health Perspect. 2007; 115(8) : 1125-1131.
3. Hirano S., Kanno S., Furuya-ma A. Toxicology and Applied Pharmacology. 2008; 232 : 244251.
4. Mikhailenko V., Ieleiko L., Glavin A., Sorochinska Ju. Carbon Nanoparticles Impact on Energy Metabolism, Genotoxicity and Free Radicals Level. In: Handbook of Free Radicals: Formation, Types and Effects (Kozyrev D., Slutsky V., eds.). Nova Science Publishers, Inc.; 2009 : 523-538.
5. Papageorgiou I., Brown C., Schins R., Singh S., Newson R., Davis S.A., et al. Biomaterials. 2007;28(19) : 2946-2958.
6. tovaleva О.А., Bezdenezhnykh NA, Кudriavez Yu.I. Biopolymers and Cell. 2013; 29 (1) : 33-41 (in Russian)
7. Kovaleva O.A., Glazko T.T., Kochubey TP, Lukash L.L., Ku-dryavets Yu.I. Experimental oncology. 2007; 29 (1) : 18-22.
8. Colnaghi R., Carpenter G., Volker M., O'Driscoll M. Semin Cell Dev Biol. 2011; 22(8) : 875-85.
9. Erenpreisa J., Cragg M.S. Cancer Cell International. 2001; 1 : 1-7.
Надійшла до редакції 17.05.2014
Роботу виконано за підтримки Державної цільової науково-технічної програми "Нанотехнології та наномате-ріали", проект № 5.18.5.46.
Рисунок 4
Поліплоїдна клітина (а), мультиаберантна метафаза (б) та її фрагмент (в) у клітинах лінії 3Т3 за дії БшВНТ
Рисунок 5
Фрагменти метафаз з хромосомними абераціями у клітинах лінії 3Т3 за дії БшВНТ: а) хроматичний розрив, б) фрагмент, в) фрагментація хромосоми (верхня стрілка), подвійні мініхромосоми (нижні стрілки)
23 Environment & Health № 4 2014
