CC BY
184
ОБЗОРЫ
РОЛЬ АПОПТОЗА В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА (СООБЩЕНИЕ 2)
А.Н. Богданов, Т.А. Камилова, В.Н. Цыган, Е.Н. Цыган Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург
Апоптоз cuHoeuajibHbix тканей при ревматоидном артрите Роль цитокинов
Одним из основных признаков ревматоидного артрита (РА) является экспансия фибробластопо-добных синовиоцитов. Аномальная пролиферация этих клеток и их резистентность к апоптозу обусловлены, по крайней мере, отчасти, присутствием в ревматоидных суставах провоспалительных цитокинов и ростовых факторов. Цитокиновый каскад играет центральную роль в событиях, регулирующих диф-ференцировку и клеточную смерть. Синовиальная гиперплазия как признак заболевания ассоциирована с повышенным уровнем цитокинов, который также характерен для РА. Современные данные о механизмах апоптоза при РА свидетельствуют о том, что молекулы TNF-семейства и другие цитокины и их рецепторы, про- и антиапоптозные пути, клеточные типы и процессы, зависящие от апоптоза (связанные с индукцией толерантности, подавлением воспаления и повреждением ДНК), играют фундаментальную роль в патогенезе РА. Молекулярные дефекты апоптоза на различных уровнях в клетках синовиальных тканей приводят к гиперпролиферации или гиперапоптозу. Знание механизмов нарушения апоптоза при РА помогает идентифицировать молекулы-мишени и клетки-мишени для доставки в них химических или биологических реагентов и модификации этих нарушений при целенаправленной терапии [29].
В крови и синовиальной жидкости больных РА определяются более высокие концентрации TNF , чем у больных остеоартрозом и здоровых доноров. Синовиоциты больных РА усиленно пролиферируют после воздействия TNFa. Эта пролиферация совпадает с подавлением экспрессии рецептора TNFR1 (TNF receptor 1) и усилением экспрессии рецепторов TNFR2 и TRAF1-6 (TNF receptor-associated factor 1-6), а также с активацией транскрипционного фактора NFkB и может быть ингибиро-
Адрес: С-Петербург, ул Боткинская, д. 20,
РВМА им. Кирова, кафедра факультетской терапии, тел. (412) 329-71-62.
вана трансфекцией доминантно-негативной мутантной формы гена, кодирующего белок 1кВ, ингибитор фактора NFaB. После обработки трансфек-тантов TNFa они претерпевают апоптоз. Это доказывает роль TNFa, действующего через NFKB-зависимый путь передачи сигналов от усиленно экспрессируемых рецепторов TNFR2 и TRAF1-6, в пролиферации и супрессии апоптоза синовиоцитов
[51].
Непосредственные контакты с активированными Т-лимфоцитами индуцируют продукцию TNFa и IL-lp в моноцитах, которые, в свою очередь, индуцируют функциональную активность фиброб-ластоподобных синовиоцитов и продукцию ими фактора SDF-la (stromal cell-derived factor-1 alpha), который защищает T- и В-клетки от апоптоза и усиливает их привлечение в место воспаления. Кроме того, TNFa и IL-ip индуцируют продукцию IL-15 в фибробластоподобных синовиоцитах. Последний индуцирует продукцию IL-17, потенцирующего продукцию TNFa и IL-ip моноцитами/макрофагами. Такая последовательность событий в регуляторной петле хронического воспаления подчеркивает ключевую роль TNFa и IL-ip в патогенезе РА и объясняет молекулярный механизм действия агентов, блокирующих активность этих цитокинов, в лечении РА. Факторы, способные блокировать индукцию цитокиновой продукции и влияющие на уровень активации Т-лимфоцитов (IFN-a , антагонисты IL-15 или SDF-la), препятствуют воспалительному процессу и могут оказаться полезными в лечении РА [5,35].
В связи с тем, что цитокин IL-15 продуцируется ревматоидными фибробластоподобными синовио-цитами и проявляет свойства антиапоптозного и ростового факторов, было выдвинуто предположение об участии 1L-15 в их активации. Действительно, ревматоидные фибробластоподобные синовиоциты экспрессируют цепи IL-15Ra , р и у, необходимые для формирования высокоаффинного функционального рецептора IL-15R. IL-15 усиливает пролиферацию фибробластоподобных синовиоцитов, повышает уровень мРНК ингибитора апоптоза белка Bcl-XL, а блокирование биологической активности IL-15 редуцирует эндогенную
экспрессию белков Вс1-2 и Bcl-XL и пролиферацию ревматоидных фибробластоподобных синовиоцитов, что проявляется усилением апоптоза. Таким образом, специфический фенотип ревматоидных фибробластоподобных синовиоцитов связан с аутокрин ной активацией рецепторов IL-15R продуцируемым ими цитокином 1L-15 [19].
Продуцируемые фибробластами и макрофагами и экспрессирующиеся в синовии цитокины IL-ip и TNFa аутокринно стимулируют эти клетки к продукции деструктивных ферментов [7,9]. В синовиальных фибробластах TNFa является позитивным регулятором пролиферации и продукции коллаге-назы, стромелизина и других ферментов, способствующих инвазии хряща и кости. Способность TNFa индуцировать такой широкий круг биологических эффектов зависит от его способности активировать ядерную транслокацию транскрипционного фактора NFkB. Передача сигнала при связывании TNFa с его рецептором TNFR приводит к фосфорилированию и протеосомной деградации ингибиторной молекулы 1кВ, которая связывает и удерживает в цитоплазме транскрипционный фактор NFkB [37,52].
В синовиальной жидкости и воспаленных тканях больных РА определяется повышенный уровень фактора TGFp (transforming growth factor beta), мультипотентного цитокина, который регулирует различные клеточные функции, включая дифференцировку, клеточный рост и выживание, адгезию и подвижность, оказывает пролиферативный и антиапоптозный эффект на синовиальные фибробласты и участвует в характерной для РА инвазии синовиального паннуса в окружающие хрящевые и костные ткани. Активированные фибробласты способствуют росту паннуса и деструкции хряща и кости, продуцируя матриксные металлоп-ротеиназы (matrix metalloproteinases, ММР), колла-геназу и стромелизин [16].
Из синовиальной ткани больных РА изолирован новый моноцитарный хемокин, гомодимер рибо-сомального белка S19 (RP S19). Он обусловливает специфический моноцитарный хемотаксис in vitro и преобладающую моноцитарную инфильтрацию in vivo благодаря своему агонистическому и антагонистическому взаимодействию с рецепторами С5а моноцитов и полиморфноядерных лейкоцитов соответственно. С5а - лейкоцитарный хемотаксичес-кий фактор, фрагмент С5-комплемента. Димер RP S19 продуцируется и высвобождается апоптозными клетками и привлекает в апоптозное поражение моноциты из циркуляции. Инфильтрирующие моноциты/макрофаги поглощают апоптозные клетки, переносят через лимфоток в региональные лимфоузлы и презентируют антигенную информацию апоптозных клеток Т-лимфоцитам. Таким образом система клиренса апоптозных клеток соединяется с системой приобретенного иммунитета. Врожден-
ные и приобретенные иммунные механизмы, опосредованные димером RP S19, участвуют в патологии необратимого хронического воспаления при РА 146].
В исследованиях на экспериментальных моделях установлено, что член TNF-семейства проа-поптозный лиганд TRAIL/Apo2L (TNF-related apoptosis-inducing ligand) при PA является противовоспалительным цитокином. Экспрессию на синовиальных фибробластах и функцию его рецепторов TRAIL-R1 (DR4) и TRAIL-R2 (DR5), молекулы которых содержат домены смерти, изучали с помощью специфичных для них моноклональных антител. Синовиальные ткани и фибробласты, изолированные у пациентов с РА, избирательно экспрессировали повышенный уровень DR5 по сравнению с больными остеаортрозом (ОА) и были высокочувствительными к апоптозу, индуцированному анти-DRS-антителами (TRA-8). In vitro TRA-8 вызывают апоптоз в синовиоцитах, изолированных у пациентов с РА, и ингибируют продукцию ММР, индуцированную провоспалительными цитокинами. In vivo TRA-8 не только эффективно ингибируют пролиферацию РА-синовиоцитов, но и полностью предотвращают эрозию кости и деструкцию хряща, индуцированные этими клетками. Таким образом, пролиферирующие синовиоциты при РА характеризуются повышенной экспрессией DR5 и чувствительностью к DRS-зависимому апоптозу. Aнти-DR5-aнтитeлa могут составить основу нового подхода к терапии РА [13].
Описана попытка элиминировать гиперпласти-ческую синовию с помощью аденовирусного вектора Ad.TRAIL, экспрессирующего ген цитокина TRAIL. Трансфекция синовиальных клеток, полученных у больных РА, вектором Ad.TRAIL вызывает значительный апоптоз в клетках трех из пяти клеточных линий. В экспериментальной модели РА (кролик) внутрисуставной генный трансфер лиганда TRAIL редуцировал лейкоцитарную инфильтрацию и индуцировал апоптоз синовиоцитов, регресс паннуса и регенерацию хряща [Q. Yao et al., 2003]. Подтвердить потенциальное терапевтическое значение TRAIL при РА у человека пока не удалось, так как эктопическая экспрессия лиганда TRAIL в синовиальных фибробластах больных РА не влияет на выживаемость клеток.
Fos-зависимый апоптоз синовиоцитов
В последние годы многие исследователи анализировали различные проапоптозные гены, кодирующие белки FasL, Fas, каспазы, Вах и другие, анти-апоптозные гены, кодирующие ингибиторы каспаз и белки семейства Вс1-2 у пациентов с аутоиммунными болезнями. Было показано, что FasL/Fas-3a-висимый апоптоз синовиальных фибробластов ингибирован при РА, что ведет к гиперплазии синовии [30].
Синовиальные клетки больных РА экспрессируют рецептор Fas, а инфильтрирующие синовию лимфоциты - его лиганд FasL, однако повышенные концентрации провоспалительных цитокинов TNFa и IL-ip ингибируют Fas-зависимый апоптоз синовиоцитов. Это сопровождается усилением экспрессии белка Вс1-2 и подавлением экспрессии каспазы 3, способствуя формированию паннуса и деструкции суставов у пациентов с РА [44].
Для изучения механизмов нарушений Fas-зависимого апопоза синовиоцитов при РА исследовали вовлечение в этот процесс каспаз [каспазы 1/ICE (interleukin-Ip converting enzyme), каспазы 3/CPP32/apopain и каспазы 8/FLICE (FADD-like interleukin-lp -converting enzyme] и адапторного белка FADD (Fas-associated death domain), формирующего апоптозный сигнальный комплекс DISC (death-inducing signalling complex). Оказалось, что ревматоидные синовиоциты экспрессируют более высокий уровень каспаз 3 и 8, а также белка FADD по сравнению с синовиоцитами при ОА. Специфические ингибиторы каспаз 3 и 8 супрессируют индуцированный FasL/Fas-взаимодействием апоптоз ревматоидных синовиоцитов, причем ингибитор каспазы 8 супрессирует активацию каспазы 3. Таким образом, Fas-зависимый апоптоз синовиоцитов регулируется привлечением FADD в DISC-комплекс с последующей активацией каскада FADD/caspase-8/caspase-3 [34].
В синовиальной жидкости больных РА обнаружен значительно более высокий уровень растворимых (расщепленных) форм Fas и FasL (sFas и sFasL) [6] и матриксных металлопротеиназ, чем у больных ОА. При этом концентрация sFasL значительно выше у пациентов с тяжелой формой РА, чем с легкой формой РА или при ОА, тогда как только мембраносвязанный FasL способен индуцировать апоптоз синовиальных клеток [11]. Различная цитолитичес-кая активность мембраносвязанного FasL и растворимого sFasL против синовиальных клеток, очевидно, регулирует Fas-зависимый апоптоз. Концентрация ММР-3 (стромелизин-1) в синовиальной жидкости коррелирует с уровнем sFasL и активностью заболевания. ММР-3 способна расщеплять FasL, экспрессирующийся на клеточной поверхности, и продуцировать sFasL [23].
Уровень оксида азота (N0), который считается важным медиатором воспаления, повышен в сыворотке и синовиальной жидкости больных РА [43]. NO ингибирует апоптоз синовиоцитов, что доказано в экспериментах in vitro. Инкубация синовиальных клеток в среде с донором N0 S-HHTpo-N-аце-тилпеницилламином предотвращает Fas-зависимый апоптоз, ингибируя активацию каспазы 3, которая необходима для Fas-индуцированного апоп-тоза. При этом N0 не препятствует Fas-индуцированной активации каспазы 8 и выходу цитохрома С из митохондрий в цитозоль [27].
Экспрессия проапоптозного белка Вах в сино-виоцитах больных РА выше, чем у здоровых людей, а в местах деградации хряща встречается также сильное окрашивание хондроцитов на Вах. Это означает, что, несмотря на важную роль апоптозных механизмов в патогенезе суставного поражения, активность белка Вах не оказывает существенного влияния на синовиальную гиперплазию при РА [12].
Роль генетических факторов
Соматические мутации белка р53, характерные для злокачественных опухолей, присутствуют и в ревматоидных синовиоцитах [3,50]. Фибробласто-подобные синовиоциты, лишенные функционально активного р53, отличаются большей скоростью пролиферации, большей инвазивностью в хрящ и меньшей чувствительностью к апоптозу. Их пролиферативный ответ на IL-ip и TGFp подобен имеющемуся у нормальных клеток, но ответ на действие тромбоцитарного ростового фактора PDGF (platelet-derived growth factor) значительно сильнее [3]. Гиперэкспрессия нормального (немутантного) р53 в синовиальных клетках человека и кролика приводит к их значительному апоптозу in vitro, а инъекция экспрессирующего белок р53 аденовирусного вектора в коленные суставы кролика -к быстрой индукции массивного синовиального апоптоза in vivo, а также к значительной редукции лейкоцитарной инфильтрации, но не влияет на метаболизм хряща. Таким образом, внутрисуставной трансфер гена р53 помогает не только индуцировать синовиальный апоптоз, но и редуцировать ревматоидное воспаление [50].
Известно, что генотоксический стресс может вызывать соматические мутации гена р53 в тканях разных типов, включая синовию. Такие мутации продемонстрированы в синовиоцитах при РА. В частности, мутации типа транзиций в гене р53 являются характерным повреждением ДНК, обусловленным воспалительным оксидативным стрессом. В некоторых зонах синовии наблюдаются мутантные по р53 субклоны, что подтверждает олигокло-нальную экспансию синовиоцитов. В соответствии с тем, что экспрессия гена IL-6 негативно регулируется нормальным, немутантным, белком р53, такие зоны содержат значительно большее количество мРНК IL-6, чем зоны с нормальным р53. Это обеспечивает мутантным клонам селективное ростовое преимущество. Небольшое число клеток с мутацией в гене р53 может влиять на смежные клетки и усиливать выработку провоспалительных цитокинов [47].
TNFa дозозависимо усиливает связывание р53 с ДНК, но ослабляет его транскрипционную активность. Так как активация р53 нуждается в привлечении белка СВР [CREB (cAMP responsive element binding protein) binding protein] в качестве ко-акти-
ватора, интересно было изучить его влияние на TNFa -индуцированное подавление транскрипционной активности р53. Действительно, гиперэкспрессия СВР индуцирует транскрипционную активность р53, лишает TNFa ингибирующего действия и усиливает TNFa -индуцированный апоптоз. Автономное TNFa -индуцированное аце-тилирование ядерного белка р53, характерное для ревматоидных синовиоцитов, ослабляет его транскрипционную активность в связи с истощением белка СВР. Следовательно, регуляция данного транскрипционного ко-активатора может составить основу новой стратегии лечения РА [32].
Инактивация р53 способствует инвазивности фибробластоподобных синовиоцитов, усиливая экспрессию ими ферментов, деградирующих хрящевую ткань. Экспериментальные исследования по генному трансферу на моделях РА показали, что трансфер нормального, неповрежденного, гена р53 в синовиоциты имеет клинические перспективы для лечения больных РА [40].
Ингибиторы апоптоза
Несмотря на экспрессию FasL на синовиальных мононуклеарах и наличие в ревматоидной синовиальной ткани повышенной концентрации IL-ip и/или TNFa, известных как индукторы апоптоза, синовиальные клетки редко претерпевают апоптоз при РА. Это наводит на мысль об апоптозной резистентности, вызванной гиперэкспрессией антиа-поптозных молекул, в частности, TNFa -индуци-бельного специфического ингибитора апоптоза ревматоидных синовиоцитов, члена 1АР-семейства белка XLAP (X-linked inhibitor of apoptosis proteins)
[52]. Кроме того, синовиальные фибробласты защищает от апоптоза антиапоптозный модулятор Fas-сигналинга белок FLIP (Fas-associated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme inhibitory protein) [4]. Экспрессия мРНК ингибитора каспазы 8 белка FLIP, отсутствующая в нормальных контрольных образцах, обнаружена во всех тестированных биоптатах синовиальной ткани больных РА и ОА. При РА экспрессия FLIP значительно выше, чем при ОА, и обнаруживается в местах хрящевой инвазии и костной деструкции. Синовиальные фибробласты, локализующиеся в зонах хрящевой и костной деструкции, секретируют матрикс-деградирующие ферменты (металлопроте-иназы и катепсины). Экспрессия FLIP продлевает жизнь клеток, секретирующих эти ферменты, и способствует разрушению сустава. Экспрессию FLIP индуцирует TNFa, который может не только индуцировать апоптоз, но и вызывать резистентность к нему. Это показывает, что подавление Fas-зависимого апоптоза цитокином TNFa может быть не связано с уровнем экспрессии Fas [39].
В клетках синовиальных тканей продемонстрирована экспрессия антиапоптозных белков Вс12 и
сентрина-1 (sentrin 1) [8]. Антиапоптозная молекула сентрин-1, которую кодирует ген SUMO-1 (sen-trin-l/small ubiquitin-like modifier), взаимодействует с рецепторами Fas и TNFRI и защищает клетки от апоптоза, индуцированного анти-Рая-антителами и TNFa. Заметная экспрессия мРНК сентрина-1 обнаружена во всех образцах синовии, преимущественно в синовиальной жидкости и в сайтах инвазии синовии в хрящ, тогда как в нормальных синовиальных тканях она не определяется. Сентрин-1 удлиняет срок жизни инвазивных, разрушающих хрящ синовиальных фибробластов [4].
С помощью антител против ревматоидных синовиальных клеток идентифицирован и клонирован ген Hrdl/synoviolin, который кодирует убикви-тинлигазу-ЕЗ и экспрессируется на высоком уровне в ревматоидной синовии. У мышей с гиперэкспрессией этого фермента развивается спонтанная арт-ропатия. Мыши, гетерозиготные по гену Hrdl/synoviolin, резистентны к коллаген-индуцированному артриту в связи с усиленным апоптозом синовиальных клеток. Следовательно, убиквитинлигаза-ЕЗ обладает антиапоптозным действием на синовиальные клетки и может быть мишенью терапевтической стратегии при РА [2].
Адгезионные молекулы
Адгезионные молекулы облегчают миграцию клеток в сустав и прикрепление синовии к кости и хрящу, поэтому их ингибирование имеет терапевтический потенциал при РА [7].
Синовиальные клетки взаимодействуют с воспалительными клетками и экстраклеточным матриксом посредством адгезионных молекул семейства интегринов. При РА на синовиальных клетках экспрессируется pl-интегрин. Связывание р1-ин-тегрина матриксными лигандами представляет собой проапоптозный сигнал, передаваемый через протеинкиназный каскад сигнальной трансдукции и усиливающий экспрессию белков ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) и Fas, Fas-зависимый апоптоз синовиальных клеток, что может привести к спонтанной остановке роста [31].
Синовиальные клетки больных РА состоят из двух функционально различных субпопуляций: активные (пролиферирующие) и апоптозные клетки. Экспрессия ICAM-1 и Fas in vivo отмечена в основном в синовиааьном слое. Экспрессия рецептора Fas in vitro выше в ICAM-1-позитивных синовиальных клетках, чем в ICAM-1-негативных. Функциональная и фенотипическая гетерогенность ICAM-1-позитивных и ICAM-1-негативных клеткок подчеркивается различиями по пролиферативному статусу. ICAM-1-позитивные клетки останавливаются в фазе G0/G1 клеточного цикла и затем переходят в состояние апоптоза, тогда как ICAM-1-негативные клетки находятся преимущественно в пролиферативной S- или С2/М-фазе. В ICAM-1-
позитивных клетках усилена экспрессия р53 и его эффектора белка р21. Очевидно, различия в регуляции клеточного цикла, основанные на ICAM-1-статусе, являются важными детерминантами продолжительности жизни, пролиферации и остановки роста ревматоидных синовиоцитов [41].
Роль некоторых сигнальных молекул
Компоненты сигнальных путей, такие как про-теинкиназы PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase) и Akt (activation of protein kinase В), транскрипционные факторы NFkB (nuclear factor kappa В) и STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), активированы и экспрессируются на высоком уровне в суставах больных РА. Они защищают синовиальные фибробласты от апоптоза [4], способствуют экспрессии не только генов, обусловливающих воспаление и деструкцию тканей, но и множества ан-тиапоптозных молекул, включая FLIP, Bcl-2 и Мс1-
1. Индукция апоптоза макрофагов, синовиальных фибробластов или лимфоцитов, супрессируя либо эти сигнальные пути, либо экспрессию антиапоп-тозных молекул, могла бы привести к улучшению состояния пациентов с РА [20].
Дерегулированный рост синовиальных фибробластов вторичен по отношению к накоплению клеточных дефектов и продукции аутокринно действующих ростовых факторов. Многие цитокины и ростовые факторы, экспрессируемые в воспаленной синовии при РА, включая IL-6, EGF (epidermal growth factor) и тромбоцитарный фактор роста PDGF (platelet-derived growth factor), активируют транскрипционный фактор STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), вовлеченный в мито-генную сигнальную трансдукцию. Роль белка STAT3 в аномальном росте и повышенной жизнеспособности синовиоцитов при РА доказана с помощью ретровирусного генного трансфера доминантно-негативного мутантного аллеля гена STAT3, получившего название STAT3-YF. Повышение в 35 раз экспрессии STAT3-YF эффективно блокирует эндогенную активацию STAT3 и БТАТЗ-зависимую генную экспрессию, включая экспрессию онкогенов. Взятые у больных РА и трансфектированные мутантом STAT3-YF синовноциты неспособны расти в культуре и погибают путем спонтанного апоптоза. Нейтрализация функции STAT3 превращает EGF из фактора роста/выживания в фактор смерти ревматоидных синовиоцитов, что делает его привлекательной мишенью генной терапии [18].
Транскрипционный фактор NFkB - основной медиатор воспалительного ответа. Активация NFkB ассоциирована с РА. In vitro NFkB контролирует экспрессию ряда воспалительных молекул в синовиоцитах и защищает их от цитотоксического действия TNFa и FasL. Супрессия фактора NFkB in vivo ингибиторами протеосомы либо внутрисус-
тавным генным трансфером его ингибитора - 1кВ усиливает апоптоз в синовии крыс с экспериментальным артритом. Следовательно, активация фактора NFkB защищает клетки от апоптоза. Внутрисуставное введение супрессоров NFkB предотвращает рецидив артрита в этих суставах. Степень тяжести заболевания значительно снижается и в не-леченных суставах, что указывает на системный терапевтический эффект локальной супрессии фактора NFkB [24].
Одним из факторов, способствующих развитию РА и синдрома Шегрена, является вирус HTLV-I (Human T-lymphotropic virus type I), который стимулирует ядерную транслокацию транскрипционного фактора NFkB. Это приводит к подавлению апоптоза клеток хозяина и может ускорить аутоиммунный процесс [15].
Инкубация синовиоцитов с TNFa или IL-ip стимулирует транслокацию в ядро и активность NFkB. Небольшое количество апоптозных синовиальных клеток обнаружено после обработки клеточной культуры ингибитором ядерной транслокации фактора NFkB. Хотя TNFa и IL-ip сами не вызывают апоптоз ревматоидных синовиоцитов, индуцированный ингибитором ядерной транслокации NFkB, апоптоз в стимулированных TNFa или IL-lp синовиоцитах заметно усилен по сравнению с нестимулированными клетками. Ингибирование ядерной транслокации NFkB усиливает активацию каспазы 3 и индукцию апоптоза синовиальных клеток анти-РаБ-антителами. Таким образом, ингибирование транскрипционной функции фактора NFkB может корректировать дисбаланс между апоптозом и пролиферацией синовиоцитов в ревматоидной синовиальной ткани [48].
Некоторые вторичные липидные мессенджеры являются важными медиаторами экстраклеточных сигналов. К ним относится церамид, который образуется из сфингомиелина клеточных мембран и влияет на передачу апоптозного сигнала через рецепторы цитокинов TNFa, IL-ip и FasL, экспрессируемые на ревматоидных синовиоцитах. Культивирование синовиальных фибробластов с церами-дом генерирует необратимые, характерные для апоптоза, фрагментацию ДНК и морфологические изменения клеток [28]. Внутрисуставное введение церамида Fas-дефицитным мышам приводит к индукции апоптоза клеток синовии и уменьшению их гиперплазии [14].
Синовиальные клетки больных РА стимулировали ростовым фактором PDGF в присутствии и в отсутствии церамида. Предварительная обработка ревматоидных синовиоцитов церамидом полностью ингибирует индуцированную PDGF прогрессию клеточного цикла, фосфорилирование и активацию сигнальных протеинкиназ Akt, МЕК и ERK1/2. Ингибирование антиапоптозных киназ, таких как Akt и ERK1/2, может быть механизмом
проапоптозного действия церамида на ревматоидные клетки [26]. В настоящее время исследования направлены на установление специфической роли этих молекул в регуляции апоптоза ревматоидных фибробластов и идентификацию потенциальных молекулярных мишеней терапии.
Остеопороз
Резистентность к апоптозу синовиальных фибробластов тесно связана с прогрессивной деструкцией суставного хряща. Ключевым медиатором всех форм костных осложнений при РА являются остеокласты. Фактор диффе-ренцировки остеокластов, белок RANKL (receptor activator of NFkB ligand), известный как лиганд остеопротеге-рина, является фактором эрозии кости при РА. Активированные синовиальные Т-клстки экспрессируют как мембраносвязанную, так и растворимую формы этого белка. В ревматоидной синовии источником RANKL служат также фибробласты. Кроме того, TNFa и IL-ip стимулируют продукцию 1L-6. IL-P и RANKL стромаль-ными клетками и остеобластами. В присутствии пермис-сивного уровня RANKL TNFa непосредственно стимулирует дифференцировку макрофагальных и миелоид-ных клеток-предшественников в остеокласты. Кроме того, TNFa индуцирует выброс синовиальными фиброб-ластами и макрофагами IL-ip, который вместе с RANKL является основным фактором выживания и активации остеокластов. Следовательно, TNFa и IL-lp, действуя совместно с RANKL, могут промотировать привлечение и активацию остеокластов и остеолизис при РА. Таким образом, связь между Т-клеточной активацией, гиперпродукцией TNFa и RANKL/RANKL-рецепторной системой обусловливает развитие скелетной патологии при РА (38, 42].
В суставах больных РА наблюдается апоптоз хондро-цитов. Во всех образцах хондроцитов обнаружена мРНК антигена Fas. Большинство хондроцитов экспрессирует его на клеточной поверхности. Тем не менее обработка хондроцитов анти-Fas-антителами не индуцирует значимого апоптоза в этих клетках in vitro, так как хондроциты экспрессируют также ингибитор Fas-зависимого апоптоза белок FLIP. В этой связи активация каспазного каскада в них минимальна [21].
Ангиогенез
Нарушения ангиогенеза могут поддерживать хроническое синовиальное воспаление при РА. Эндотелиальные пролиферация и апоптозный индекс повышены в синовии больных РА. Клеточная смерть отмечается в местах, где экспрессия VEGF (vascular endothelial growth factor) и аУрЗ-интегри-на слаба или отсутствует. Баланс между ангиогенезом и васкулярной регрессией при ревматоидном синовите предопределяется локальной экспрессией эндотелиальных факторов выживания [45].
Неоангиогенез при РА сходен с таковым при раке и, как и синовиальная гиперплазия, характерен для РА. Эндостатин, который ингибирует ангиоге-нез-зависимый опухолевый рост и считается противоопухолевым средством, уменьшает объем имплантированной мышам линии SCID (severe com-
bined immunodeficiency) ревматоидной синовиальной ткани человека. При этом происходит дозозависимое уменьшение количества макрофагов, лимфоцитов и микрососудов, а число апоптозных клеток в ревматоидной синовии увеличивалось. Следовательно, антиангиогенное воздействие потенциально применимо при лечении больных РА [22].
Многие ростовые факторы и факторы клеточного выживания передают свои сигналы в клетку через тирозинкиназные рецепторы. Экспрессия ти-розинкиназного рецептора А\1 показана в ревматоидной синовии, капиллярном эндотелии, клетках гладкой мускулатуры артериол и вен. Ген Gas6 (growth arrest-specific gene 6) кодирует лиганд рецептора Axl, который обнаружен в синовиальных жидкости и ткани больных РА. Лиганд Gas6 связывается с мембраносвязанным рецептором Avl, а растворимый Axl ингибирует это связывание. Экзогенный Gas6 защищает эндотелий от апоптоза, индуцированного удалением ростовых факторов и TNFa -опосредованной цитотоксичности [33].
Апоптоз и лечение РА
Лечение рефрактерного РА включает высокие дозы глюкокортикоидов, цитостатиков и сочетанное использование этих препаратов. У многих пациентов применение этих программ затруднено в связи с токсичностью. Прогресс в знании патогенных молекулярных событий, приводящих к развитию РА, способствует развитию новых терапевтических подходов. Примером может служить создание специфических моноклональных антител (например, против TNFa) или рекомбинантных TNF-рецепторов, самостоятельно или в комбинации с метотрексатом проявляющих эффективность в лечении больных РА. Антицитокиновая терапия, основанная на использовании рекомбинантных антагонистов IL-1 , IL-10, их рецепторов и Т-клеточных ко-стимуляторных молекул, также подавляет воспалительные процессы, индуцируя апоптоз в синовиальных тканях [1].
D-пеницилламин в соединении с сульфатом меди ингибирует клеточный рост множества клеточных типов. Хотя D-пеницилламин и ионы меди порознь не влияют на экспрессию рецептора Fas на клеточной поверхности синовиальных фибробластов у больных РА, в комбинации они дозозависимо усиливают ее. Обработка клеток, инкубированных с анти-Рав-антителами, D-пеницилламином в сочетании с сульфатом меди усиливает Fas-зависимый апоптоз, что доказывает функциональную активность индуцированного Fas [10].
Выяснение молекулярных механизмов суставной деструкции выявляет новые мишени для генной терапии, включающей ингибирование провос-палительных цитокинов, блокаду деградирующих металлопротеиназ, ингибирование активации си-новиоцитов, влияние на баланс Thl/Th2 цитоки-
нов, индукцию апоптоза активированных Т-клеток и незрелых тимоцитов [36].
Генная терапия имеет значительное преимущество в обеспечении локального и продолжительного действия терапевтического агента в пораженном суставе. Трансфер гена FADD с помощью аденовирусного вектора в ревматоидные синовиоциты индуцирует гиперэкспрессию проапоптозного адап-торного белка FADD и апоптоз. In vivo локальная инъекция FADD-экспрессирующего аденовируса (Ad-FADD) элиминирует ревматоидные синовиоциты человека, имплантированные мышам фенотипа SCID, которые являются моделью для разработки терапевтических стратегий. Ad-FADD-индуцированный апоптоз ограничен клетками синовиальной ткани, не влияет на хондроциты и может быть эффективным средством лечения РА [17].
Заключение
Изменения апоптоза синовиальных и воспалительных клеток, ассоциированные с патогенезом РА, способствуют хроническому воспалению и гиперплазии синовиальных тканей. Прежде всего это касается синовиальных фибробластов, резистентность которых к апоптозу тесно связана с прогрес-
ЛИТЕРАТУРА
1. Afeltra A. Treatment of rheumatoid arthritis: new therapeutic approaches with biological agents. Curr. Drug. Targets Immune Endocr. Metabol. Disord.,
2001, 1, 1,45-65.
2. Amano Т., Yamasaki S., Yagishita N. et al. Synoviolin/Hrdl, an E3 ubiquitin ligase, as a novel pathogenic factor for arthropathy. Genes. Dev., 2003, 1, 17, 19, 2436-2449.
3. Aupperle K.R., Boyle D.L., Hendrix M. et al. Regulation of synoviocyte proliferation, apoptosis, and invasion by the p53 tumor suppressor gene. Am. J. Pathol., 1998, 152,4, 1091-1098.
4. Baier A., Meineckel I., Gay S. et al. Apoptosis in rheumatoid arthritis. Curr. Opin. Rheumatol., 2003,
15, 3,274-279.
5. Burger D. Cell contact interactions in rheumatology. Arthr. Res., 2000, 2, 6, 472-476.
6. Christensson М., Pettersson E., Eneslatt K. et al. Serum sFAS levels are elevated in ANCA-positive vasculitis compared with other autoimmune diseases. J. Clin. Immunol., 2002, 22, 4, 220-227.
7. Cunnane G., Hummel K.M., Muller-Ladner U. et al. Mechanism of joint destruction in rheumatoid arthritis. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.), 1998,
46, 1,1-7.
8. Franz J.K., Pap Т., Hummel K.M. et al. Expression of sentrin, a novel antiapoptotic molecule, at sites of synovial invasion in rheumatoid arthritis. Arthr.Rheum., 2000, 43, 599-607.
9. Hammaker D.R., Boyle D.L., Chabaud-Riou М.,
сирующей деструкцией суставного хряща. Синовиальные фибробласты, макрофаги и лимфоциты являются важными патогенетическими звеньями этого заболевания, в котором апоптоз играет двойственную роль. В суставах пациентов с РА определяется несколько видов апоптозных клеток, и экспериментально подтверждено, что усиление апоптоза в суставе может быть использовано для лечения. Фармакологически индуцированный апоптоз является основой нового подхода к лечению больных РА. Последнее важнейшее достижение в терапии РА - внедрение препаратов, ингибирующих TNFa (моноклональные антитела и низкомолекулярные ингибиторы продукции TNFa или TNFa -зависимого сигналинга). Синовиальная пролиферация при РА характеризуется нарушением апоптоза фибробластов, тогда как клетки-предшественники костного мозга подвержены ускоренному апоптозу. Обе аномалии корригируются ингибированием TNFa. Еще одна перспективная мишень терапии РА - транскрипционный фактор NFkB, избирательное ингибирование которого оказалось эффективным в исследованиях на экспериментальных животных моделях артрита.
Firestein G.S. Regulation of c-Jun N-terminal kinase by MEKK-2 and mitogen-activated protein kinase kinase kinases in rheumatoid arthritis. J. Immunol., 2004, 72, 3, 1612-1618.
10. Harada S., Sugiyama E., Taki H. et al. D-penicil-lamine cooperates with copper sulfate to enhance the surface expression of functional Fas antigen in rheumatoid synovial fibroblasts via the generation of hydrogen peroxide. Clin. Exp. Rheumatol., 2002,
20, 4, 469-476.
11. Hashimoto H., Tanaka M., Suda T. et al. Soluble Fas ligand in the joints of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arth. Rheum., 1998, 41,
4, 657-662.
12. Hilbers I., Hansen T., Petrow P.K. et al. Expression of the apoptosis accelerator Bax in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatol. Int., 2003, 23, 2, 75-81.
13. Ichikawa K„ Liu W„ Fleck M. et al. TRAIL-R2 (DR5) mediates apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis. J. Immunol., 2003, 15, 171,2, 1061-1069.
14. Ichinose Y., Eguchi K., Migita K. et al. Apoptosis indue tion in synovial fibroblasts by ceramide: in vitro and in vivo effects. J. Lab. Clin. Med., 1998, 131,5,410-416.
15. Kawakami A., Eguchi K. Involvement of apoptotic cell death in autoimmune diseases. Med. Electron. Microsc., 2002, 35, 1, 1-8.
16. Kim G., Jun J.B., Elkon KB. Necessary role of
phosphatidylinositol 3-kinase in transforming growth factor beta-mediated activation of Akt in normal and rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthr. Rheum., 2002, 46, 6, 1504-1511.
17. Kobayashi T., Okamoto K., Kobata T. et al. Novel gene therapy for rheumatoid arthritis by FADD gene transfer: induction of apoptosis of rheumatoid synoviocytes but not chondrocytes. Gene Then, 2000, 7, 6, 527-533.
18. Krause A., Scaletta N., Ji J.D. et al. Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on Stat3. J. Immunol., 2002, 1, 169, 11, 6610-6616.
19. Kurowska M., Rudnicka W., Kontny E. et al. Fibroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients express functional IL-15 receptor complex: endogenous IL-15 in autocrine fashion enhances cell proliferation and expression of Bcl-x(L) and Bcl-2. J. Immunol., 2002, 169, 4, 17601767.
20. Liu H., Pope R.M. The role of apoptosis in rheumatoid arthritis. Curr. Opin. Pharmacol., 2003, 3, 3, 317-322.
21. Masuko-Hongo K., Sakata M., Yuan G.H. et al. Expression of Fas-associated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme (FLICE) inhibitory protein (FLIP) in human articular chondrocytes: possible contribution to the resistance to Fas-mediated death of in vitro cultured human articular chondrocytes. Rheumatol. Int., 2001, 21,
3, 112-121.
22. Matsuno H., Yudoh K., Uzuki M. et al. Treatment with the angiogenesis inhibitor endostatin: a novel therapy in rheumatoid arthritis. J. Rheumatol., 2002b, 29, 5, 890-895.
23. Matsuno H., Yudoh K., Watanabe Y. et al. Stromelysin-1 (MMP-3) in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis has potential to cleave membrane bound Fas ligand. J. Rheumatol., 2001,28, 1,22-28.
24. Miagkov A.V., Kovalenko D.V., Brown C.E. et al. NF-kappaB activation provides the potential link between inflammation and hyperplasia in the arthritic joint. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 23, 13859-13864.
25. Michael V.V., Alisa K.E. Cell cycle implications in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Front. Biosci., 2000, 1, 5, D594-601.
26. Migita K., Honda S., Yamasaki S. et al. Regulation of rheumatoid synovial cell growth by ceramide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 269, I, 70-75.
27. Migita K., Yamasaki S., Kita M. et al. Nitric oxide protects cultured rheumatoid synovial cells from Fas-induced apoptosis by inhibiting caspase-3. Immunology., 2001, 103, 3, 362-367.
28. Mizushima N., Kohsaka H., Miyasaka N. Ceramide, a mediator of interleukin 1, tumour necrosis factor alpha, as well as Fas receptor sig-
nalling, induces apoptosis of rheumatoid arthritis synovial cells. Ann. Rheum. Dis., 1998, 57, 8, 495499.
29. Mountz J.D., Hsu H.C., Matsuki Y. et al. Apoptosis and rheumatoid arthritis: past, present, and future directions. Curr. Rheumatol. Rep., 2001, 3, I, 7078.
30. Mountz J.D., Zhang H.G. Regulation of apoptosis of synovial fibroblasts. Curr. Dir. Autoimmun., 2001,3,216-239.
31. Nakayamada S., Saito K., Fujii K. et al. Betal inte-grin-mediated signaling induces intercellular adhesion molecule 1 and Fas on rheumatoid synovial cells and Fas-mediated apoptosis. Arthr. Rheum., 2003,48, 5, 1239-1248.
32. Nakazawa M., Aratani S., Hatta M. et al. TNFalpha induces acetylation of p53 but attenuates its transcriptional activation in rheumatoid synoviocytes. Int. J. Mol. Med. 2002, 10, 3, 269-75.
33. O'Donnell K., Harkes I.C., Dougherty L. et al. Expression of receptor tyrosine kinase Axl and its ligand Gas6 in rheumatoid arthritis: evidence for a novel endothelial cell survival pathway. Am. J. Pathol., 1999, 154, 4, 1171-1180.
34. Okamoto K., Kobayashi T., Kobata T. et al Fas-associated death domain protein is a Fas-mediated apoptosis modulator in synoviocytes. Rheumatology (Oxford), 2000, 39, 5, 471-480.
35. Pap T., Muller-Ladner U., Gay R.E. et al. Fibroblast biology. Role of synovial fibroblasts in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthr. Res., 2000, 2, 5, 361-367.
36. Rabinovich G. A. Apoptosis as a target for gene therapy in rheumatoid arthritis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 2000, 95, suppl. 1, 225-233.
37. Reddy S.A., Huang J.H., Liao W.S. Phosphatidylinositol 3-kinase as a mediator of TNF-induced NF-kappaB activation. J. Immunol., 2000, 164, 1355-1363.
38. Romas E., Gillespie M.T., Martin T.J. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis. Bone, 2002, 30, 2, 340-346.
39. Schedel J., Gay R.E., Kuenzler P. et al. FLICE-inhibitory protein expression in synovial fibroblasts and at sites of cartilage and bone erosion in rheumatoid arthritis. Arthr.Rheum., 2002, 46, 6, 15121518.
40. Sun Y., Cheung H.S. p53, proto-oncogene and rheumatoid arthritis. Semin. Arthr.Rheum., 2002, 31, 5, 299-310.
41. Tanaka Y., Nomi M., Fujii K. et al. Intercellular adhesion molecule 1 underlies the functional heterogeneity of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis: involvement of cell cycle machinery. Arthr. Rheum., 2000, 43, 11, 2513-2522.
42. Tsuboi M., Kawakami A., Nakashima T. et al. Tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta
increase the Fas-mediated apoptosis of human osteoblasts. J. Lab. Clin. Med., 1999, 134, 3, 222231.
43. van't Hof R.J., Hocking L., Wright P.K. et al. Nitric oxide is a mediator of apoptosis in the rheumatoid joint. Rheumatology (Oxford), 2000, 39, 9, 10041008.
44. Wakisaka S., Suzuki N., Takeba Y. et al. Modulation by proinflammatory cytokines of Fas/Fas ligand-mediated apoptotic cell death of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis (RA). Clin. Exp. Immunol., 1998, 114, 1, 119-128.
45. V^lsh D.A., Wade M., Mapp RI. et al. Focally regulated endothelial proliferation and cell death in human synovium. Am. J. Pathol., 1998, 152, 3, 691702.
46. Yamamoto T. Molecular mechanism of monocyte predominant infiltration in chronic inflammation: mediation by a novel monocyte chemotactic factor, S19 ribosomal protein dimmer. Pathol. Int., 2000,
50, 11, 863-871.
47. Yamanishi Y., Boyle D.L., Rosengren S. et al. Regional analysis of p53 mutations in rheumatoid arthritis synovium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2002, 99, 15, 10025-10030.
48. Yamasaki S., Kawakami A., Nakashima T. et al. Importance of NF-kappaB in rheumatoid synovial tissues: in situ NF-kappaB expression and in vitro study using cultured synovial cells. Ann. Rheum. Dis., 2001, 60, 7, 678-684.
49. Yao Q., Wang S., Gambotto A. et al. Intra-articular adenoviral-mediated gene transfer of trail induces apoptosis of arthritic rabbit synovium. Gene Then,
2003, 10, 12, 1055-1060.
50. Yao Q., Wang S., Glorioso J.C. et al. Gene transfer of p53 to arthritic joints stimulates synovial apoptosis and inhibits inflammation. Mol. Then,2001, 3, 6, 901-910.
51. Youn J., Kim H.Y., Park J.H. et al. Regulation of TNF-alpha-mediated hyperplasia through TNF receptors, TRAFs, and NF-kappaB in synoviocytes obtained from patients with rheumatoid arthritis. Immunol. Lett., 2002, 83, 2, 85-93.
52. Zhang H.G., Huang N., Liu D. et al. Gene therapy that inhibits nuclear translocation of nuclear factor kappaB results in tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of human synovial fibroblasts. Arthr. Rheum., 2000, 43, 5, 1094-1105.
Поступила 15.09.05
