CC BY
14
Экспериментальные исследования
ISSN 1561-6274. Нефрология. 1999. Том 3. № 2.
© Я.Ю.Багров, Н.Б.Манусова, 1999 УДК 577.156:612.014.462.591.462:597.82
Я.Ю.Багров, Н.Б.Манусова
РОЛЬ АПИКАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АРГИНИН-ВАЗОПРЕССИНА В АНТИДИУРЕТИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЛЯГУШКИ RAN A TEMPORARIA
Ya.Yu.Bagrov, N.B.Manusova
THE ROLE OF APICAL ARGININE-VASOPRESSIN RECEPTORS IN THE ANTIDIURETIC REACTION OF THE FROG RAN A TEMPORARIA URINARY BLADDER
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия
РЕФЕРАТ
Исследовался антидиуретический эффект рецепторов аргинин-вазопрессина (АВП), расположенных на апикальной мембране мочевого пузыря лягушки Rana temporaria. Обнаружено, что добавление АВП (Ю-6 моль) к мукозной поверхности пузыря вызывает самостоятельный гидроосмотический эффект только в весенний период. В осенне-зимний период АВП стимулирует водный транспорт только в присутствии активатора протеинкиназы С (РМА, 50 нмоль). Апикальный АВП потенцирует водный транспорт, стимулированный осмотической гипертонией серозной поверхности пузыря (300 моем маннитола). Потенцирующий эффект апикального АВП предупреждается добавлением к мукозной поверхности пузыря антагониста рецепторов типа V, (V, — [p-mercapto-p, p-cyclopentamethyleneprop¡onyl 1, 0-Et-Tyr2, Val4, Arg8]-vasopressin) и не изменяется в присутствии антагониста рецепторов типа V2 ([Adamantaneacetyll, 0-Et-d-Tyr2, Val4, Aminobutyrryl6, Arg8, 9]-vasopressin, 10~5 моль). Делается выводо том, что рецепторы типа V,, расположенные на апикальной мембране, участвуют в регуляции водного транспорта.
Ключевые слова: водный транспорт, аргинин-вазопрессин, рецепторы типа V,, протеинкина-за С, маннитол, мочевой пузырь лягушки.
ABSTRACT
The role of apical AVP receptors in the antidiuretic effect in frogs (ñaña temporaria L.) urinary bladder has been studied. AVP (10~6 mol) alone caused osmotic water flow only in spring frogs. In the autumn — winter period, antidiuretic effect of apical AVP was effective only in the presence of a PKC activator PMA (50 nmol) or of serosal hyperosmolarity induced by 300 mosm of mannitol. The strong increase of antidiuretic effect of serosal hyperosmolarity was prevented by a V, receptor antagonist V, — [P-mercapto-P, p-cyclopentamethylenepropionyl 1, 0-Et-Tyr2, Val4, Arg8]- vasopressin (10~5 mol) added to the mucosal surface of the bladder rather than by a V2 antagonist ([Adamantaneacetyll, 0-Et-d-Tyr2, Val4, Aminobutyrryl6, Arg8,9]-vasopressin (10~5 mol). Therefore, the apical AVP receptors of V, type are involved in the regulation of water transport. Keywords: water transport, arginine-vasopressin, V, receptor, protein kinase C, mannitol, frog bladder.
ВВЕДЕНИЕ
Работы, проведенные в течение последних 10 лет преимущественно японскими исследователями, убедительно показали, что рецепторы аргинин-вазопрессина находятся не только на базальной, но и на апикальной мембране чувствительного к антидиуретическому гормону (АДГ) эпителия [4—7, 12, 13, 15, 17]. Аналогичную локализацию могут иметь и рецепторы ок-ситоцина [10]. Рецепторы вазопрессина, расположенные на апикальной мембране, относятся к типу V, [5, 7, 17], и стимулируют транспорт натрия, Ыа+/Н+ обмен [5-7, 9, 12, 13, 17|.
Между тем, данные о роли рецепторов V! и внутриклеточных посредников передачи сигнала с этого типа рецепторов неоднозначны. Наряду с данными о негативном контроле над антидиуретическим эффектом со стороны компонентов передачи сигнала от рецепторов V, [3] обнаружено и стимулирующее влияние протеинкиназы С, расположенной у апикальной мембраны, на гидроосмотический эффект вазопрессина [1, 11, 14, 16].
Целью настоящей работы было исследование влияния активации апикальных рецепторов вазопрессина на водную проницаемость АДГ чув-
ствительного эпителия мочевого пузыря лягушки Rana temporaria. Исследовался не только самостоятельный эффект апикального вазопресси-на, но и его взаимодействие с антидиуретическим эффектом, вызываемым активацией арги-нин-вазопрессином рецепторов, расположенных на базальной мембране, а также воздействием на эту мембрану цАМФ и гипертонического раствора маннитола. Гиперосмолярность наружной (серозной) поверхности пузыря является широко известным стимулятором водной проницаемости АДГ чувствительного эпителия [15]. Поскольку ранее нами было обнаружено, что активатор протеинкиназы С-форболовый эфир (РМА), добавленный со стороны апикальной мембраны, потенцирует эффект действующего на базальной мембране аргинин — вазопрессина [1J, был изучен и эффект «апикального» вазопрессина в присутствии этого вещества.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на выделенных по методу P.Y.Bentley [8] мочевых пузырях лягушки Rana temporaria L., являющихся аналогом дистального сегмента нефрона млекопитающих. Опыты проводились в осенне-зимнее время (ноябрь-январь) и весной (март, апрель). Для обездвиживания животных разрушали головной и спинной мозг. Во время препаровки мочевые пузыри лягушек разделяли на две одинаковые половины. В каждую половинку вставлялся полиэтиленовый катетер, через который происходила смена внутреннего (мукозного) раствора. Одна из половинок (в дальнейшем просто «пузырь») всегда служила контролем для другой. Пузыри инкубировались при комнатной температуре в аэрируемом растворе Рингера следующего состава (ммоль): Na+112; К+5,6; Са++0,89; СП 13; Н2РО-4 0,6; НРО"4 2,4; рН 7,3; 220 моем. Раствор Рингера, которым заполнялись пузыри, разводился дистиллированной водой в пять раз. Таким образом, осмотический градиент между инкубационной средой и внутренним содержимым пузыря составлял 176 мосм/л. Оценку водного потока по осмотическому градиенту производили гравиметрическим методом и выражали в мкл/см2 стенки пузыря за 60 мин инкубации. Для стимуляции водного потока использовались 8-аргинин-ва-зопрессин (Ю-6 моль, Sigma), 8-бром-цАМФ (10~4 моль, Sigma). Также водный поток вызывался методом осмотической гипертонизации наружной среды — 300 моем маннитола (Sigma). Для исследования роли апикальных рецепторов аргинин — вазопрессина этот гормон вводился в просвет пузыря, т.е. к его мукозной поверхности. Для характеристики рецепторов и путей проведения сигнала в просвет пузыря
также вводились антагонисты рецепторов Vj и V2, активатор протеинкиназы С и блокаторы кальциевых каналов. В качестве антагонистов рецепторов типа V, и V2 использовались соответственно — [p-mercapto-p, P-cyclopentameth-ylenepropionyl 1, 0-Et-Tyr2, Val4, Arg8] — vasopressin и [Adamantaneacetyl 1, 0-Et-d-Tyr2, Val4, Aminobutyrryl6, Arg8,9] — vasopressin (Sigma) в концентрации Ю-5 моль, для активации протеинкиназы С-форболовый эфир (РМА, 50 нмоль, Sigma), для блокады кальциевых каналов — верапамил (изоптин, 10 мкмоль, RBI) и нифедипин (Ю-5 моль, RBI).
Результаты экспериментов обрабатывали с помощью парного критерия Стыодента.
РЕЗУЛЬТАТЫ1
Собственный эффект апикального АВП в осенне-зимний (декабрь) период отсутствовал. Опыты же, проведенные весной (март), обнаружили высокий достоверный стимулирующий эффект на водную проницаемость апикального АВП (табл. 1).
В осенне-зимний период аналогичный эффект апикального АВП наблюдался только при добавлении в просвет пузыря стимулятора протеинкиназы С-РМА (табл. 2).
Таблица 1
Влияние апикального вазопрессина на величину
нестимулированного осмотического потока воды через стенку мочевого пузыря лягушки
вещества и место их введения п Р Осмотический поток воды, Х±т, мкл/см2-60 мин
Апикальная поверхность
Декабрь, контроль Декабрь, АВП 10"6 моль 9 нд 14,2±0,66 14,6±0,46
Март, контроль Март, АВП 10"6 моль 7 <0,007 5,4±0,94 14,7+2,30
Примечание. Здесь и в табл. 2—5: НД — недостоверно.
Таблица 2
Влияние форболового эфира (РМА) на величину осмотического потока воды, стимулированного апикальным вазопрессином, через стенку мочевого пузыря лягушки
Вещества и место их введения п Р Осмотический поток воды, Х±т, мкл/см2 -60 мин
Апикальная поверхность
Контроль АВП Ю-6 моль 7 нд 3,7±0,76 7,1 ±1,94
АВП 10~6 моль АВП 10~6 моль + РМА 5 нмоль 12 <0,006 2,5±0,37 16,2±4,74
1 Для удобства изложения материала все вещества будут именоваться апикальными при добавлении их с апикальной стороны стенки мочевого пузыря, базальными — с базальной.
Гидроосмотический эффект базальных АВП и цАМФ достоверно не изменялся в присутствии апикального АВП (табл. 3).
Аналогичный эффект осмотической гипертонии, созданной маннитолом, достоверно потенцировался апикальным АВП (табл. 4). Это стимулирующее действие апикального АВП исчезало в присутствии в просвете пузыря блока-тора рецепторов V, и не изменялось в присутствии блокатора рецепторов У2 (табл. 4).
Кроме того, потенцирующий эффект апикального АВП предупреждается блокаторами Са++-каналов — верапамилом и нифедипином (табл. 5).
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные данные позволяют прийти к выводу о том, что наряду с установленным ранее стимулирующим эффектом активации апикальных рецепторов АВП на транспорт натрия [5—7, 9, 12, 13, 17], эти рецепторы способны модифицировать и водную проницаемость. Причем самостоятельный гидроосмотический эффект активации этих рецепторов носит четко сезонный характер (см. табл. 1). Сезонные колебания спонтанной проницаемости мочевого пузыря лягушки и ее чувствительности к ба-зальному АВП были установлены нами ранее [2]. Участие апикальных рецепторов АВП в регуляции водного транспорта подтверждается потенцирующим действием их активации на АДГ подобный эффект гиперосмолярности серозной поверхности, создаваемой маннитолом (см. табл. 4). Подавление этого действия апикальных рецепторов АВП блокаторами кальциевых каналов и особенно антагонистом рецепторов V,, подтверждает принадлежность апикальных рецепторов именно к этой категории (см. табл. 4). Существование У|-рецепторов в АДГ чувствительном эпителии было установлено ранее с помощью высоко селективных меченых лигандов и подразделены на У,- и У,а-под-типы [4]. Однако установить подтип У|-рецеп-торов в физиологических экспериментах пока не представляется возможным.
Остается неясным, почему потенцируется лишь эффект базальной осмотической гипертонии, но не базальных АВП и цАМФ (см. табл. 2). Различие этих воздействий в том, что осмотическая гипертония вызывает постоянную дегидратацию эпителия пузыря. Усиление его водной проницаемости может быть лишь компонентом объемной регуляции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, можно высказать предположение, что апикальные рецепторы АВП направлены на регуляцию собственного объема кле-
ток, а не общего водно-солевого гомеостаза организма. АДГ подобный эффект активации апикальных рецепторов мочевого пузыря возникает в тех случаях, когда осмотические и объемные рецепторы пузыря как бы имитируют гиперосмию и гиперволемию всего организма.
Таблица 3
Влияние апикального вазопрессина на величину стимулированного осмотического потока воды через стенку мочевого пузыря лягушки
Вещества и место их введения п Р Осмотический поток воды, Х±т, мкл/см2-60 мин
Апикальная поверхность Базальная поверхность
АВП 10~6 моль АВП 10~6 моль АВП 10"6 моль 15 нд 56,8±6,6 56,4+9,5
АВП 10"6 моль цАМФ 10~4 моль цАМФ 10"*4 моль 8 нд 60,8±10,5 52,4±8,25
Таблица 4 Влияние апикального вазопрессина и его антагонистов на величину осмотического потока, стимулированного базальным маннитолом, через стенку мочевого пузыря лягушки
Вещества и место их введения п Р Осмотический поток воды, Х±т, мкл/см2-60 мин
Апикальная поверхность Базальная поверхность
АВП 10"6 моль Маннитол 300 ммоль Маннитол 300 ммоль 15 <0,004 41,1±10,47 .22,7±5,90
Антагогонист V,* 10~5 моль Антагогонист V,* 10~5 моль + АВП 10"6 моль Маннитол 300 ммоль Маннитол 300 ммоль 6 нд 40,3±13,86 42,9+13,51
Антагогонист М2** 10~5 моль Антагогонист \/2** 10~5 моль + АВП 10"6 моль Маннитол 300 ммоль Маннитол 300 ммоль 6 <0,002 19,8±6,13 40,9±10,28
" — 0[-тегсар1о-(5, (1-сус1оретзтс1Ьу1епергорюпу1 1, 0-ЕЫуг2, \/а14, Агд8]-уазоргеээт.
'* — [Ас)атап1апеасе1у11| 0-Е1-й-Туг2, \/а14, Ат1поЬи1уггу16, Агда.ЭНаворгеБзт.
Таблица 5
Влияние блокаторов Са~+-каналов и апикального вазопрессина на осмотической поток воды, стимулированный базальным маннитолом, через стенку мочевого пузыря лягушки
Вещества и место их введения п Р Осмотический поток воды, Х±т, мкл/см2-60 мин
Апикальная поверхность Базальная поверхность
Верапамил Юмкмоль Верапамил 10мкмоль+ АВП Ю-6 моль Маннитол 300 ммоль Маннитол 300 ммоль 9 нд 24,0±7,0 22,4±6,7
НифедипинЮ-5 моль НифедипинЮ"5 моль+ АВП Ю-6 моль Маннитол 300 ммоль Маннитол 300 ммоль 6 НД 20,7+5,5 24,3±6,1
Разумеется, это предположение нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Багров Я.Ю., Дмитриева Н.И., Манусова Н.Б. О роли протеинкиназы С и мускариновых холинорецепторов в стимулированном вазопрессином водном транспорте // Экс-пер. клин, фармакол,—1995.—Т. 58, № 4.—С. 33—35.
2. Багров Я.Ю., Комиссарчик Я.Ю., Манусова Н.Б., Сни-гиревская Е.С. Спонтанное и индуцированное изменение проницаемости плотных контактов эпителия мочевого пузыря лягушки Rana temporaria // Цитология.—1993.—Т. 35, № 2—С. 44—54.
3. Наточин Ю.В., Парнова Р.Г., Фирсов Д.Л., Шахматова Е.И. Внутриклеточные сигнальные системы в механизме антидиуретического действия вазопрессина // Биол. мембраны,—1991.—Т. 8,—С. 1215—1216.
4. Ammar A., Roseau S., Butlen D. Pharmacological characterization of Via vasopressin receptors in the cortical collecting duct // Amer. J. Physiol.-1992.-Vol. 262,—P. F546-F553.
5. Ando Y., Asano Y. Functional evidence for an apical V, receptor in rabbit cortical collecting duct // Amer. J. Physiol.— 1993.—Vol. 264.—P.F467—F471.
6. Ando Y., Tabei K., Asano Y. Luminal vasopressin modulates transport in the rabbit collecting duct // J. Clin. Invest.— 1991.—Vol. 88.—P. 952-959.
7. Barreto-Chaves M.L.M., de Mello-Aries M. Luminal arge-nine vasopressin stimulates Na+—H+ exchange and H+— ATPase in cortical distal tubule via V, receptor // Kidney Int.— 1997.—Vol. 52,—P. 1036—1041.
8. Bentley P.Y. Physiology properties of the isolated frog bladder in hyperosmotic solutions // Сотр. Biochem. Physiol.— 1964,—Vol. 12,—P. 233-239
9. Burgues W.J., Balment R.J., Beck J.S. Effects of luminal vasopressin on intracellular calcium in microperfused rat medullary thick ascending limb // Renal Physiol. Biochem.— 1991.—Vol. 17,—P. 1-9.
10. Inoue Т., Naruse M., Nakayama M. et. al. Oxytocin affects apical sodium conductance in rabbit cortical collecting duct// Amer. J. Physiol.- 1993.-Vol. 265.-P. F487—F503.
11. Masur S.R., Massardo S. ADH and forbol ester increase immunolabeling of the toad bladder apical membrane by antibodies made to granules // J. Membr. Biol.—-1987,—Vol. 96,— P. 193-198.
12. Nasure M., Yoshitomi K., Kurokawe K. Luminal action of AVP in rabbit cortical collecting duct (CCD): C-kinase mediated changes in ionic conductances (abstract) // J. Amer. Soc. Nephrol.—1991,—Vol. 2,—P. 725.
13. Naruse M., Yoshitomi K., Hanaoka K. et. al. Electrophysiological study of luminal and basolateral vasopressin in rabbit cortical collecting duct // Amer. J. Physiol.— 1995.—Vol. 268,—P. F20—F29.
14. Schlondorf D. Interactions of vasopressin of calmodu-line and protein kinase С // Vasopressin, R.W.Schrier.—Raven Press: New York, 1985,—P. 113—123.
15. Urakabe S., Handler J., Orloff J. Effect of hypertonicity on permeability properties of the bladder // Amer. J. Physiol.— 1970.-Vol. 218.-P.1179-1187.
16. Yorio Т., Satumitra N. Contribution of the vasopressin V, receptor to its hydrosmotic response // Biol. Cell.—1989.— Vol. 66,—P.7—12.
17. Yoshitomi K., Naruse M., Nahaoka K. et.al. Functional characterization of vasopressin V, and V2 receptors in the rabbit renal cortical collecting duct // Kidney Int.—1996,—Vol. 49,— P. S177—S182.
Поступила в редакцию 20.05.99 г.
