CC BY
104
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Классификатор К2:
V = sign(-1,27 (лейкоциты) + 0,529 (CD3, %) - 0,748 (CD3, абс.) + 1,232 (CD19, %) + 1,215 (IgG) - 2,404 (IgA) -0,025(IgE) +22,656(CD4/CD16+CD8)) - 55,029). Классификатор К3:
Vz = sign (-1,27 (лейкоциты) + 4,425 (CD4, абс.) - 19,735 (CD3, абс.) - 35,098 (CD16, абс.) + 0,206 (фагоцитарная активность нейтрофилов) + 16,931 (CD19, абс.) - 3,094(IgM) - 2,404(IgA) + 27,131).
Примечание. Переменные «лейкоциты», «CD3, абс.», «CD4, абс.», «CD8, абс.», «CD16, абс.», «CD19, абс.» должны быть выражены в виде тысяч клеток на 1 мкл (например, при уровне лейкоцитов 7 • 103/мкл в формулу подставляется число 7), переменные «IgG», «IgA» и «IgM» - в г/л, переменная «IgE» - в МЕ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Орадовская И. В., Пащенкова Ю. Г., Феоктистов В. В. и др. Эпидемиологический анализ мониторинга иммунного статуса у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС для раннего выявления групп риска и диагностики онкологических заболеваний // Радиац. биол. Радиоэкол. -2011. - Т 51, № 1. - С. 1-16.
2. Ami T., Kuroishi T., Saito Y. et al. // Tumor doubling time and prognosis in lung cancer patients: evaluation from chest films and clinical follow-up study. Japanese Lung Cancer Screening Research Group // Jpn J. Clin. Oncol. - 1994. - Vol. 24, N 4. - P. 199-204.
3. Holland-Frei Cancer Medicine, 6th edition. Под ред. D. W. Kufe, R. E. Pollock, R. R. Weichselbaum, R. C. Bast, T. S. Gansler, J. F. Holland, E. Frei BC Decker, 2003. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ bookshelf/br.fcgi?book=cmed6&part=A30838.
4. Lamb J., Ramaswamy S., FordH. L. et al. A mechanism of cyclin D1 action encoded in the patterns of gene expression in human cancer // Cell. - 2003. - Vol. 114. - P. 323-334.
5. Mootha V. K., Lindgren C. M., Eriksson K. F. et al. PGC-lalpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes // Nature Genet. -2003. - Vol. 34. - P. 267-273.
6. Ramaswamy S., Ross K. N., Lander E. S., Golub T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors // Nature Genet. - 2003. - Vol. 33. - P. 49-54.
7. Visintin I., Feng Z., Longton G. et al. Diagnostic markers for early detection of ovarian cancer // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14. - P. 1065-1072.
Поступила 28.05.12
ОБЗОРЫ
© Б. В. ПИНЕГИН, М. И. КАРСОНОВА, 2012 УДК 616.517-092:612.017.1
Б. В. Пинегин, М. И. Карсонова
роль антимикробного пептида ll-37 в развитии аутоиммунного процесса
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, Москва, Каширское ш., 24, корп. 2), ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)
В обзоре рассмотрено участие антимикробного пептида LL-37 в инициации и ингибиции аутоиммунного воспаления на модели псориаза. Показана роль этого пептида в защите внеклеточных нуклеиновых кислот от нуклеаз, в доставке их в эндосомальный отдел дендритных клеток и индукции синтеза провоспалительных цитокинов. Обсуждаются возможные пути терапевтического применения пептида LL-37.
Ключевые слова: аутоиммунные процессы, псориаз, клетки иммунной системы, дендритные клетки, цитокины, пептид LL-37
Pinegin B.V., Karsonova M.I.
role of antimicrobial peptide ll-37 in the development of autoimmune process
In a review of the participation of antimicrobial peptide LL-37 in the initiation and the inhibition of autoimmune inflammation of the model of psoriasis. Shows the role of the peptide in the protection of extracellular nucleic from nuclease, in the delivery of them in endosomal department of dendritic cells and induction of synthesis of proinflammatory cytokines. Are discussed the ways of possible therapeutic use of peptide LL-37.
Key words: autoimmune processes, psoriasis, immune system cells, dendritic cells, cytokines, peptide LL-37
В развитии аутоиммунных процессов важную роль играют Toll-подобные рецепторы (TLR), распознающие нуклеиновые кислоты (НК). Первично предполагалось, что эти рецепторы распознают преимущественно прокариотические НК. В частности, TLR3, TLR7/TLR8 и TLR9 распознают двухспиральные, односпиральные вирусные РНК и бактериальные и
Пинегин Борис Владимирович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)617-76-49
вирусные неметилированные CpG-последовательности ДНК соответственно. Взаимодействие прокариотических НК с TLR вызывает активацию клеток врожденного иммунитета, синтез провоспалительных цитокинов и повышение устойчивости организма к инфекционным агентам.
Однако TLR обладают способностью распознавать не только прокариотические, но и эукариотические НК. Последние могут выделяться во внеклеточную среду из стареющих, апоптотиче-ских и некротических клеток и при отсутствии их элиминации вызывать развитие аутоиммунных процессов. Так, у мышей, де-
- 276 -
ОБЗОРЫ
фектных по эндонуклеазе I, которая разрушает ДНК, развивается тяжелый волчаночный синдром. Поэтому в норме внеклеточные НК мгновенно разрушаются нуклеазами сыворотки крови. Однако в некоторых случаях НК могут избежать разрушения нуклеазами и попасть в эндосомальный отдел клетки.
НК становятся устойчивыми к действию нуклеаз при образовании комплексов с пептидами и белками. Так, при образовании внеклеточных ловушек нейтрофилы выбрасывают сеть из длинных филаментов, состоящих из ДНК, и глобулярных доменов, состоящих из белка и ДНК. Обработка ДНКазой I вызывает исчезновение филаментов ДНК, но не оказывает влияния на глобулярные домены [20].
При развитии гуморального аутоиммунного ответа происходит образование иммунных комплексов (ИК), состоящих из аутоантител к ДНК, РНК или рибонуклеопротеидов (РНП) и соответствующих НК. Эти ИК взаимодействуют с FcyRII клеток иммунной системы, интернализируются и попадают в эндосомальный отдел клетки, содержащий TLR7 и TLR9 [19]. В этом процессе аутоантитела выполняют двойную роль - стабилизатора и проводника. Следствием являются синтез провоспалительных цитокинов, хроническая активация иммунной системы и при наличии предрасположенности развитие аутоиммунного процесса.
В настоящее время накапливаются данные о том, что роль стабилизатора и проводника НК может играть пептид LL-37. Наиболее четко это показано на модели псориатического воспаления, характеризующегося интенсивной инфильтрацией кожи практически всеми клетками иммунной системы. Эти клетки активированы и интенсивно продуцируют провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли a (TNFa), интерлейкин (IL)-ip, интерферон (IFN)-y, IFN-a, IL-23, IL-6, IL-17, IL-22 и IL-20. На различных этапах воспалительного процесса действуют различные цитокины или их сочетания. Акгивиро-ванными являются и кератиноциты, основные клетки эпидермиса кожи, которые также продуцируют провоспалительные цитокины. Нет сомнений в том, что избыточный синтез провоспалительных цитокинов является ведущей причиной псориатического воспаления. Однако неясно, какой конкретный фактор становится инициатором псориатического воспаления в коже. На эту тему имеется ряд предположений, основанных на экспериментальных и клинических данных.
Одно из предположений базируется на участии в развитии псориаза комплекса из собственных НК (ауто-НК) и антимикробного пептида LL-37, продукта расщепления кателициди-на hCAP-18. Данный обзор посвящен анализу роли комплекса KH/LL-37 в развитии псориатического воспаления.
Основные свойства пептида LL-37. Кателицидин hCAP-18 (human cationic antimicrobial peptide) синтезируется в нейтрофилах, кератиноцитах, клетках эпителия дыхательных путей в виде неактивного предшественника молекулярной массой (ММ) 18 кД, состоящего из Мконцевого кателинпо-добного и С-концевого антимикробного доменов. При эк-зоцитозе лейкоцитов протеаза 3 расщепляет кателицидин с образованием катионного пептида LL-37, состоящего из 37 аминокислотных остатков и 2 остатков лейцина на Мконце. В кератиноцитах расщепление неактивного предшественника с образованием активного пептида LL-37 осуществляет сериновая протеаза калликреин.
Пептид LL-37 обладает антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами [22]. Эти свойства обусловлены их электростатическим взаимодействием LL-37 с мембранами клетки. Пептиды аккумулируются и ориентируются параллельно поверхности мембраны-мишени, затем электростатически взаимодействуют с анионными группировками фосфолипидных головок во многих участках, покрывая мембрану наподобие ковра. При достижении определенной критической концентрации происходит образование сквозных дыр в мембране-мишени, что приводит к лизису клетки. Так, по нашим данным, LC50 пептида LL-37 для St. aureus составила 1,4 ± 1,2 мкг/мл [1]. В этих дозах пептид не
токсичен для клеток крови человека, но оказывает на них разнообразное иммунотропное действие. В концентрации, в несколько раз большей, чем для микробов, пептид LL-37 дает цитотоксический эффект и на эукариотические клетки [2], причем по механизму цитотоксический эффект идентичен бактерицидному. Более высокая чувствительность бактерий к бактерицидному действию пептида LL-37 связана с большим отрицательным зарядом клеточной стенки бактерий по сравнению с таковым мембраны эукариотических клеток.
В норме синтез кателицидина в кератиноцитах очень незначительный, и весь он находится в непроцессированной форме ММ 18 кД. При псориазе уровень кателицидина в коже резко повышен по сравнению с аналогичным показателем в коже больных атопическим дерматитом или здоровых людей, и весь он находится в процессированной форме в виде пептида LL-37 ММ 4,5 кД [25]. Концентрация пептида LL-37 во всех слоях эпидермиса у больных псориазом резко повышена (средняя концентрация 304 цМ). В высокой концентрации этот пептид присутствует также и в дерме, где находится в тесном контакте с плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) [21].
Уровень пептида LL-37 повышается при повреждениях кожи и различных стрессовых ситуациях, что дало основание отнести его к сигналам тревоги, или аларминам [5]. Этот пептид является хематтрактантом для нейтрофилов, моноцитов, DC и T-лимфоцитов, способствует созреванию DC и развитию T-клеточного иммунного ответа. Он стимулирует ангиогенез в коже, индуцирует синтез и высвобождение ряда цитокинов, хемокинов и гистамина, способствует пролиферации, миграции кератиноцитов и реэпителизации раны [7, 14]. Его количество резко возрастает в коже при заживлении раны, что дало основание некоторым авторам называть пептид LL-37 ростовым фактором кератиноцитов.
Свойства комплекса HK/LL-37. Факт повышенного синтеза и секреции кератиноцитами псориатической кожи пептида LL-37 является четко установленным. Возникает вопрос, как в коже могут появиться свободные НК. В принципе они должны быстро разрушаться внеклеточными нуклеазами. НК могут появляться во внеклеточном пространстве при ушибах, сдавливании, небольших различных повреждениях кожи. Надо заметить, что развитие псориаза, по наблюдениям клиницистов, нередко начинается с каких-то незначительных повреждений кожи или после ушиба. НК могут появляться во внеклеточном пространстве также в результате вытекания из стареющих или апоптоти-ческих клеток, особенно тогда, когда фагоцитоз апоптотических клеток понижен. Далее события могут развиваться следующим образом. При появлении во внеклеточном пространстве свободных НК пептид LL-37 мгновенно образует с ними комплекс, основанный на электростатическом взаимодействии. Этот комплекс стабилен и устойчив к действию нуклеаз [30].
Свободная ДНК или РНК плохо подвергается эндоцитозу эукариотическими клетками. По-иному обстоит дело с комплексом KH/LL-37. Этот комплекс быстро проникает в клетки с помощью эндоцитоза. Процесс проникновения хорошо показан на модели CpG-олигодезокси нуклеотидов бактериальной ДНК. После 15 мин инкубации с комплексами ФИТЦ-CpG/ LL-37 или ФИТЦ-CpG 10 и 0% соответственно мононуклеаров периферической крови становятся ФИТЦ-положительными. Мононуклеары, обработанные таким комплексом, становятся активированными и начинают экспрессировать костимулятор-ные молекулы CD40 и CD86 и синтезировать IL-6 [16]. Аналогичные данные получены при изучении проникновения плаз-мидной ДНК в перевиваемые клетки яичника СНО. Пептид LL-37 способствовал быстрому и эффективному проникновению ДНК в клетку. Основными участками в мембране, через которые в клетку проникает ДНК в присутствии LL-37, являются рафты - участки мембраны, обогащенные холестерином и сфинголипидами. Разрушение рафтов с помощью метил-р-циклодекстрина снижает проникновение комплекса ДНК+LL-37 в клетки, но не влияет или даже повышает проникновение в клетку свободной ДНК [30].
- 277 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Таким образом, пептид LL-37, связываясь с НК, делает НК устойчивыми к действию нуклеаз и способствует эффективному проникновению ее в клетку.
Роль комплекса HK/LL-37 в активации DC. Синтез большинства провоспалительных цитокинов является результатом активации TLR клеток врожденного иммунитета. На первых этапах развития псориатического воспаления дерма кожи больных интенсивно инфильтрируется pDC, синтезирующими IFN I типа [26]. Этому цитокину отводят роль одного из инициаторов развития псориатического воспаления. В настоящее время выявлен фактор, возможно, индуцирующий в псориатической коже синтез IFN I типа. Им оказался комплекс НК/КЬ-37. Это показано следующим образом. Установлено, что экстракт кожи больного псориазом, но не экстракт нормальной кожи или экстракт кожи больного атопическим дерматитом, стимулировал в pDC периферической крови синтез IFN-a. С помощью методов препаративной химии из кожи выделили активную субстанцию ММ 4,5 кД. Антитела к LL-37, но не к псориазину отменяли стимулирующий эффект этой субстанции [21].
Далее было установлено, что синтетический пептид LL-37, смешанный с супернатантом апоптотических клеток, индуцирует в pDC мощный синтез IFN-a. Этот синтез частично, но не полностью отменялся при обработке супернатанта ДНКазой или РНКазой. Полностью синтез IFN-a отменялся при совместной обработке супернатанта ДНКазой или РНКазой [10].
В модельных экспериментах in vitro показано, что искусственные комплексы LL-37/ДНК и LL-37/РНК являются мощными индукторами синтеза IFN-a в pDC [10, 21]. Как отмечалось выше, НК образуют прочный комплекс с пептидом LL-37, основанный на электростатическом взаимодействии. В комплексе ауто-ДНК/^-37 a-спираль этого пептида стабилизирует двуспиральную ДНК. Предполагается, что в комплексе ауто-РНК/^-37 этот пептид связывается с теми участками РНК, где образуются двойные спирали в виде шпилек. Как известно, эукариотическая РНК сильно метилирована и содержит большое количество псевдоуридина. Эти свойства препятствуют связыванию ауто-РНК с TLR7 и TLR8 DC и индукции синтеза провоспалительных цитокинов. Вероятно, связывание с пептидом LL-37 так изменяет конформацию ауто-РНК, что она приобретает способность активировать TLR7 и TLR8.
Среди АМП стимулирующая функция является уникальной для LL-37, так как комплекс р-дефензины/ДНК не индуцирует синтез IFN I типа [21].
С помощью ингибиторного анализа с использованием коротких олигонуклеотидов, блокирующих функции соответствующих TLR, показано, что синтез IFN-a комплексами ДНК/КЬ-37 и РНК/КЬ-37 является результатом активации соответственно сигнальных путей TLR9 и TLR7 [10, 21].
Характер активации миелоидных DC (mDC) комплексом LL-37/НК существенно отличается от активации pDC. Комплекс ауто-РНК/^-37 вызывает в mDC синтез IL-6 и TNFa, но не IFN-a. Этот комплекс в mDC распознается TLR8 [10].
С помощью конфокальной микроскопии установлено, что пептид LL-37 способствует не только проникновению ДНК в клетку, но и преимущественной ее колокализации с ранними эндосомами, содержащими трансферриновые рецепторы [21]. Это взаимодействие имеет существенное значение для характера активации клетки. Дело в том, что особенностью ранних эндосом pDC является их преимущественное взаимодействие с макромолекулярными комплексами. Активация пути TLR9 из ранних эндосом индуцирует синтез IFN-a. Особенностью поздних эндосом, содержащих лизосомальный маркер LAMP-1, является взаимодействие с мономерными соединениями. Активация пути TLR9 из поздних эндосом индуцирует синтез TNFa, IL-6 и созревание pDC [11].
При иммуногистохимическом анализе в дерме псориатической кожи, но не в здоровой коже или в коже больного атопическим дерматитом, обнаружили комплексы из внеклеточ-
ной ауто-РНК и ауто-ДНК, и большинство этих комплексов было ассоциировано с процессированной формой кателици-дина hCAP-18/LL-37 - пептидом LL-37. В дерме больных псориазом выявляют кластеры mDC. Как правило, эти кластеры колокализовались с комплексами РНК/КЬ-37 [10].
Таким образом, пептид LL-37 не только делает НК устойчивыми к действию нуклеаз, но и доставляет их в эндосо-мальный компартмент клетки. Следствием этого является синтез pDC и mDC соответственно IFN I типа или TNFa/IL-6. Связываясь с ауто-ДНК или ауто-РНК, пептид LL-37 способствует превращению неактивной, нестимулирующей ауто-ДНК или ауто-РНК в активатор синтеза провоспалительных цитокинов. В соответствии с этой схемой пептид LL-37 выполняет роль переносчика НК, а индукторами синтеза провоспалительных цитокинов являются НК, активирующие сигнальные пути TLR7, TLR8 и TLR9. По всей видимости, LL-37 не препятствует взаимодействию НК с этими рецепторами, а возможно, даже и усиливает его.
Исключением из этой схемы является TLR3. Лиганд этого рецептора - полиинозин-полицитидиловая кислота (poly(I:C)), являющаяся аналогом двуспиральной РНК, провоцирует в макрофагах, DC и глиальных клетках выраженный синтез TNFa. В этих клетках пептиды LL-37 и CRAMP (мышиный аналог LL-37) вызывают дозозависимую ингибицию синтеза TNFa, индуцированную poly(I:C). Так, в максимальной дозе 5 рМ LL-37 ингибирует этот синтез на 95%. С помощью циркулярного дихроизма показано, что poly(I:C) и LL-37 образуют прочный комплекс. В тесте ингибиции связывания TLR3 и poly(I:C) установлено, что CRAMP подавляет это связывание, но только в 100-кратном молярном избытке, т. е. обладает слабой ингибирующей активностью [13]. Вероятно, неспособность CRAMP ингибировать связывание poly(I:C) с TLR3 обусловлена неспособностью этого пептида полностью покрыть poly(I:C), длина которого колеблется от 8 до 200 kb. Тем не менее в присутствии CRAMP poly(I:C) теряет свои стимулирующие свойства, что, вероятно, связано с изменением структуры poly(I:C) и ее неспособностью попадать в эндосомы [13].
Роль HK и пептида LL-37 в активации кератиноцитов. В развитии псориатического воспаления участвуют цитокины IL-1P, IL-18 и IL-36 семейства IL-1 [27, 32]. IL-1P индуцирует и усиливает синтез основных провоспалительных цитокинов - TNFa, IL-6, IL-1P и IL-23, способствует дифференцировке, пролиферации ^И-клеток и синтезу ими цитокинов этого профиля [3].
Как известно, IL-1P и IL-18 синтезируются в виде неактивных предшественников, которые процессируются с помощью мультимолекулярного комплекса, инфламмасомы, формирующейся при активации клетки сигналами тревоги. Этот комплекс состоит из активированного PRR-рецептора, адапторного белка ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD) и прокаспазы-1. Результатом образования инфламмасомы является активация каспазы-1, которая расщепляет неактивные предшественники IL-1P и IL-18 с образованием активных секретируемых цитокинов.
Экспериментально показано образование инфламма-сомы в коже больных псориазом [18]. Одним из таких доказательств является факт образования в пораженной коже больного псориазом активной каспазы-1. При исследовании с помощью иммуноблоттинга установлено, что количество прокаспазы-1 ММ 50 кД одинаковое в пораженной и непораженной коже. Но количество расщепленной формы ММ 30 кД в пораженной коже в 6,3 раза выше, чем в непораженной. Кератиноциты больных псориазом являются интенсивными продуцентами IL-1P [18].
В настоящее время идентифицировано несколько факторов, индуцирующих образование инфламмасом в кера-тиноцитах. К таким факторам относится, например, УФ-облучение в дозах, соответствующих физиологическим нормам. Инфламмасома, образующаяся под влиянием этого воздействия, состоит из рецептора NALP1 из группы NLR-
- 278 -
ОБЗОРЫ
рецепторов, адапторного белка ASC и каспазы-1. Результатом работы этой инфламмасомы является секреция кератиноци-тами IL-ip [8]. В физиологических дозах IL-1 повышает резистентность организма, поэтому с этим повышением может быть связан положительный эффект УФ-облучения.
Другим фактором, который может вызывать в кератиноци-тах образование инфламмасомы, считают появление в цитоплазме клетки эукариотической ДНК. В норме ДНК в клетке находится только в ядре и митохондриях. Появления в цитоплазме клетки двуспиральной ДНК является чрезвычайной ситуацией и рассматривается клеткой как сигнал тревоги, на который должна последовать ответная защитная реакция. Эукариотическая ДНК в цитоплазме распознается семейством структурно родственных рецепторовp200, кодируемых генами группы ISG (IFN-stimulatedgenes). Все рецепторы этого семейства содержат консервативный C-концевой домен, состоящий из 200 аминокислот (HIN-200) и обладающий способностью распознавать и связывать эукариотическую ДНК. В керати-ноцитах выявлено несколько рецепторов этого семейства, в частности рецептор AIM2 (absent in melanoma), который можно рассматривать как классический представитель семейства рецепторов PRR. Этот рецептор содержит N-концевой пири-новый домен (PYD-домен), привлекающий адапторный белок ASC, и, как отмечалось выше, C-концевой домен HIN-200 [15]. Распознавание внутриклеточной ДНК доменом HIP-200 рецептора AIM2 ведет к образованию инфламмасомы и в итоге к синтезу и секреции кератиноцитами IL-ip и IL-18 [9].
В цитоплазме 80% кератиноцитов, выделенных из псориатической бляшки, в отличие от кератиноцитов, выделенных из здоровой кожи или кожи больных атопическим дерматитом, выявляют фрагменты ауто-ДНК. Параллельно с этим в кератиноцитах резко повышен синтез рецептора AIM2. Уровень экспрессии мРНК AIM2 в 50 раз выше, чем в непораженной коже, и этот повышенный уровень четко коррелирует с повышенным синтезом кератиноцитами IL-ip [6].
Данные о роли инфламмасомы AIM2 в синтезе IL-ip ке-ратиноцитами псориатической кожи получили подтверждение на модели первичной культуры кератиноцитов. Показано, что в этой культуре ДНК (геномная ДНК или poly(dA:dT)), INF-y или TNFa по отдельности синтез IL-ip не вызывали. Но в ке-ратиноцитах, предварительно обработанных совместно IFN-y и TNFa, липосомальная трансфекция клеток ДНК провоцировала существенное увеличение продукции IL-ip. Этот синтез зависел от образования в кератиноцитах инфламмасомы AIM2, так как нокдаун с помощью интерферирующей РНК полностью отменял синтез IL-ip. Роль цитокинов в индукции синтеза IL-ip была праймирующей. IFN-y индуцировал экспрессию AIM2 мРНК, TNFa усиливал синтез про-IL-ip [6].
Учитывая способность пептида LL-37 эффективно переносить НК через цитоплазматическую мембрану, полагаем логичным провести исследование роли пептида LL-37 в индукции с помощью ДНК синтеза IL-ip в кератиноцитах. Оказалось, что при добавлении LL-37 флюорохроммеченная ДНК быстро появлялась в цитоплазме клетки. Однако синтеза IL-ip не происходило. Не происходило также и образования инфламмасомы AIM2. С помощью копреципитации показано, что в цитоплазме клетки пептид LL-37 образует прочный комплекс с ДНК и, по всей видимости, препятствует связыванию ДНК с доменом NIP-200 рецептора AIM2 [6].
В исследованиях роли ауто-ДНК в индукции инфламма-сомы имеются некоторые неясности. Во-первых, как появляется ауто-ДНК в цитоплазме кератиноцитов? Как отмечалось выше, внеклеточная ДНК плохо подвергается эндоцитозу, и в плазмацитоидные клетки она проникает с помощью пептида LL-37. Поэтому внеклеточная ДНК, выделившаяся из погибающих клеток, не может быть активатором воспаления, так как она либо сразу разрушается нуклеазами, или образует комплекс с пептидом LL-37. Этот комплекс, как показали авторы, утрачивает способность стимулировать синтез IL-ip. Поэтому в культуре первичных кератиноцитов для доказательства роли
ДНК в образовании инфламмасомы AIM2 была применена трансфекция с помощью липофектамина. Такая передача ДНК в условиях in vivo малореальна. Полагаем, что появление в цитоплазме ДНК есть результат межклеточного обмена, например, с помощью экзосом - микровезикул размером 30-90 нм, содержащим белки, фрагменты РНК и ДНК размером до i000 пар оснований [23]. Экзосомы выделяются стареющими клетками и могут сливаться с соседними кератиноцитами, в результате чего ДНК появляется в цитоплазме клетки. Возможно также появление ДНК в цитоплазме в результате вытекания из ядра при нарушении проницаемости ядерной мембраны.
Таким образом, пептид LL-37 помогает ДНК проникнуть в кератиноциты, но препятствует ее взаимодействию с рецептором AIM2. Но в отношении TLR стимулирующий эффект пептида LL-37 в кератиноцитах сохраняется. Это проявляется в способности пептида индуцировать в повышенную экспрессию TLR9 [25]. Вероятно, поэтому в кератиноцитах пораженной кожи в отличие от таковых непораженной кожи и кожи больных атопическим дерматитом существенно повышена экспрессия TLR9 [24]. В дерме кожи больных выявляют большое количество TLR9+-клеток, большинство которых колока-лизуется с пептидом LL-37. В присутствии этого пептида как геномная ДНК, так и CpG-мотивы ДНК выраженно повышают в кератиноцитах экспрессию IFNA2 и IFNB i mRNA и синтез IFN I типа. Интересно, что стимуляция синтеза IFN I типа в кератиноцитах происходила только в том случае, если сначала добавлялся пептид LL-37, а затем CpG [25].
Эффект пептида LL-37 как стимулятора псориатического воспаления проявляется еще и в том, что он является ингибитором апоптоза кератиноцитов и, следовательно, активатором незлокачественной пролиферации кератиноцитов. В значительной степени это связано с тем, что пептид LL-37 резко снижает активность каспазы-3, стимулированной классическим индуктором апоптоза камптотецином. Параллельно с этим пептид LL-37 индуцирует в кератиноцитах экспрессию антиапоптотических генов COX2 и IAP-2 [i2].
Возможное применение пептида LL-37 в лечебных целях. Из представленных данных видно, что эндогенный антимикробный пептид LL-37 может давать как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на синтез провоспалительных цитокинов.
На основании своих экспериментов R. Lande и соавт. [2i] считают, что пептид LL-37 является главным стимулятором псориаза. Являясь сигналом тревоги, пептид LL-37 синтезируется в повышенном количестве при различных повреждениях кожи, что способствует ее более быстрому заживлению. Но при повреждениях кожи из погибающих клеток может освобождаться и ауто-ДНК/РНК, которые, соединяясь с LL-37, индуцируют более сильную, чем это нужно для заживления раны, воспалительную реакцию. Результатом этого могут быть аккумуляция в дерме pDC и непрерывный синтез IFN-a. Этот цитокин вызывает созревание и активацию mDC, синтез провоспалительных цитокинов и активацию Thi-клеток. Поэтому антагонисты пептида LL-37 можно рассматривать как терапевтическое средство для лечения псориаза.
В организме человека антагонистами пептида LL-37 являются белки сыворотки крови, а более конкретно - аполи-попротеин A-i [i7, 33]. Этот белок, связываясь с пептидом LL-37, полностью подавляет его цитотоксическую и антибактериальную активность. Представляют интерес результаты исследований, направленных на подавление аполипопро-теином или его аналогами связывания пептида LL-37 с НК, что может привести к подавлению образования патогенного комплекса НК/КЬ-37. Возможно также рассмотрение в качестве лечебного средства анионных полимеров типа гепарина, подавляющих связывание пептида с НК.
На основании своих экспериментов J. Schauber и соавт. [3i] считают, что сам пептид LL-37 может применяться в качестве ингибитора псориатического воспаления, так как он подавляет связывание ДНК с рецептором AIM2 и тем самым
- 279 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
подавляет образование IL-1p. Предлагая это направление в лечении псориаза, авторы исходят из экспериментальных и клинических данных о том, что такие лечебные средства, как УФ-облучение и препараты витамина D3, применяющиеся при псориазе, повышают уровень пептида LL-37 в коже, поэтому дают хороший лечебный эффект [28, 34].
Однако трудность выбора направления использования пептида LL-37 в лечебных целях связана с неясностью, на каком этапе воспалительного процесса IFN-a и IL-1P вносят наибольший вклад в его развитие. Неправильная оценка этого вклада может привести только к усилению воспаления.
Заключение. Процесс развития патологического процесса в коже характеризуется определенной стадийностью. На ранней стадии воспаления происходят инфильтрация кожиpDC и повышенная продукция IFN-a [25]. IFN-a дает множественный иммуностимулирующий эффект на клетки иммунной системы, в частности активирует mDC и T-клетки. В поздней стадии в коже pDC отсутствуют, а преобладают mDC [4, 35]. Провоспалительные цитокины TNFa и IL-6, синтезируемые этими клетками, а также IL-ip, синтезируемый кератиноцитами, привлекают в кожу и активируют Thi- и ТЫ7-клетки. IFN-у и IL-17A/F, синтезируемые этими клетками, активируют Th22-и Tc22-клетки и продукцию этими клетками IL-22, который совместно с IL-20 в итоге индуцирует специфическое псориатическое воспаление [33]. Таким образом, можно проследить последовательное преобладание в коже следующих клеточных групп: pDC/mDC-Th1/Th17-Th22/Tc22. По всей видимости, наиболее целесообразным является применение пептида LL-37 на ранних этапах развития воспаления с целью прерывания синтеза pDC/mDC IFN-a и провоспалительных цитокинов. На поздних стадиях при развитии функционально активной популяции ^П-клеток индуцирующая роль пептида LL-37 практически отсутствует, и, вероятно, оправданным могло было быть применение препаратов IFN I типа, ингибиция которых с помощью LL-37 оказалась целесообразной на первых этапах. IFN I типа и особенно IFN-P являются мощными ингибиторами функциональной активности ^П-клеток [29], играющих центральную роль в псориатическом воспалении.
ЛИТЕРАТУРА
1. БудихинаА. С., Макаров Е. А., ПинегинБ. В. Применение проточной цитометрии для оценки противомикробной активности кате-лицидина LL-37 // Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 1. - С. 35-37.
2. Кулаков В. В., Макаров Е. А., ПащенковМ. В. и др. Цитотоксический эффект пептида LL-37 на перевиваемые миело- и лимфо-бластоидные клетки человека // Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 2. - С. 75-77.
3. Acosta-Rodriguez E. V, Napolitani G., Lanzavecchia A., Sallusto F. Interleukin 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T pelper cells // Nat. Immunol. - 2007. - T. 8. - P. 942-948.
4. Albanesi C. C., Scarponi S., Pallotta R. et al. Chemerin expression marks early psoriasis skin lesions and correlates with plasmacytoid dendritic cell recruitment // J. Exp. Med. -2009. - Vol. 206. - P. 249-258.
5. Bianchi M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger // J. Leukoc. Biol. - 2007. - Vol. 81. - P. 1-5.
6. Dombrowski Y., Perik M., Koglin S. et al. Cytosolic DNA triggers inflammasome activation in keratinocytes in psoriatic lesions // Sci. Transl. Med. - 2011. - 3(82). - 82ra38.
7. DorschnerR. A., Pestniamasp V K., Tamakuwata S. et al. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin antimicrobial peptides active against group A Streptococcus // J. Invest. Dermatol. - 2001. - Vol. 117. - P. 91-97.
8. Feldmeyer L., Keller M., Niklaus G. et al. The inflammasome mediates UVB-induced activation and secretion of interleukin-1p by keratinocytes // Curr. Biol. 2007. - Vol. 17. - P. 1140-1145.
9. Fernandes-Alnemri T., Yu J. W., Datta P. et al. AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA // Nature. - 2009. - Vol. 458. - P. 509-513.
10. Ganguly D., Chamilos G., Lande R. et al. Self-RNA-antimicrobial peptide complexes activate human dendritic cells through TLR7 and TLR8 // J. Exp. Med. - 2009. - Vol. 206. - P. 1983-1994.
11. Guiducci C., Ott G., Chan J. H. et al. Properties regulating the nature of
the plasmacytoid dendritic cell response to Toll-like receptor 9 activation // J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 203. - P. 1999-2008.
12. ChamorroC. J., WeberG., GronbergA. et al. The human antimicrobial peptide LL-37 suppresses apoptosis in keratinocytes // J. Invest. Dermatol. - 2009. - Vol. 129. - P. 937-944.
13. HasanM., Ruksznis C., Wang Y. et al. Antimicrobial peptides inhibit polyinosinic-polycytidilic acid-induced immune responses // J. Immunol. - 2011. - Vol. 187. - P. 5653-5659.
14. Heilborn J. D., Nilsson M. F., Kratz G. et al. The cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 is involved in re-epithelization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium // J. Invest. Dermatol. - 2003. - Vol. 120. - P. 379-389.
15. Hornung V, Ablasser A., Charrel-DennisM. et al. AIM2 recognizes cytosolic dsDN and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC // Nature. - 2009. - Vol. 458. - P. 514-519.
16. HurtadoP., Peh C. A. LL-37 promotes rapid sensing of CpG oligode-oxynucleotides by B lymphocytes and plasmacytoid dendritic cells // J. Immunol. - 2010. - Vol. 184. - P. 1425-1435.
17. Johansson J., Gudmundsson G. H. RottenbergM. E. et al. Conformation-dependent antibacterial activity o the naturally occurring human peptide LL-37 // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P. 3718-3724.
18. Johansen C., Moeller K., Kragballe K., Inversen L. The activity of caspase-1 is increased in lesional psoriatic epidermis // J. Invest. Dermatol. - 2007. - Vol. 127. - P. 2857-2864.
19. Kalergis A. M., Ravetch J. V. Inducing tumor immunity through selective involvement of activating Fcy receptors on dendritic cells // J. Exp. Med. - 2002. - Vol. 19. - P. 1653-1659.
20. Lande R., Ganguly D., Facchinetti V. et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus // Sci. Transl. Med. -2011. - N 3. - P. 73ra19.
21. Lande R., Gregorio J., Facchinetti V. et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide // Nature. -2007. - Vol. 449. - P. 564-569.
22. Lee P. H. A., Ohtake T., Zaiou M. et al. Expression of an additional cathelicidin antimicrobial peptide protects against bacterial skin infection // PNAS. - 2005. - Vol. 102. - P. 3750-3755.
23. LiX. B., Zang Z. R., Schluesener H. J., Xu S. Q. Role of exosomes in immune regulation // J. Cell. Mol. Med. - 2006. - Vol. 10. - P. 364-375.
24. MillerL. S., Sorensen O. E., LiuP. T. et al. TGF-alpha regulates TLR expression and function on epidermal keratinocytes // J. Immunol. -2005. - Vol. 174. - P. 6137-6143.
25. Morizane S., Yamasaki K., Muhleisen B. et al. Cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 in psoriasis enables keratinocyte reactivity against TRR9 ligands // J. Invest. Dermatol. - 2012. - Vol. 132. - P. 13-143.
26. Nestle F. O., Curdin C., Tun-Kyi A. et al. Plasmacytoid predendritic cells initiate psoriasis through interferon-a production // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - P. 135-143.
27. Nestle F. O., Kaplan D. H., Barker J. Psoriasis // N. Engl. J. Med. -2009. - Vol. 361. - P. 496-509.
28. Peric M., Koglin Y., Dombrowski Y. et al. Vitamin D analog differentially control antimicrobial peptide «alarmin» expression in psoriasis // PloS One. - 2009. - N 4. - eb340.
29. Ramgolam V. S., Sha Y., Jin J. et al. IFN-P inhibits human Th17 cell differentation // J. Immunol. - 2009. - Vol. 183. - P. 5418-5427.
30. Sandgren S., Wittrup A., Chen A. et al. The human antimicrobial peptide LL-37 transfers extracellular DNA plasmid in nuclear compartment of mammalian cells via lipid rafts and proteoglycan-dependent endocytosis // J. Biol. Chem. - 2004. - N 27. - P. 17951-17958.
31. Schauber J., Dombrowski Y., Besch R. Pathogenic DNA. Cytsolic DNA promotes inflammation in psoriasis // Cell Cycle. - 2011. - N 10. - P. 3038-3039.
32. Shepherd J., Little M. C., Nicklin J. et al. Psoriasis-like cutaneous inflammation in mice lacking interleukin-1 receptor antagonist // J. Invest. Dermatol. - 2004. - Vol. 122. - P. 665-669.
33. Wang Y., Agerberth B., Lothgren A. et al. Apolipoprotein A-1 binds and inhibits the antibacterial/cytotoxic peptide LL-37 // J. Biochem. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P. 33115-33118.
34. Vahavihu K., Ala-HouhalaM., Peric M. et al. Narrowband ultraviolet B treatment improves vitamin D balance and alters antimicrobial peptide expression in skin lesions of psoriasis and atopic dermatitis // Br. J. Dermatol. - 2010. - Vol. 163. - P. 321-328.
35. WolkK., Haugen H. S., Xu W. et al. IL-22 and IL-20 are key mediators of the epidermal alterations in psoriasis while IL-17 and IFN-y are not // J. Mol. Med. - 2009. - Vol. 87. - P. 523-536.
Поступила 13.06.12
- 280 -
