CC BY
41
УДК: [612.017.1:616-097):612.411/418]:612.419
Н.Б. Протопопова, К.В. Гайдуль, В.А. Козлов
РОЛЬ АНТИГЕНАКТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ СТВОЛОВОЙ КРОВЕТВОРНОЙ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА
ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
С целью исследования влияния клеток селезенки иммунизированных эритроцитами барана (ЭБ), а также активированных ЛПС или Кон А мышей (СВАхС57В1/6)П на пролиферативную активность КОЕс-11 костного мозга сингенных мышей использовали следующие экспериментальные подходы: в брюшную полость интактным животный помещали фрагменты селезенки иммунизированных антигенами сингенных мышей; в брюшную полость интактным животным помещали диффузионные камеры из пластагара, содержащие ангиген-стиму-лированные клетки селезенки. Установлено, что активированные ЭБ, ЛПС и КонА клетки селезенки обладают выраженным стимулирующим влиянием на пролиферативную активность стволовой кроветворной клетки костного мозга. Было также показано, что клетками-продуцентами колониестимулирующей активности являлись антигенактивированные лимфоциты селезенки. Таким образом, было установлено, что при антигеном воздействии существует дистантный гуморальный механизм, регулирующий функциональную активность СКК костного мозга со стороны селезенки.
Ключевые слова: антигены, стволовая кроветворная клетка, пролиферация
Пролиферативная активность стволовой кроветворной клетки (СКК) контролируется в организме на уровне межклеточных взаимодействий и/или гуморальными факторами. Антиген-сти-мулированные макрофаги и лимфоциты участвуют в регуляции функциональной активности СКК костного мозга, прямо воздействуя на СКК и клетки гемопоэтического микроокружения, а также посредством секретируемых ими факторов локально и при поступлении в костный мозг гуморальным путем с последующим действием на пролиферативные процессы и колониеобразующую активность клеток костного мозга [1, 2, 3,4].
Большинство клеточных и гуморальных реакций в ответ на введение животным различных антигенов формируется с участием периферических лимфоидных органов. Так, при внутривенном введении антигенов формирование иммунного ответа происходит преимущественно в селезенке, а при подкожном введении — в лимфатических узлах [5, 6].
Многочисленные литературные данные указывают па активное участие СКК костного мозга в иммунном ответе. В то же время вопрос о влиянии периферических лимфоидных органов на функциональную активность СКК костного мозга в процессе формирования иммунного ответа в настоящее время остается открытым.
Материалы и методы
В опытах использовали мышей (самцов и самок) (СВАхС57В1/6) Р1 в возрасте 2,5 месяца и мышей СВ А 1,5 года, полученных из питомника РАМН «Столбовая», а также из размноженных в экспериментально-биологической клинике животных ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН племенных ядер, полученных из питомника «Столбовая». При получении биологического материала от экспериментальных животных применяли метод цервикальной дислокации.
Для исследования влияния клеток селезенки иммунизированных эритроцитами барана (ЭБ) и активированных липополисахаридом (ЛПС) или конканавалином А (КонА) мышей на пролиферативную активность КОЕс-11 костного мозга использовали следующие экспериментальные подходы:
1. в брюшную полость интактным животным помещали фрагменты селезенки иммунизированных антигенами сингенных мышей;
2. в брюшную полость интактным животным помещали диффузионные камеры из пластагара, содержащие ЭБ- и ЛПС-стимулированные клетки селезенки.
До использования в экспериментах пласта-гаровые диффузионные камеры хранили в 96% этаноле. Для подготовки к использованию плас-тагаровые диффузионные камеры помещали
в стерильный физиологический раствор на 48 часов, производя 2-3 смены жидкости. Готовая камера представляет собой полупрозрачный цилиндр диаметром 12-15 мм, высотой 0,5-0,7 мм. Суспензию клеток вводили в камеру с помощью шприца, протыкая иглой боковую стенку камеры.
Облучение животных проводилось на аппарате «РУМ-25» при мощности дозы 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВт, силе тока 10 мА, фильтре А1-3. Во всех исследованиях мыши-реципиенты получали летальную дозу 8,5-9 Гр.
Число пролиферирующих СКК определяли с помощью метода тимидинового «самоубийства», основанного на том, что радиоактивно меченый :|Н-тимидина, предшественник ДНК, обладающий высокой удельной радиоактивностью, включается только в клетки, находящиеся в фазе синтеза ДНК (в 8-фазе), и «убивает» их [7].
Полученные данные обрабатывались статистически с использованием ^критерия Стьюдента (при р<0,05; р<0,01).
Результаты и обсуждение
В первой серии экспериментов в брюшную полость интактных сингенных мышей помещали фрагменты селезенки мышей, иммунизированных тимусзависимыми антигенами (ТЗА) и тимуснезависимыми антигенами (ТНА). Мышей иммунизировали в/в ЛПС (50 мкг), ЭБ (2*108) и КонА (50 мкг), после чего через 24 часа у них забирали селезенки, измельчали их на кусочки 1-2 мм и помешали в брюшную полость сингенных мышей из расчета одна селезенка на мышь, согласно рекомендациям [8]. В качестве контроля использовали мышей, в брюшную полость которых помещали кусочки селезенки животных, которым за 24 часа вводили 0,5 мл физиологического раствора. Пролиферацию КОЕс-11 в костном мозге определяли через 72 часа.
Наблюдали статистически достоверное (р<0,01) повышение уровня пролиферации КОЕс-11 костного мозга в 2,8; 2,7 и 2,7 раза в соответствии с имплантированными фрагментами селезенок мышей, иммунизированных соответственно ЭБ, ЛПС и КонА, что отражено в таблице
1. В то же время пролиферация КОЕс-11 костного мозга у контрольных мышей не изменялась, следовательно, фрагменты селезенки не оказывали влияния на пролиферацию СКК.
Из полученных данных следует, что помещенные в брюшную полость селезеночные фрагменты могли повлиять на пролиферацию СКК костного мозга только через продукцию гуморальных факторов в брюшную полость. Следует отметить, что вырабатывали данную колониестимулирующую активность (КСА) только клетки селезенок,
взятых от иммунизированных мышей-доноров (т.е. в ответ на введение ТЗА и ТНА мышам-до-норам). Это нашло подтверждение в дальнейших экспериментах с использованием диффузионных камер.
Клеточную суспензию получали из селезенок мышей (СВАхС57В1/6)Е1, иммунизированных в/в ЭБ (2><108) и ЛПС (50 мкг) за 72 часа до забора органа. В одну диффузионную камеру из плас-гагара помещали 50х 106 клеток. Стенки камеры свободно пропускают ростовые гуморальные факторы, но не клетки [9]. Затем по 2 камеры помещали в брюшную полость интактным сингенным животным. В качестве контроля использовали мышей, в брюшную полость которым помещали камеры со спленоцитами мышей, получавших физиологический раствор вместо антигена. В данных экспериментах наблюдали достоверное (р<0,01) повышение уровня пролиферации СКК костного мозга у мышей с диффузионными камерами, содержащими ЭБ- и ЛПС-стимулирован-ные спленоциты, выделенные от мышей, иммунизированных ЭБ и ЛПС, соответственно в 3,1 и 3,2 раза по сравнению с контролем (Таблица 2).
Таблица 1
Влияние фрагментов селезенки (СВАхС57В1/6)Е1 мышей, иммунизированных ЭБ, ЛПС, и КонА на пролиферативную активность КОЕс-11 сингенных интактных реципиентов
Экспериментальная группа Число КОЕс-И на 5x105 клеток костного мозга % КОЕс в Э-фазе
- Н3-тимидин + Н3-тнмидин
Контроль 15,09±0,48 13,31±1,0 11,3%
Фрагменты селезенки (интактные) 15,17±0,92 13,36+0,80 10,5%
Фрагменты селезенки (ЭБ) 14,65±0,64 10,43+0,63 28,7%
Фрагменты селезенки (ЛПС) 14,88±0,87 10,46+0,81 29,5%
Фрагменты селезенки (КонА) 17,85±0,54 12,67+0,70 28,6%
Таблица 2
Влияние помещенных в диффузионные камеры из пластагара клеток селезенки (СВАхС57В1/6)Р1 мышей, иммунизированных ЭБ, ЛПС, на пролиферативную активность КОЕс-11
сингенных интактных реципиентов
Экспериментальная группа Число КОЕс-11 на 5х 105 клеток костного мозга % КОЕс в Б-фазе
- Н3-тимидин + Н3-тимидин
Контроль 12,42±0,73 11,50+0,91 7,2%
Клетки селезенки (интактные) 12,93±0,64 11,89+0,88 8,5%
Клетки селезенки ОБ) 15,54+0,79 11,41+0,65 26,4 %
Клетки селезенки (ЛПС) 14,88±0,87 10,53+0,87 27,6%
Таким образом, фактически продемонстрировано влияние антигенактивированных клеток селезенки на пролиферативную активность СКК костного мозга: клетки селезенки, активированные ЭБ и ЛПС, стимулируют пролиферацию СКК костного мозга путем продукции ростовых факторов дистантного действия, т.к. стенки диффузионной камеры проницаемы только для растворимых молекул.
Учитывая эти собственные данные и данные литературы о продукции цитокинов клетками селезенки животных, логично было предположить, что антигенактивированные клетки селезенки стимулируют СКК костного мозга посредством продукции цитокинов (например ИЛ-3, ГМ-КСФ или М-КСФ). Так, например, ранее нами было показано, что при антигенном воздействии стимуляция колониеобразующей активности СКК костного мозга мышей имеет антигенспецифи-ческий характер и обеспечивается участием Т- и В-лимфоцитов [10]. Поэтому на следующем этапе работы представлялось важным установить клеточный источник продукции факторов дистантной регуляции СКК костного мозга.
Мышей (СВАхС57В1/6)Р1 иммунизировали ЭБ и ЛПС за 72 часа до извлечения селезенок, из которых затем готовили суспензию макрофагов (МФ) и лимфоцитов (ЛФ). В диффузионные камеры помещали ЛФ (ЗОхЮ6) и МФ (20><106), затем по две камеры помещали в перитонеальную полость интактных сингенных мышей, после чего через 24 часа определяли пролиферативную активность КОЕс-11 костного мозга.
Из данных, представленных в таблице 3, видно, что антигенактивированные (ЭБ и ЛПС) лимфоциты селезенки достоверно (р<0,05) усиливали пролиферацию КОЕс-11 в 2,7 и 4 раза со-
Таблица 3
Влияние помещенных в пластагаровые диффузионные камеры антигенактивированных (ЭБ и ЛПС) лимфоцитов и макрофагов селезенки на пролиферативную активность КОЕс-11 костного мозга сингенных (СВАхС57В1/6) П мышей
Экспериментальная группа Число КОЕс-11 на 5х105 клеток костного мозга % КОЕс в Б-фазе
- Н3-тимидин + Н3-тимидин
Контроль 15,31+0,43 14,10±0,65 7,8%
Лимфоциты (интактные) 14,21+0,48 12,90±0,98 9,1%
Макрофаги (интактные) 13,15±0,55 11,73±0,63 11,3%
Лимфоциты (ЭБ) 15,12±0,69 11,45±0,52 24,5%
Лимфоциты (ЛПС) 11,23±0,45 7,10+0,39 36,6%
Макрофаги (ЭБ) 11,81 ±0,91 10,13±0,85 14,4%
Макрофаги (ЛПС) 13,41 ±0,75 12,13±0,82 10,3%
ответственно, тогда как антиген-активированные МФ не влияли на пролиферативную активность СКК костного мозга. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в наших экспериментах клегками-продуцентами КСА являлись лимфоциты селезенки, активированные тимус -зависимыми и тимуснезависимыми антигенами. Возможно, обнаруженная нами продукция факторов антигенактивированных лимфоцитов селезенки соответствует продукции антигене -пецифических факторов, выделяемых клетками лимфатических узлов, с митогенной активностью в отношении Т- и В-лимфоцитов [11, 12]. Таким образом, представленные результаты позволяют говорить о выраженном, стимулирующем влиянии активированных ТЗА и ТНА клеток селезенки на пролиферативную активность стволовой кроветворной клетки костного мозга.
Известно, что в процессе формирования иммунного ответа на различные антигены большинство клеточно-гуморальных реакций протекает в периферических лимфоидных органах. Исследования продукции гуморальных факторов после антигенной стимуляции клетками иммунных лимфатических узлов, клетками селезенки показали присутствие в сыворотке крови гемопоэтинов, влияющих на функциональную активность СКК костного мозга [8, 13-15]. Примечателен тот факт, что у спленоэтомиро-ванных животных в ответ на внутривенное или внутрибрюшинное введение тимусзависимых или тимуснезависимых антигенов уровень пролиферации СКК костного мозга не изменялся [16]. Однако при введении ЭБ в подушечку лапы под апоневроз происходило увеличение уровня пролиферации СКК костного мозга [17]. Исходя из этого, можно предположить, что стимуляция пролиферации СКК обусловлена влиянием антигенактивированных клеток лимфатических узлов. В дополнение можно привести данные, полученные с использованием системы адаптивного переноса, когда спленэктомированным мышам вводили ЭБ-стимулированные лимфоциты (но не МФ) селезенки и наблюдали повышение функциональной активности КОЕс костного мозга [18].
Следовательно, можно полагать, что антигенактивированные клетки селезенки и лимфатических узлов способны участвовать в регуляции функциональной активности СКК костного мозга, причем обладают стимулирующим влиянием и осуществляют свое действие как прямо, так и посредством продукции гуморальных факторов.
Учитывая тесную взаимосвязь функциональной активности СКК с процессом формирования иммунного ответа, можно сделать предполо-
шпые
ность
ьтаты
пери-
ялись
имус-
ігена-
гкция
дето»
[генс-
еками
)СТЫО
акпм
іЛЯЮТ
влия-
езеи-
ІОВОІІ
ч им-бол ь-про-анах. фак-ками и се-кро-іа.'іь-1-15]. шро-■ или
1МІ.ІХ
про-
ялся
папы
овпя
ходя
ЯЦНЯ і аи-ских
МЫС,
IT1IB-
мы-
1ИТЫ
енне
ного
гигс-
іатп-
іцни
моз-
шем
а к и
юн.
:аль-
юва-
оло-
женне, что на уровне целостного организма при антигенном воздействии регуляция функций СКК костного мозга со стороны селезенки осуществляется клеточно-гуморальным11 механj із-мами дистантного характера: ангигенстимули-рованные клетки селезенки продуцируют КСА, которая попадает в кровяное русло и током крови доставляется в костный мозг, где и реализует свое стимулирующее влияние иа пролиферацию СКК костного мозга. Нами было установлено существование такого дистантного гуморального механизма, регулирующего функциональную активность СКК костного мозга со стороны селезенки, который обеспечивается участием АГ-стимулированных лимфоцитов и имеет стимулирующий характер влияния, что было выяснено при использовании выбранных памп экспериментальных подходов.
THE ROLE OF ANTIGEN-ACTIVATED SPLEEN CELLS IN REGULATIN OF HEMATOPOIETIC STEM CELL PROLIFERATIVE ACTIVITY
N.B. Protopopova, K.V. Gaidul, V.A. Kozlov
The aim of investigation was the researching of influence of spleen cells immunized by red hlood sheep cells (RBSC), LPS, Con A from mice (CBAxC57Bl/6) FI to proliferation activity of bone marrow CFUs-11 from singenic mice. The experimental approaches were realised: 1) the fragments of spleen from immunized mice were located into abdominal cavity: 2) the diffusion plastagar chambers including stimulated spleen cells were located into abdominal cavity of intact mice. It was established that spleen ceils activated with RBSC, LPS and ConA demonstrate rich stimulating influence to proliferative activity of bone marrow stem cells. The cells producing colony-stimulatory activity were antigen-activated spleen lymphocytes. So, it was demonstrated the existence of distant humoral regulatory mechanism from spleen to functional activity of bone marrow stem cells.
Литература
1. Гольдберг, ИД. Механизмы локальной регуляции кроветворения / Е.Д. Гольдберг, Л.М. Дыгап, Е.Ю. Шерстобоев. - Томск. 2000. - 148 с.
2. Тотолян, Л.Л. Клетки иммунной системы / А.А. Тотолян, П.С. Фрсйдлин. — С.-Пб., 2000. — (Т. 1; Т. 2). -231с.
3. Bonnet, D. I laemopoietic stem cells / D. Bonnet //J. Pathol. - 2002. - Vol. 1997. - P. 130-440.
4. Lipopolysaccharides from distinct pathogenes induce different classes of immune responses in vivo / B. Pulendran, P. Kumar, C.W. Cutler, et al. //J. Immunol.
2001. - Vol. 107. - P. 5067-5076.
5. Петров. P.B. Иммуногенетика и искусственные антигены / P.B. Петров, P.M. Хаитов, P.M. Атауллаха-нов.-М.. 1983.-256 с.
6. Eihman. E.A. Alteration in graft-vs-host reactivity and in hematopoiatic stem cells of spleen cell, inocula from donor mice pretreated with pertussis antigen / E.A. Eihman, R.T. Bowser//J. Immunol. — 1972. — Vol. 108. — P. 253-260.
7. The effect of differing demand for blood cell production on DNA synthesis by hemopoietic colony forming cells in mice / A.J. Becker, E.A. McCulloch, L. Siminovitch,J.E. Till // Blood. - 1965. - Vol. 26. - P. 296-303.
8. Pietrangeli, C.E. Regulation of В lymphocyte production in bone marrow: mediation of the effects of the exogenous stimulants by adoptively transferred spleen cells / C.E. Pietrangeli, D.G. Osmond // Cell. Immunol. — 1987.
- Vol. 107. - № 2. - P. 348-357.
9. Билько, H.M. Развитие метода диффузионных камер в биологии и медицине/ Н.М. Билько// Гематология и переливание крови. — 1987. — № 22. — С. 59-64.
10. Kozlov, VA. Colony-forming activity of pluripo-tent stem cells in tolerant mice following antigen exposure / V.A. Kozlov. LG. Tzyrlova, K.V. Gaidul // Folia Biol.
- 1987. - Vol. 33. - P. 207-210.
11. Новиков, В.И. Сравнительная характеристика и некоторые аспекты биологического действия антнген-спецнфических факторов иммунных лимфатических узлов / В.И. Новиков, А.А. Власов, А.Л. Ковальчук // Иммунология. 1990. — № 2. — С. 31-34.
12. Иоников, В.И. Природа фактора, вырабатываемого клетками иммунных лимфатических узлов и его влияние на систему мононуклеарных фагоцитов / В.И. Новиков, А.А. Власов, АЛ. Ковальчук // Иммунология. - 1990. —№1. —С. 31-34.
13. Human spleen cell generation of factor generating human pluripotent stem cell, erithroid and myeloid progenitor cell growth / 1. Fabian, D. Douer, L. Lewitt, et al. // Blood. - 1985. - Vol. 65. - № 4. - P. 990-996.
14. Metcalf, П. Production of spleen and lymphoid cells of conditioned medium with erythroid and other hemopoietic colony stimulating activity / D. Metcalf, G. Johnson //J. Cell. Physiol. - 1978. - Vol. 96. - P.31-35.’
15. Tubiana, M. Regulation of pluripotent stem cell proliferation and differentiation: the role of long-range humoral factors/ M. Tubiana, E. Friendel //J. Cell. Physiol.
- 1982.-Vol. 1,- P. 13-21.
16. Gaidul, K.V. Proliferative activity of hemopoietic stem cell in splenectomized mice under antigenic effect / K.V. Gaidul, 1.А. Goldina, V.A. Kozlov // Radiomed. Pharmacother. - 1988. - Vol. 42. - № 6. - P. 427-428.
17. Гайдуль, K.B. Роль клеток селезенки в регуляции пролиферативной активности стволовой кроветворной клетки костного мозга в условиях антигенного воздействия / К.В. Гайдуль, Н.А. Гольдина// Оценка и коррекция состояния иммунной системы в клинике II эксперименте. — Новосибирск, 1987. — С. 135-141.
18. Гайдуль, К.В. Колониеобразующая активность стволовых кроветворных клеток у толерантных мышей при антигенном воздействии / К.В. Гайдуль, И.Г. Цыр-лова, В.А. Козлов // Бюл. эксперим. биол. — 1986. — №8. С. 209-210.
