CC BY
55
УДК 579.25
РОЛЬ АЛКАН ГИДРОКСИЛАЗЫ ALKB В ПРОЦЕССЕ ДЕСТРУКЦИИ АЛКАНОВ ШТАММОМ GORDONIA SP. 1D
Я.А. Делеган, Ю.Н. Кочаровская, М.Ю. Сафронова, А.А. Иванова,
К.В. Петриков, А.А. Ветрова
Штамм Gordonia sp. 1D, содержащий гены, кодирующие ферменты алкан гидроксилазы - CYP153 и негемовой гидроксилазы FADS-семейства alkB, способен к росту при температурах 24 и 45 °С в жидкой минеральной среде Эванса с алифатическим алканом (октан, нонан, декан, гексадекан, додекан или эйкозан) в качестве источника углерода и энергии. Для выявления роли алкан гидроксилазы alkB в процессе деструкции алканов получен мутантный штамм Gordonia sp. 1D alkB-, дефектный по гену алкан гидроксилазы alkB. Мутантный штамм, культивируемый в аналогичных условиях, не способен к росту на октане, нонане, декане и додекане, но утилизирует гексадекан и эйкозан. Степень деградации нефти мутантным штаммом при двух температурах составила приблизительно 20%. При температуре 24°С родительский штамм утилизировал нефть эффективнее, чем при 45°С (38% и 24% соответственно). Вероятно, алкан гидроксилаза, кодируемая геном alkB, является температуроза-висимой, и снижает свою активность с повышением температуры, что способствует увеличению степени деградации нефти штаммом Gordonia sp. 1D при температуре 24 °С по сравнению с 45 °С.
Ключевые слова: Gordonia sp., alkB, алканы, нефть, деградация, нокаут генов, гомологичная рекомбинация
Штаммы Gordonia являются известными деструкторами алканов [1-3]. Так как алканы являются основными (около 70%) составляющими большинства добываемой нефти, эти микроорганизмы играют важную роль в биоремедиации загрязненных нефтью территорий. Алкангидроксилазы - обширный класс ферментов деградации алканов, представленный в различных видах бактерий, грибов, дрожжей и водорослей [4, 5]. Ван Бейлен и Фанхофф рассматривают три основных категории алкан-деградирующих ферментных систем: разлагающие С1-С4 соединения (от метана до бутана, окисляются ферментами метанмонооксигеназного типа), С5-С16 соединения (от пентана до гексадекана, окисляются межмембранными ферментами с негемовым железом (семейство AlkB) или цитохромом P450 (семейство CYP153) и С17+ (длинноцепочечные алканы, окисляются малоизученными ферментными системами). В данной статье также отмечено, что микроорганизмы, способные разрушать алканы, могут содержать несколько алкангидроксилаз и, таким образом, потреблять различные субстраты.
Часто бактерии обладают генами только одной из вышеперечисленных систем, хотя и в нескольких копиях, что приводит к специфическому спектру утилизируемых алканов. Например, четыре
гомолога гена alkB обнаружены в Rhodococcus Бр. 015 [6], два гомолога alkB - у Gordonia Бр. SoCg [7]. Хотя большинство генов, кодирующих СУР153, были найдены в штаммах, где alkB отсутствовали [8], недавние исследования показали одновременное существование двух этих систем у ряда алкандеградирующих штаммов, таких как грамотрицательные Alcanivorax borkumensis SK2 [9] и Alcanivorax dieselolei В-5 [10], что указывает на возможную кооперацию alkB и СУР 153 при деградации широкого спектра алканов. Это явление наблюдали также у многих алкандеградирующих актинобактерий, включая Dietzia, Rhodococcus, Gordonia и других [11; 7; 12; 6; 13]. Однако взаимодействуют эти системы или действуют независимо, и какова их регуляция - пока непонятно.
Штамм Gordonia sp. Ш способен утилизировать широкий спектр алканов в диапазоне температур культивирования 20-50°С. При анализе генома штамма [14] выявлено присутствие генов нескольких различных алкан гидроксилаз — alkB, CYP153, а также генов нескольких менее распространенных гидроксилаз.
Цель данной работы - выявление роли алкан гидроксилазы alkB в процессе деструкции алканов родительским и мутантным (дефектным по гену alkB) штаммами Gordonia sp. Ш.
Материалы и методы
В работе изучали микроорганизм Gordonia Бр. Ш, выделенный из загрязненной нефтью почвы шламонакопителя (Москва), и мутантный штамм Gordonia Бр. Ш alkB-, дефектный по гену алкан гидроксилазы alkB (табл. 1).
Таблица 1
Штаммы и плазмиды, используемые в работе_
Характеристика Источник
Gordonia sp.1D Природный почвенный штамм НПЗ (г. Москва)
Gordonia sp. 1D alkB- AlkB-CmR мутант Данная работа
pEX18Tc E. coli cloning vector Invitrogen
pEX18/alkB Вектор рЕХ18, содержащий 3.2 kb фрагмент ДНК с геном alkB Данная работа
pEX18-F Плазмида, производная от pEX18/alkB и содержащая кассету резистентности к канамицину, клонированную по уникальному сайту Данная работа
Для получения мутантного штамма Gordonia sp. 1D (alkB-) сконструировали плазмиду pEX18/alkB. Ампликон целевого гена alkB (с плечами с каждой стороны ~1000 пн) получили путем реакции ДНК штамма 1D с праймерами alkB_for и alkB_rev (табл. 2). Праймеры были снабжены сайтами узнавания рестрикционными ферментами HindlII и EcoRI, что определило ориентирование ампликона в векторе. Ампликон очищали с помощью набора реагентов QIAquick PCR Purification Kit и обработан последовательно двумя рестрикционными ферментами — Hindill и £coRI.
Таблица 2
Праймеры, использованные для амплификации целевых генов
Последовательность Источник
alkB_for AAGAATTCCCGCTGAACGGGGTGAAT Данная работа
alkB rev ATAAGCTTCCAGGCCGATCAGTCCAC Данная работа
Cm_cas_for AATTCTCGAGTTACGCCCCGCCCTGCCACT Данная работа
Cm_cas_rev GGCTCGAGTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC Данная работа
Вектор рЕХ18Тс размером ~6300 п.н. также обработан этими рестрикционными ферментами, после чего выполнена реакция лигирования в стандартных условиях. Полученную лигазную смесь вводили в компетентные клетки E. coli DH5a, трансформанты отбирали на чашках с использованием бело-синего теста. Вставку проверяли полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Плазмиды наработаны в клетках E. coli DH5a. Полученный препарат очищен, выполнен его гидролиз по сайту XhoI. Параллельно получена кассета резистентности к канамицину посредством амплификации с праймерами, снабженными сайтами узнавания ферментом XhoI. Гидролизованная конструкция и кассета лигированы в стандартных условиях, отбор трансформантов выполняли на селективной среде с канамицином и посредством бело-синего теста. Вставку проверяли методом ПЦР, вставка, содержащая кассету размером приблизительно 700 пн , соответственно, большей массы, чем исходный ампликон.
Конечная конструкция (плазмида pEX18-F, рис. 1) наработана в клетках E. coli DH5a и очищена. Получен препарат концентрацией 400 нг/мкл. Конструкцию вводили в электрокомпетентные клетки родительского штамма Gordonia sp. 1D путем электропорации (3 импульса по 1.25 кВ, температурный шок 41°С 90 секунд).
Рис. 1. Схема получения конструкции
В качестве минеральной среды для культивирования термотолерантных нефтеокисляющих микроорганизмов использовали среду Эванса [15], в качестве полноценной - среду Лурия-Бертани (ЛБ) [16]. Бактерии культивировали на минеральных средах в течение 10 суток, на полноценных средах в течение 48 часов при температурах 24°С и 45°С.
Для определения спектра утилизируемых субстратов микроорганизмы культивировали в пробирках в жидкой среде Эванса с добавлением 2% (по массе/объему) алифатических углеводородов — октана, нонана, додекана, декана, гексадекана и эйкозана. Рост культур определяли визуально по помутнению среды.
Для изучения зависимости основных физиологических параметров растущих культур (численности жизнеспособных клеток и удельной скорости роста) от температуры штаммы выращивали в жидкой среде Эванса с добавлением нефти (2%) в качестве единственного источника углерода и энергии. Инокулят вносили до конечной концентрации около 1х106 КОЕ/мл.
Культивирование проводили при температурах 24°С и 45°С в течение 10 суток. Численность микроорганизмов в ходе культивирования при температурах 24 и 45 °С в жидкой минеральной среде в присутствии нефти (2% по объему) определяли с использованием метода серийных разведений с последующим высевом на богатую агаризованную среду Лурия-Бертани в трех повторах. Пробы культуральной жидкости отбирали каждые 48 часов.
Удельную максимальную скорость роста (Цщах) определяли как: 1 х
|1тах = —1—, где Хо - начальное число клеток, X - конечное число
Ь— ¿Гц
клеток, t и ^ - время [17].
Графические зависимости численности жизнеспособных клеток х от времени ? строили в полулогарифмических координатах 1пх=Д/). Удельную скорость роста на отрезке времени от ^ до Ь рассчитывали как тангенс угла наклона прямой на соответствующем участке t1-t2 графика динамики роста микроорганизмов.
Для определения нефтеокисляющей активности штаммы бактерий культивировали в колбах, содержащих 100 мл жидкой среды Эванса с 2 % нефти в течение 10 суток при 24 и 45°С. Общее содержание углеводородов нефти определяли методом ИК-спектрометрии. После окончания культивирования оставшуюся нефть экстрагировали четыреххлористым углеродом (1:1). Содержание углеводородов в экстракте определяли с помощью анализатора нефтепродуктов АН-2 (Россия) в соответствии с протоколом [18]. В качестве контроля использовали стерильную жидкую среду Эванса, содержащую 2 % нефти.
Концентрацию нефти в пробе водных растворов рассчитывали по формуле:
Х г , [мг/дм3],
где
С - концентрация нефти в элюате, найденная по показаниям прибора или градуировочной зависимости, мг/дм3;
У1 - объем элюата, дм3;
V- объем анализируемой водной пробы, дм ;
ч - степень разбавления элюата; если разбавление не проводилось, то7? =1.
Степень деградации нефти в колбах с микроорганизмами определяли по сравнению с колбами без микроорганизмов. Степень деградации нефти (С) определяли в культуральной среде через 10 дней по формуле:
С, % = хк Х1ии,
где
Хк - концентрация нефти в пробе с микроорганизмами, мг/дм ;
X] - концентрация нефти в контрольной пробе без микроорганизмов, мг/дм3.
Результаты и их обсуждение
Объектами изучения в данной работе являлись штамм Gordonia Бр. Ш, выделенный из загрязненной нефтью почвы шламонакопителя (Москва), и мутантный штамм Gordonia Бр. Ш alkB-, дефектный по гену алкан гидроксилазы alkB.
Штамм Gordonia sp. 1D содержит гены, кодирующие ферменты алкан гидроксилазы - CYP153 и негемовой гидроксилазы FADS-семейства alkB. В статье Нии с соавторами [19] высказано предположение, что субстратами гидроксилазы alkB в основном являются линейные алканы длиной С10-С16, а субстратами гидроксилазы CYP - короткие алканы длиной от С6. Тем не менее, Ван Бейлен с соавт. (2007) ранее указывали, что субстратами алкан гидроксилазы alkB могут быть алканы длиной от С5 и до С16 [4].
Исследуемые штаммы проанализированы на способность утилизировать различные алифатические углеводороды (табл. 3) при температурах 24°С и 45°С через 10 суток.
Таблица 3
Спектр субстратов, утилизируемых бактериями _при температурах 24 и 45°С_
Штаммы Октан Нонан Декан Додекан Гексадекан Эйкозан
24°С 45°С 24°С 24°С 45°С 45°С 24°С 45°С 24°С 45°С 24°С 45°С
1Б ++ + ++ ++ + + ++ + ++ ++ ++ ++
1Б (а1к В-) - - - - - - - - ++ + ++ +
++ очень хороший рост, + хороший рост, - отсутствие роста
Штамм Gordonia sp. Ш способен к деструкции алканов С8-С20 при двух температурах, что позволяет предположить, что оба гидроксилазных фермента активны в клетках как при температуре 24°С, так и при 45°С. Мутантный штамм по гену alkB утратил способность утилизировать алканы длиной до С12. Вероятно, в микроорганизме Gordonia Бр. Ш субстратами гидроксилазы alkB в основном являются линейные алканы длиной С8-С12, что частично согласуется с данными Ван Бейлен с соавт. [4].
На рис. 2 представлены кривые роста мутантного и природного штамма при росте в жидкой минеральной среде с нефтью при температурах 24°С и 45°С в течение 10 суток. Следует отметить, что при росте мутантного штамма в среде при температуре 45°С в период с 50 до 100 часов наблюдалось снижение численности микроорганизмов на 1 порядок, а в последующие 100 часов прирост биомассы составил 2 порядка.
Для более детального анализа влияния температуры на метаболические характеристики бактерий Ш и Ш ^ШВ) определили удельную скорость роста.
Рис. 2. Кривые роста микроорганизмов Ю и Ю (аШБ-) при культивировании в жидкой минеральной среде с 2% нефти в течении 10 суток при температурах 24 и 45°С
Таблица 4
Зависимость удельной скорости роста культур микроорганизмов от _температуры_
Температура Удельная скорость роста, ч"1
24 °С 45 °С
Ш 0,031 0,012
Ш (а1к Б") 0,026 0,052
Удельная скорость роста характеризует скорость размножения микроорганизмов. Полученные результаты демонстрируют, что аборигенный штамм ОоЫота sp. Ш, имеющий ген а/£Б, наиболее активно размножается при умеренной температуре (24°С), что соотносится с данными по степени деградации нефти (рис. 3). Показатель скорости размножения мутантного штамма наоборот в 2 раза выше при температуре 45°С, при этом степень деградации нефти при двух температурах составляла около 20%.
С повышением температуры растворимость углеводородов нефти в воде повышается. При температуре 45 °С алканы длиной до С12 (являющиеся наиболее токсичными), входящие в состав нефти, активно влияют на культуру. Аборигенный штамм ОоЫота sp. Ш имеет преимущество относительно мутантного микроорганизма, так как
способен к деградации алканов до С12, что подтверждается данными показателей степени деградации и динамики роста.
Рис. 3. Степень деградации нефти микроорганизмами Ю и Ю (аШБ-) при культивировании в жидкой минеральной среде через 10 суток
при температурах 24 и 45 °С
Микроорганизм, мутантный по гену а/Ш, в большей степени подвергается токсическому воздействию легких фракций нефти при повышенной температуре, поэтому прирост биомассы штамма ОоЫота sp. Ш а/Ш- наблюдается только через 100 часов. Данное явление, вероятно, обусловлено абиотической убылью токсичных алканов легкий фракций нефти из анализируемой системы.
Вероятно, алкан гидроксилаза, кодируемая геном а/Ш, является температурозависимой, и снижает свою активность с повышением температуры, что способствует увеличению степени деградации нефти штаммом ОоМота sp. Ш при температуре 24°С по сравнению с 45°С.
Работа выполнена при поддержке РФФИ мол_а № 18-34-00329.
Список литературы
1. Arenskötter M., Bröker D., Steinbüchel A. Biology of the Metabolically Diverse Genus Gordonia // Applied and Environmental Microbiology. 2004. V. 70 (6). P. 3195-3204.
2. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well / Y. Xue, X.Sun, P. Zhou [et
al]. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2003. V. 53. P. 1643-1646.
3. Isolation, identification, and performance studies of a novel paraffin-degrading bacterium of Gordonia amicalis LH3 / D. Hao, J.Q. Lin, X. Song [et al.] // Biotechnology and Bioprocess Engineering February. 2008. V. 13 (1). P. 61-68.
4. van Beilen J.B., Funhoff E.G. Alkane hydroxylases involved in microbial alkane degradation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 74 (1). P. 13-21.
5. Occurrence of diverse alkane hydroxylase alkB genes in indigenous oil-degrading bacteria of Baltic Sea surface water / S. Viggor, M. Jöesaar, E. Vedler [et al.] // Marine Pollution Bulletin. 2015. V. 101 (2). P. 507-516.
6. Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strains Q15 and NRRL B-16531 / L.G. Whyte, T.H.M. Smits, D. Labbe [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68 (12). P. 59335942.
7. Involvement of an alkane hydroxylase system of Gordonia sp. strain SoCg in degradation of solid n-alkanes / L. Lo Piccolo, C. De Pasquale, R. Fodale [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2011. V. 77 (4). P. 1204-1213.
8. Cytochrome P450 alkane hydroxylases of the CYP153 family are common in alkane-degrading eubacteria lacking integral membrane alkane hydroxylases / J.B. van Beilen, E.G. Funhoff, A. van Loon [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72 (1). P. 59-65.
9. Genome sequence of the ubiquitous hydrocarbon degrading marine bacterium Alcanivorax borkumensis / S. Schneiker, V.A.P.M. dos Santos, D. Bartels [et al.] // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24 (8). P. 997-1004.
10. Multiple alkane hydroxylase systems in a marine alkane degrader, Alcanivorax dieselolei B-5 / C. Liu, W. Wang, Y. Wu [et al.] // Environ. Microbiol. 2011. V. 13 (5). P. 1168-1178.
11. The complete genomic sequence of Nocardia farcinica IFM / J. Ishikawa, A. Yamashita, Y. Mikami [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2004. V. 101. P. 14925-14930.
12. Dietzia, a new genus including Dietzia maris comb. nov., formerly Rhodococcus maris / F.A. Rainey, S. Klatte, R. M. Kroppenstedt [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 32-36.
13. Characterization of a novel long-chain n-alkane-degrading strain, Dietzia sp. E1 / Z. Bihari, Z. Szabo, A. Szvetnik [et al.] // Naturforsch C. 2010. V. 65. P. 693-700.
14. Characterization and genomic analysis of highly efficient thermotolerant oil-degrading bacterium Gordonia sp. 1D / Ya. A. Delegan, L. N.Valentovich, S. M. Shafieva [et al.] // Folia Microbiologica. 2019. V. 64. P. 41-48.
15. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous culture of microorganisms 2. Construction of a chemostat: Methods in microbiology. V. 2. London: Acad. Press, 1970. P. 277-327.
16. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli / G. Bertani, Y. Nie, J.L. Liang [et al.] // J. Bacteriol. 1951. V. 62. P. 293-300.
17. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. 330 с.
18. Страдомская А.Г., Боева Л.Г., Рязанцева И.А. Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом. РД 52.24.476-2007. Ростов-на-Дону: «Гидрохимический институт», 2007. 33 с.
19. Y. Q.Characterization of a CYP153 alkane hydroxylase gene in a Gram-positive Dietzia sp. DQ12-45-1b and its "team role" with alkWl in alkane degradation / Y. Nie, J. L. Liang, H. Fang [et al.] //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 98 (1). P.163-173.
Делеган Янина Адальбертовна - канд. биол. наук, науч. сотр., mewgia@yandex. ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Ветрова Анна Андрияновна - канд. биол. наук, науч. сотр., phdvetrova@,gmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Кочаровская Юлия Николаевна — студент, kocharovskayaj@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Сафронова Марина Юрьевна — студент, marina-s-logiiin@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Иванова Анастасия Алексеевна - канд. биол. наук, науч. сотр., mrs. ivanova.a.a@gmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,
Петриков Кирилл Владимирович - канд. хим. наук, науч. сотр., bioscience.kp@,gmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»
THE ROLE OF ALKANE HYDROXYLASE ALKB IN ALKANE DEGRADATION
BY STRAIN GORDONIA SP. 1D
Ya.A. Delegan, A.A. Vetrova, Yu.N. Kocharovskaya, M.Yu. Safronova,
A.A. Ivanova, K. V. Petrikov
Mutant strain Gordonia sp. 1D alkB- obtained by alkane hydroxylase alkB gene knockout was investigated. The strain Gordonia sp. 1D is capable of growth at the temperature of 24 and 45°C in the Evans medium with aliphatic alkane (octane, nonane, decane, hex-adecane, dodecane or eicosan) as the sole source of carbon and energy. The mutant strain Gordonia sp. 1D alkB- when cultivated in similar conditions, did not grow on octane, nonane, decane and dodecane, but utilized hexadecane and eicosan. The degree of crude oil degrada-
tion by the mutant strain at two temperatures was approximately 20%. The parent strain utilized crude oil more efficiently at temperature of 24°C than at 45°C (38% and 24%, respectively).
Key words: Gordonia sp., alkB, alkanes, crude oil, degradation, gene knockout, homologous recombination
Delegan Yanina Adalbertovna - candidate of biological sciences, scientific researcher, mewgiaayandex.ru, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Vetrova Anna Andriyanovna - candidate of biological sciences, scientific researcher, phdvetrovaagmail. com, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Kocharovskaya Yulia Nikolaevna - student, kocharovskayaj@mail. ru, Russia, Tula, Tula state university,
Safronova Marina Yurievna - student, marina-s-logiiin@yandex.ru, Russia, Tula, Tula state university,
Ivanova Anastasia Alekseevna - candidate of biological sciences, scientific researcher, mrs. ivanova. a. aagmail. com, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences ",
Petrikov Kirill Vladimirovich - candidate of chemical sciences, scientific researcher, bioscience. kpagmail. com, Russia, Pushchino, Federal research center "Pushchino Research Center of biological researches of the Russian Academy of Sciences "
