CC BY
209
Е.Л. ЧЕРНОЛОВСКАЯ
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
КЛИН клином...
ЧЕРНОЛОВСКАЯ Елена Леонидовна — кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор 40 научных публикаций
«Много» — это не всегда «хорошо». Например, когда речь идет о вирусных белках. В этом случае остановить процесс белкового синтеза — жизненная необходимость для зараженной клетки. И она как опытный гомеопат начинает излечивать «подобное подобным»...
В 2006 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине были удостоены американские исследователи Эндрю Файр и Крэйг Мэллоу за открытие явления РНК-интерференции. Признание пришло к ним необычайно быстро — всего через восемь лет после опубликования в журнале «Nature» результатов их исследований, показывающих, что матричную
С явлением интерференции (от лат. inter — между и ferens (ferentis) — несущий) большинство из нас знакомо из курса физики: вспомним яркие пятна нефтяных разводов, причудливо расходящиеся по воде круги от брошенного камня... Однако этот термин, обозначающий взаимодействие, «наложение» по определенным законам одинаковых по своей природе объектов, встречается и в психологии, и в фонетике, и в биологии
РНК можно разрушить с помощью другой молекулы РНК, двуцепочеч-ной. Инъекция такой дцРНК, комплементарной мРНК мышечного белка unc-22, блокировала синтез этого белка посредством разрушения самой матричной РНК.
Механизм разрушения мРНК при помощи дцРНК строго избирателен. Попадая в клетку, длинные дцРНК связываются с клеточным ферментом Дайсер (Dicer — от английского dice — нарезать) — ключевым белком в механизме РНК-интерференции — и разрезаются на короткие фрагменты, так называемые короткие интерферирующие РНК (siRNAs). Последние связываются с клеточным комплексом RISC, способным разрушать молекулы РНК, и направляют его только к тем мРНК, которые «узнают» по принципу гомологии нуклеотидных последовательностей. Таким образом обеспечивается специфичность РНК-интерференции.
Возникает вопрос, откуда же берутся длинные двуцепочечные РНК, запускающие механизм РНК-интерференции — ведь в норме в клетках млекопитающих они не синтезируются. Одним из путей
попадания таких РНК в клетку может быть вирусная инфекция. Геном многих известных вирусов состоит именно из такой двуце-почечной РНК (а не ДНК, как у большинства живых организмов). Кроме того, подобные молекулы могут синтезироваться в клетке в качестве промежуточного продукта в процессе размножения некоторых вирусов. Поэтому появление двуце-почечной РНК является для клетки сигналом: «Опасность!» В ответ на него защитные системы клетки включают механизм уничтожения чужеродной генетической информации. Вирусная РНК разрушается, и процесс синтеза вирусных белков в клетке блокируется.
Следует отметить, что разрушением вирусной РНК защитные действия клетки не ограничивают-
Двуцепочечные РНК участвуют в функционировании двух важнейших клеточных систем — противовирусной защиты и регуляции экспрессии генов
белок Дайсер длинная дцРНК
Двуцепочечная РНК (дцРНК) нарезается ферментом Дайсер на короткие фрагменты — малые интерферирующие РНК ^¡РНК)
клеточные белки
комплекс siPHK-Dicer
siPHK образуют с клеточными белками комплекс RISC
комплекс RISC
РНК-мишень
siPHK присоединяется к гомологичному участку мишени — мРНК
Фермент рибонуклеаза из комплекса RISC расщепляет РНК-мишень
Схема механизма РНК-интерференции. При попадании двуцепочечной РНК в клетку происходит ее фрагментирование белком Dicer на короткие дуплексы длиной 19—21 пара нуклеотидов. Эти фрагменты образуют с клеточными белками комплекс RISC, в составе которого цепи siPHK расплетаются, и остается только одна, антисмысловая. С ее помощью RISC способен находить последовательность-мишень в составе матричной РНК, комплементарно связываться с ней и разрезать ее. Разрезанная молекула мРНК быстро разрушается и белок, последовательность которого кодируется данной мРНК, не синтезируется
Комплекс RISC остается активным и может разрезать следующую молекулу мРНК
56
ся. Двуцепочечные РНК способны также стимулировать синтез интерферонов и цитокинов, оказывающих противовирусный эффект как на инфицированную, так и на соседние с ней клетки, подготавливая их к встрече с вирусом и активируя механизмы их клеточного иммунитета.
В последние годы было показано, что в клетке могут синтезироваться и своп собственные дцРНК, отличные по структуре от вирусных. Действуя по механизму РНК-интерференции, эти так называемые микроРНК могут вызывать остановку трансляции клеточных мРНК, блокируя синтез кодируемых ими белков. Таким образом, клетка может «выключать» гены, работа которых не нужна в данный момент. Следовательно, клетка, используя микроРНК, закодированные в ее собственном геноме, может регулировать экспрессию генов, реализуя свою генетическую программу развития.
Осознав, что с помощью малых интерферирующих РНК клетка справляется с целым рядом встающих перед ней проблем — от защиты от чужеродной генетической информации до регулировки программы развития
клетки — исследователи поставили перед собой вопрос: нельзя ли использовать короткие синтетические молекулы РНК, гомологичные матричным РНК клетки, для разрушения последних. Такая возможность давала бы в руки ученым бесценный инструмент, способный регулировать экспрессию любого интересующего их гена. Кроме того, эти короткие олигорибонуклеотиды уже не распознаются клеткой как инфекционно опасные компоненты вирусного генома. Они не активируют клеточные механизмы противовирусной защиты и направлены исключительно на разрушение мРНК, гомологичной последовательности интерферирующей РНК.
Эксперименты показали, что это возможно, и сегодня такие синтетические молекулы, действующие по принципу РНК-интерференции, уже используются для
На основе малых интерферирующих РНК создаются лекарственные препараты — ингибиторы терапевтически значимых, в том числе «опухолевых», генов
Белок Р-гликопротеин
клеточная мембрана
Белок Р-гликопротеин встраивается в клеточную мембрану и как насос «выкачивает» из клетки различные химические вещества, в том числе и многие лекарственные препараты. Чем больше этого белка содержится в клеточной мембране, тем ниже в клетке концентрация лекарства и, соответственно, терапевтический эффект
лекарственный препарат
Синдром множественной лекарственной
устойчивости — одна из важных проблем при проведении химиотерапии онкозаболеваний
При обработке лекарственно-устойчивых раковых клеток препаратами на основе малых интерферирующих РНК их чувствительность к химиотерапии восстанавливалась. Причина — подавление механизма вывода лекарственных веществ из клетки благодаря блокировке синтеза транспортного белка Р-гликопротеина, который кодируется геном МОЯ1
57
Краситель накапливается в клетках лекарственно-чувствительной опухоли
Из клеток лекарственно-устойчивой опухоли краситель выводится
После обработки з1РНК клетки лекарственно-устойчивой опухоли накапливают краситель
Для определения активности молекулярного насоса Р-гликопротеина в клетках используют флуоресцентный краситель родамин 123, поведение которого моделирует поведение лекарственных препаратов. Флуоресцентная микроскопия. Ядра клеток окрашены синим, родамин 123 светится красным
регуляции экспрессии многих генов. Они действуют очень избирательно, разрушая только «нужные» молекулы мРНК, и проявляют активность в чрезвычайно низких концентрациях. Появление такого мощнейшего инструмента открыло для исследователей новые горизонты в области разработки целого спектра препаратов, подавляющих активность практически любых генов, в том числе вирусных и «опухолевых».
В одной лишь онкологии потенциальными мишенями для интерферирующих РНК могут являться мРНК, кодирующие различные классы белковых молекул, участвующих в процессе злокачественной трансформации. Вот только перечень классов подобных мишеней для терапевтического применения микроРНК: регуляторы клеточного цикла, ангиогенеза (роста сосудов, необходимых для питания опухоли), метастазирования и старения, белки, участвующие в блокировании апоптоза (программируемой гибели клеток), белки-иммуносупрессоры, мешающие организму самому бороться с раковыми клетками, а также белки, ответственные за устойчивость раковых клеток к химио- и радиотерапии.
Универсальная технология
При лечении ряда раковых заболеваний серьезной проблемой является устойчивость клеток опухоли к лекарственным препаратам. Такие раковые клетки способны выживать и размножаться в присутствии высоких концентраций цитостатических препаратов, когда обыкновенные, чувствительные к лекарствам опухолевые клетки неизбежно погибают.
Такой синдром множественной лекарственной устойчивости связан с гиперэкспрессией клеточного гена МБИ!, кодирующего Р-гликопротеин. Этот транспорт-
ный белок работает как мембранный насос, «откачивающий» лекарственные препараты из цитоплазмы и таким образом снижающий их концентрацию в клетке.
Действие этого молекулярного насоса можно блокировать с помощью специальных химических веществ-ингибиторов. Но вряд ли это можно считать оптимальным решением проблемы: такие вещества сами по себе довольно токсичны и усугубляют тяжесть побочных эффектов химиотерапии. Выход из ситуации
— создание таких лекарственных средств, которые устраняли бы первопричину синдрома устойчивости, то есть подавляли бы экспрессию гена МБЮ.
Такие препараты на основе малых интерферирующих РНК были разработаны в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Они представляют собой комплексы синтетических олигорибонуклеотидов, гомологичных различным участкам матричной РНК гена МБЮ.
Для получения наиболее действенных малых интерферирующих РНК ими обрабатывали раковые клетки, обладающие устойчивостью к цитостатику винбласти-ну, и отбирали те молекулы, низкие концентрации которых восстанавливали чувствительность опухолевых клеток к препарату, что приводило к гибели последних. Обработка самой эффективной из полученных з1РНК снижала количество Р-гликопротеина в раковых клетках в 20 раз уже через трое суток!
С использованием этого же подхода в ИХБФМ были получены ингибиторы и других «опухолевых» генов
— протоонкогенов семейства МУС, играющих важную роль в регуляции клеточного цикла. Известно, что гиперэкспрессия генов с- и М-тус является одной из причин возникновения таких злокачественных опухолей, как нейробластомы. Клетки последних представляют собой не полностью дифференцированные нейральные клетки, продолжающие неконтролируемо делиться из-за нарушения генной экспрессии. Эти опухоли, нередко обнаруживающиеся у детей, далеко не всегда поддаются лечению.
В ходе экспериментов с серией 21-звенных интерферирующих РНК, направленных на подавление экспрессии протоонкогена с-тус, была получена высокоэффективная молекула, введение которой в клетки вызывает двадцатикратное снижение количества мРНК опухолевого гена по сравнению с контролем. В результате уже через двое суток число раковых клеток относительно уменьшилось в четыре раза.
Более того, в институте была получена з1РНК, способная подавлять экспрессию сразу двух онкогенов,
Блокирование размножения раковых клеток человека под действием малой интерферирующей РНК, направленной против матричной РНК гена с-тус
с-тус и М-тус. Этот препарат оказался эффективен против разных типов нейробластом, в том числе и устойчивых к лечению обычными противоопухолевыми средствами.
Полученные интерферирующие РНК могут рассматриваться как прототипы лекарственных препаратов, способных многократно повышать эффективность химиотерапии раковых заболеваний. Впрочем, до использования в медицинской практике этим препаратам еще предстоят долгий путь испытаний на лабораторных животных, а затем доклиническая и клиническая апробация.
«Химия» во благо
Для того чтобы интерферирующие РНК стали настоящими лекарствами, необходимо решить две проблемы: «защиты» и доставки РНК.
Первая связана с нестабильностью молекул РНК в крови и других биологических жидкостях. Это свойство обусловлено самой ролью РНК как переносчика генетической информации, количество которого должно подлежать быстрой регуляции. Ферменты РНКазы, содержащиеся как внутри клеток, так и во внеклеточной среде, эффективно расщепляют молекулы РНК, выполняя роль такого регулятора. Для защиты РНК от их действия природные нуклеотиды в ее составе заменяют на их химически модифицированные аналоги, придающие РНК устойчивость к действию ферментов. Однако такая замена может стать палкой о двух концах: сама биологическая активность интерферирующей РНК может снизиться либо быть полностью потеряна.
Поиски новых аналогов нуклеотидов, лишенных этих недостатков, ведутся во всем мире. Алгоритм получения нуклеазоустойчивых интерферирующих РНК, разработанный в ИХБФМ, основан на картировании чувствительных к рибонуклеазам участков молекулы з!РНК и их направленной защите с помощью химически модифицированных аналогов нуклеотидов. В результате «адресно-защшценная» РНК сохраняет свою активность в присутствии 5 % сыворотки в течение восьми часов, в то время как немодифицированная з!РНК полностью деградирует менее, чем за 5 минут. Благодаря приобретенной устойчивости значительно сокращается кратность введения новой дозы, необходимой для поддержания биологического эффекта.
Вторая проблема — создание средств доставки препарата в клетки и ткани. Для того чтобы комплексы, содержащие з!РНК, попадали точно «по адресу», в их состав вводят специальные молекулы, которые и «узнают» клетки определенного типа. В качестве таких молекул могут выступать антитела, специфичность связывания которых чрезвычайно высока.
Справа — структурная формула природного мономера (нуклеотида), из которых состоит РНК, слева — формула его химически-модифицированного аналога
24 ч И 48 ч И 72 ч 96 ч 120 ч
1144 ч
Немодифицированная эРНК Нуклеаоустойчивая эРНК
Раковые клетки обработаны Раковые клетки обработаны хи-немодифицированной з1РНК мически модифицированным
аналогом з1РНК
Введение в состав интерферирующих РНК химически-модифицированных оснований увеличивает длительность действия препаратов при сохранении их биологической активности
Поиск новых «молекул-транспортеров» и «молекул-упаковщиков» для доставки интерферирующих РНК сейчас активно ведется в лабораториях всего мира, включая Россию. Уже в ближайшее время можно ожидать результатов, ознаменующих «прорыв» в эру новых технологий создания лекарств
