CC BY
113
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Юлия Александровна Борисова', Галина Борисовна Смирнова2, Натан Танфелевич Райхлин3, Елена Михайловна Трещалина4,
Зоя Сергеевна Шпрах5
РЕЗУЛЬТАТЫ СКРИНИНГА ФИТОАНТИЭСТРОГЕНА СЕКОИЗОЛАРИЦИРЕЗИНОЛА НА ЭСТРОГЕНЗАВИСИМОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СА755
' Младший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 2 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, ведущий научный сотрудник,
отдел патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
4 Д. м. н., профессор, заведующая, лаборатория комбинированной терапии опухолей
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24) 5 К. фарм. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория готовых лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (''5478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, лаборатория комбинированной терапии опухолей, Смирнова Галина Борисовна; e-mail: [email protected]
Экспериментальные исследования проведены на перевиваемой аденокарциноме молочной железы мышей Са755, содержащей на поверхности клеток рецепторы эстрогенов, с субстанцией секоизола-рицирезинола. Субстанцию вводили мышам перорально ежедневно 10-кратно в разовых дозах от 50 до 500 мг/кг. Показано, что секоизоларицирезинол в диапазоне разовых доз 250—500 мг/кг (суммарно 2,5—5,0 г/кг) реализует ингибирующий рост опухоли эффект с торможением ее роста на 67—76% ф < 0,05). При разовой дозе 250 мг/кг эффект верифицирован по увеличению зоны индуцированного некроза и снижению митотической активности в опухоли.
Ключевые слова: фитоантиэстроген, секоизоларицирезинол, мыши, эстрогензависимая аденокар-цинома молочной железы, скрининг.
Антиэстрогены различного механизма действия применяются для лечения гормонозависимых опухолей человека. В этой группе широкое применение нашел препарат с непатентованным международным названием тамоксифен, который выпускается также
под следующими торговыми названиями: Зитазониум (Венгрия), Йеноксифен (Германия), Новофен (Кипр), Тамоксен (Израиль) и др. Эти препараты чаще используются многократно и длительно для адъювантной терапии эстрогензависимого рака молочной железы (РМЖ) [1].
В Российской Федерации проводятся исследования по разработке отечественного аналога тамоксифена на основе нового фитоантиэстрогена секоизоларицирезино-ла (СЕКО) [2]. Поскольку при РМЖ в клинике антиэстрогены используют длительно [3], для Са755 со сроком гибели мышей от опухоли через 3—4 нед выбран максимально длительный 10-кратный курс лечения СЕКО с тем, чтобы оценить его эффективность, как требуется, в течение не менее чем 12 дней. Такой курс на доступной эстрогензависимой аденокарциноме молочной железы позволяет не только провести адекватное лечение, но и троекратно оценить ингибирующий эффект после его окончания, соответственно действующим требованиям [4].
СЕКО получен из сучковых зон лиственницы и пихты и относится к природным полифенолам класса лиг-нанов [5]. Они широко известны в качестве природных антиоксидантов и проявляют эстрогенную или анти-эстрогенную активность в зависимости от примененной дозы [6; 7]. Разнообразие лигнанов достигается благодаря содержащимся в них функциональным заместителям при ароматических и алифатических атомах углерода. СЕКО представляет собой дифенольное соединение растительного происхождения, которое состоит из двух пропилбензольных (С3—С6) структурных фрагментов, соединенных между собой атомами С8 и С8'; в качестве функциональных заместителей выступают группы ОНи ОСН3- [8] (рис. 1).
Цель исследования — получение первичных данных об ингибировании роста эстрогензависимой опухоли под действием СЕКО.
Задачи исследования: определение ингибирующего действия СЕКО при ежедневном 10-кратном введении в желудок мышей; патоморфологический контроль инги-бирующего действия СЕКО на опухоль.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные животные
В опытах использованы мыши из филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА, которых содержали в конвенциональных условиях в отделе лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН на брикетированных кормах. В экспериментах использовано 120 самок мышей-гибридов BDF1 и 10 мышей-самок линии C57BL6j массой тела 20—21 г (доноры опухолевого материала). После трансплантации опухоли мышей ранжировали по группам (п = 10). Основные группы получали лечение субстанцией СЕКО. Группы мышей без специфического воздействия, получавшие растворитель для СЕКО по аналогичной схеме, считали контрольными.
Опухолевая модель
Использован штамм эстрогензависимой (около 20 фмоль рецепторов эстрогенов (РЭ) на клетку) адено-карциномы молочной железы мышей Са755 РЭ + , содержащей на поверхности клеток РЭ, из банка опухолевых
© Борисова Ю. А., Смирнова Г. Б., Райхлин Н. Т., Трещалина Е. М., Шпрах З. С., 2014 УДК 618.19-006.66-092.9:615.322.015
штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН [9; 10]. Взвесь опухолевой ткани готовили и трансплантировали самкам мышей-гибридов BDF1 под кожу бока в соответствии с рекомендованной методикой [4]. В опытах использованы опухоли различных пассажей in vivo.
Секоизоларицирезинол
Для исследований использовали водонерастворимую субстанцию СЕКО в виде кристаллического порошка белого цвета с кремовым оттенком, приготовленную ЗАО «Биохиммак СТ» (Москва).
Условия введения СЕКО мышам
СЕКО изучен в диапазоне разовых доз от 50 до 500 мг/ кг при ежедневном 10-кратном пероральном введении с помощью металлического зонда. В качестве растворителя использован 1% крахмальный клейстер в объеме 0,2— 0,4 мл на мышь в разных концентрациях. Лечение проводили на 3—12-е сутки после перевивки опухоли.
Оценка эффективности
После окончания введения СЕКО у всех мышей трижды определяли размеры опухоли с помощью электронного измерителя и рассчитывали объем по формуле: V = a х b х c, где a — длина; b — ширина; с — высота опухолевого узла. После этого определяли средний объем опухоли ^ср) в каждой группе и вычисляли стандартный показатель эффективности — торможение роста опухоли (ТРО, %). ТРО = (Vo - Vk) / (Vk) х 100, где Vo и Vk — величина Vср в опыте и в контроле соответственно. В качестве минимального критерия эффективности использовали скрининговое значение ТРО > 50% длительностью не менее 1 нед [4].
Оценка переносимости воздействия
Оценку переносимости воздействия проводили по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, а также следили за возможной гибелью от токсичности. Павших или умерщвленных мышей подвергали аутопсии для выявления макроскопических патологических изменений внутренних органов.
Патоморфологическое исследование опухоли
На 12-е сутки после лечения из основной и контрольной групп умерщвляли по 3 мыши, опухоли удаляли и готовили материал для патоморфологического исследования. Удаленные опухоли фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин, из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5—7 мкм и окрашивали гематоксилин и эозином. Препараты просматривали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия). В срезах опухоли при увеличении х200 определяли площадь некроза, число клеток с признаками апоптоза и число клеток в митозе.
Статистическая обработка данных
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин по стандартному методу Стьюдента в модификации Р. Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при p < 0,05.
■ он
но •
...........
он
С6
Пропилбензол
5
ОСН
он
(-)-Секоизоларицирезинол Рисунок 1. Структура СЕКО и характеристических структурных элементов лигнанов.
Углеродный скелет лигнанов
Завершение экспериментов
Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза и кремировали в специализированном подразделении ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН в соответствии с международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (ЕЭС, Страсбург, 1985 г.), а также в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации [11; 12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При изучении ингибирующего действия на рост опухоли СЕКО вводили перорально мышам в разовых дозах 50, 250 или 500 мг/кг ежедневно 10-кратно на 3—12-е сутки после трансплантации. Полученные данные представлены на рис. 2. СЕКО в разовой дозе 50 мг/кг в последний срок наблюдения оказал слабый кратковременный, но достоверный ингибирующий эффект ниже минимально значимого уровня (ТРО составило 49%; p < 0,05). При разовых дозах 250 и 500 мг/кг (суммарно 2,5 и 5,0 г/кг соответственно) эффект регистрировался в течение 11 дней после окончания лечения на практически одинаковом уровне (ТРО составило 67 и 76% соответственно; p < 0,05).
В повторном опыте воспроизведен ингибирующий эффект СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг и впервые определен эффект разовой дозы 375 мг/кг при ежедневном 10-кратном пероральном введении (рис. 3).
При обеих разовых дозах СЕКО продемонстрировал значимый и достоверный эффект в течение 12 дней после лечения на уровне ТРО = 76—83% ф < 0,05) без достоверных различий между дозами.
Таким образом, на Са755 РЭ+ выявлено значимое и достоверное ингибирующее действие СЕКО на рост опухоли при 10-кратном пероральном введении в диапазоне разовых доз от 250 до 500 мг/кг (суммарно 2,5—5,0 г/кг).
Контроль состояния и поведения мышей в процессе и после введения СЕКО показал отсутствие отклонений. При аутопсии умерщвленных в конце опыта мышей патологических изменений внутренних органов не выявлено.
Патоморфологическая верификация достигнутого результата выполнена с использованием опухолей от мышей, получивших СЕКО в минимальной достаточной разовой дозе 250 мг/кг.
Патоморфологическое исследование
В результате анализа гистологических срезов показано, что Са755 РЭ+ без лечения состоит из крупных клеток со светлой цитоплазмой, содержащей округло-овальной формы ядра с диффузным хроматином. Характерен сплошной рост клеток с образованием солидных ячеек, разделенных местами слабо развитой стромой. В отдельных участках опухоли видны 5—6 митозов в поле зрения, а иногда — единичные клетки с признаками апоптоза. Некрозы определяются лишь на периферии опухоли, они небольших размеров и составляют 2—5% площади среза.
В группе мышей, получивших эффективное лечение СЕКО, опухоль имеет обычное гистологическое строе-
12 000
10 000
8000
6000
4000
2000
2 ..
3 : .........
Г 4
4 8 12 I 16 20 22
Время после трансплантации опухоли, сут
Рисунок 2. Динамика роста Са755 РЭ+ под действием СЕКО, примененного перорально в разовых дозах 50, 250 или 500 мг/кг в режиме ежедневного 10-кратного введения. 1 — контроль; 2 — СЕКО, 50 мг/кг; 3 — СЕКО, 250 мг/кг; 4 — СЕКО, 500 мг/кг.
2
7
9
СН3О
3
12 000
10 000
8000
6000
4000
2000
4 8 12 16 20
Время после трансплантации опухоли, сут
23
Рисунок 3. Динамика роста Са755 РЭ+ под действием СЕКО при 10-дневном пероральном введении в разовых дозах 250 и 375 мг/кг. 1 — контроль; 2 — СЕКО, 250 мг/кг; 3 — СЕКО, 375 мг/кг.
ние, клетки образуют солидные структуры в виде ячеек, окруженных тонкими соединительнотканными волокнами и частично полнокровными сосудами. При увеличении х200 видно уменьшение числа клеток с митозами до 2—3 в поле зрения на фоне небольшого числа клеток с признаками апоптоза и увеличение участков некроза до 5—8% площади среза. Вокруг очагов некроза в отдельных участках отмечается полнокровие сосудов.
Таким образом, под действием 10-дневного курса введения СЕКО в разовой дозе 250 мг/кг увеличивается площадь некроза и снижается митотическая активность в срезах Са755 РЭ + .
заключение
В результате изучения субстанции нового фитоан-тиэстрогена СЕКО по программе скрининга на Са755 РЭ+ выявлено верифицированное достоверное инги-бирующее действие на уровне 67—76% при 10-кратном ежедневном пероральном введении мышам в диапазоне разовых доз 250—500 мг/кг (суммарно 2,5—5,0 г/кг). Оценка переносимости СЕКО при изученной терапевтической схеме и дозах показала отсутствие отрицательной динамики в состоянии и поведении мышей, а также от-
сутствие патологических изменении их желудочно-кишечного канала.
Авторы выражают, благодарность ООО «Медресурс» (РФ, Москва) за финансовую поддержку исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Руководство по химиотерапии опухолевых заболевании / Под ред. Н. И. Переводчиковой. — 2011. — С. 257—260.
2. Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидроквер-цетина из древесины / Нифантьев Н. Э., Яшунский Д. В., Меньшов В. М., Цветков Ю. Е., Цветков Д. Е. — Патент на изобретение РФ. — 2009. — № 2359666.
3. Xanthopoulos J. M., Romano A. E., Majumdar S. K. Response of mouse breast cancer call to anastrozole, tamoxifen, and the combinato-ion // J. Biomed. Biotechnol. — 2005. — Vol. 1. — Р. 10—19.
4. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Тре-щалина Е. М., Жукова О. С., Герасимова Г. К., Андронова Н. В., Гарин А. М. — М.: Изд. Гриф и К., 2012. — С. 642—657.
5. Milder I. E., Arts I. C., van de Putte B. Lignan contents of Dutch plant foods: a database including lariciresinol, pinoresinol, secoisolarici-resinol and matairesinol // Br. J. Nutr. — 2005. — Vol. 93, N 3. — P. 393— 402.
6. Enterolactone Inhibits the Growth of 7,12-Dimethylbenz(a) anthracene-induced Mammary Carcinomas in the Rat / Saarinen N. M., Huovinen R., Warri A., Makela S. I., Valentin-Blasini L., Sjoholm R., Am-mala J., Lehtila R., Eckerman C., Collan Y. U., Santti R. S. // Mol. Cancer Ther. — 2002. — Vol. 1. — P. 869—876.
7. Studies on the Metabolism of the Plant Lignans Secoisolarici-resinol and Matairesinol / Niemeyer H. B., Honig D. M., Kulling S. E., Metzler M. J. // Agric. Food Chem. — 2003. — Vol. 51. — P. 6317—6325.
8. Moss G. P. Nomenclature of lignans and neolignans (IUPAC Recommendations 2000) // Pure Appl. Chem. — 2000. — Vol. 72. — P. 1493—1523.
9. Кубасова И. Ю. Рациональные подходы к сочетанию химиотерапии со стероидными гормонами и оксикобаламином при лечении злокачественных опухолей: Автореф. дис... канд. мед. наук. — М., 1994. — 24 с.
10. Эффективность неоадъювантной химиотерапии по схеме АС в сочетании с бинарной каталитической системой тераф-тал + аскорбиновая кислота на модели рака молочной железы / Калишьян М. С., Седакова Л. А., Райхлин Н. Т., Трещалина Е. М., Лу-кашева Е. В. // Рос. биотер. журн. — 2009. — Т. 8. — № 3. — С. 51—57.
11. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985 г. // Ланималогия. — 1993. — № 1. — C. 29.
12. Большаков О. П., Незнанов Н. Г., Бабаханян Р. В. Доклинические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных // Качественная клин. практ. — 2002. — № 1. — С. 58—61.
Поступила 15.01.2014
0
Yulia Alexandrovna Borisova1, Galina Borisovna Smirnova2, Natan Tanfelevich Raikhlin3, Helena Mikhailovna Treschalina4, Zoya Sergeyevna Shprakh5
RESULTS OF PHYTOANTIESTROGEN SEKOISOLARICIRESINOL SCREENING IN ESTROGEN-DEPENDENT MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA
' Junior Researcher, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin RCRC (24, Kashirskoye sh., Moscow, ''5478, RF) 2 PhD, Senior Researcher, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin RCRC (24, Kashirskoye sh., Moscow, ''5478, RF) 3 MD, PhD, DSc, Professor, RF Honored Scientists, Leading Researcher, Human Tumor Pathology Anatomy Department, Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC (24, Kashirskoye sh., Moscow, ''5478, RF) 4 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin RCRC (24, Kashirskoye sh., Moscow, ''5478, RF) 5 PhD, Leading Researcher, Ready Drug Formulation Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin RCRC (24, Kashirskoye sh., Moscow, ''5478, RF)
Address for correspondence: Smirnova Galina Borisovna, Tumor Combination Therapy Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Treatment Research Institute, N. N. Blokhin RCRC, 24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, RF; email: [email protected]
Sekoisolariciresinol experimental study was performed on transplanted estrogen-dependent murine mammary adenocarcinoma Ca755 ER + . Sekoisolariciresinol was administrated per os at 50—500 mg/kg daily for 10 days. Sekoisolariciresinol induced a 67 to 76% (p<0.05) tumor growth inhibition at 250—500 mg/kg (total dose 2.5—5.0 g/kg). Pathology verification of this effect after therapy at 250 mg/kg (total 2.5 g/kg) found induced tumor necrosis and reduction in mitotic activity.
Key words: phytoantiestrogen, sekoisolariciresinol, mouses, estrogen-dependent murine mammary adenocarcinoma, screening.
