CC BY
18
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Результаты оценки вирулицидной активности препарата Монклавит-1 in vitro в отношении вируса гриппа A, подтип H5N1
С. Я. ЛОГИНОВА1, С. В. БОРИСЕВИЧ1, Г. В. БОРИСЕВИЧ, В. П. БОНДАРЕВ1, А. В. ВАРЮХИН2
' Филиал 48 Центрального НИИ Минобороны России — «Вирусологический Центр», Сергиев Посад 2 ООО «Оргполимерсинтез СПб», Санкт-Петербург
Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины, Санкт-Петербург
Estimation of in vitro Monclavit-1 Virucide Activity against Influenza Virus A (H5N1)
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, G. V. BORISEVICH, V. P. BONDAREV, A. V. VARYUKHIN
Virological Centre, Branch of the Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Orgpolimersintez, St. Petersburg
St. Petersburg State Academy of Veterinary, St. Petersburg
Изучена вирулицидная эффективность препарата Монклавит-1 в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (H5N1), в культуре клеток MDCK. Установлено, что при температуре (14,0±1,0)°С препарат Монклавит-1 в разведении в 20 раз в течение одного часа полностью инактивирует цитопатическую активность вируса гриппа А и на 87,5 % — формирование специфического гемагглютинина, при разведении в 40 раз — в среднем на 50% как цитопатическое действие вируса, так и формирование специфического гемагглютинина, при разведении в 80 раз — в среднем на 20% цитопатическое действие, при разведении в 160 раз не инактивирует возбудитель. При температуре (25,0±1,0)°С препарат Монклавит-1 только в самой высокой из изученных концентрации инактивировал вирус гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (H5N1), на 90,0%.
Ключевые слова: вирус гриппа А, Монклавит-1, вирулицидная активность.
The virucide activity of Monclavit-1 against the influenza virus A/Chicken/Kurgan/2/Russia/05 (H5N1) was investigated in the MDCK cell culture. It was shown that at a temperature of 14.0±1.0°C Monclavit-1 in a 20-fold dilution within an hour inactivated the cytopathic activity of the virus and the specific hemagglutinin generation by 100 and 87.5% respectively. In a 40-fold dilution it inactivated at the average by 50% both the cytopathic activity and the specific hemagglutinin generation. In an 80-fold dilution it inactivated the cytopathic activity at the average by 20%. In a 160-fold dilution it did not inactivate the pathogen. At a temperature of 25.0±1.0°C Monclavit-1 inactivated the influenza virus A/Chicken/Kurgan/2/Russia/05 (H5N1) by 90.0% only in the highest concentration.
Key words: influenza virus A, Monclavit-1, virucide activity.
Известно, что эпизоотии гриппа А подтипов Н5Ш, Н7Ш, Н7Ш, Н9Ш неоднократно регистрировались среди дикой и сельскохозяйственной птицы во всём мире, начиная с 1959 года, периодически вызывая эпизоотии среди домашней птицы с летальностью до 100% [1, 2]. Однако до 1997 года случаев заболевания людей одноимёнными подтипами вируса гриппа А зарегистрировано не было. Возникшие эпизоотии среди домашней птицы в последнее десятилетие стали сопровождаться случаями заболевания среди людей, нередко с летальными исходами. При этом из этих 4 эпидемически и эпизоотически значимых подтипов вируса гриппа А наибольшее число вспышек заболевания среди людей и домашних птиц вызывает с декабря 2003 года подтип Н5Ш вируса гриппа А.
© Коллектив авторов, 2010
Адрес для корреспонденции: 141306 Московская обл., Сергиев Посад-6. Филиал ФГУ 48 Центральный НИИ МО РФ «Вирусологический центр»
В настоящее время эпизоотии среди диких и домашних птиц зарегистрированы на трёх континентах в 62 странах мира (по состоянию на 12 марта 2010 г.) [3]. Это заболевание в редких случаях передаётся от птицы человеку. Все известные случаи заражения людей (486) имели алиментарный характер [4]. В период с 2003 г. по 17 марта 2010 г. спорадические вспышки гриппа А (Н5Ш) среди людей зарегистрированы в 15 странах Азии, Европы и Африки (табл. 1).
За исследуемый период выявлено 488 больных, из которых 289 человек погибли. Летальность составила 36,5%. Наиболее неблагополучная эпидемическая ситуация наблюдается в Индонезии, Вьетнаме и Египте. Всего в этих странах зарегистрировано 163, 115 и 106 случаев заболевания, из которых 135, 58 и 32 соответственно погибли. Летальность в этих трёх странах составила соответственно 82,8; 50,4 и 28,8%.
В пользу возможного появления случаев гриппа А (Н5Ш) среди людей свидетельствуют данные
-е-
Є
Таблица 1. Регистрация случаев заболевания (гибели) гриппом А (Н5М) в мире с 2003 г. по 17 марта 2010 г. [4]
Страна
Количество заболевших/погибших в странах, человек
Всего
2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Азербайджан — — — 8/5 — — — — 8/5
Бангладеш — — — — — 1/0 — — 1/0
Камбоджа — — 4/4 2/2 1/1 1/0 1/0 — 9/7
Китай 1/1 — 8/5 13/8 5/3 4/4 7/4 — 38/25
Джибути — — — 1/0 — — — — 1/0
Египет — — — 18/10 25/9 8/4 39/4 16/5 106/32
Индонезия 20/13 55/45 42/37 24/20 21/19 1/1 163/135
Ирак — — — 3/2 — — — — 3/2
Лаос — — — — 2/2 — — — 2/2
Мьянма — — — — 1/0 — — — 1/0
Нигерия — — — — 1/1 — — — 1/1
Пакистан — — — — 3/1 — — — 3/1
Таиланд — 17/12 5/2 3/3 — — — — 25/17
Турция — — — 12/4 — — — — 12/4
Вьетнам 3/3 29/20 61/19 8/5 6/5 5/5 3/1 115/58
Всего: 4/4 46/32 98/43 115/79 88/59 44/33 73/32 20/7 488/289
Таблица 2. Регистрация эпизоотий гриппа А (Н5№) в мире с января 2009 г. по 15 марта 2010 г. [3]
Месяц Результаты регистрации эпизоотий в пострадавших странах
среди домашней птицы среди дикой птицы
Индия Банг- Непал Индо- Египет Вьет- Китай Лаос Кам- Мьянма Бутан Румы- Герма- Монго- Россия
ладеш незия нам боджа ния ния лия
Январь + + + + + — —
Февраль + + + — + + +
Март — — — — + — —
Апрель — + — — — + +
Май + — — — — + +
Июнь — + — + — + —
Июль — + — — + — —
Август — — — + +
Сентябрь — + — — + — —
Октябрь — — — — + — —
Ноябрь — — — — + +
Декабрь — — — — + + —
Январь + + + — — + +
Февраль — + + — — + —
Март
2009
+ +
+ —
2010
+ —
+
+
+— + +
о регистрации эпизоотии среди домашних и диких птиц на территории 15 стран (табл. 2). При этом набольшее количество эпизоотии регистрировалось не только в Египте, Вьетнаме и Индонезии, но и в трёх странах ЮжноИ Азии (Индия, Бангладеш и Непал). Нельзя не отметить, что в 2009 году среди диких птиц регистрировался грипп А (Н5Ш) в Германии, Монголии и России (Республика Тыва (июнь) и Московская область (ноябрь)). С начала 2010 года выявлены эпизоотии в Китае, Индии, Непале, Вьетнаме, Бангладеш, Камбодже, Мьянме, Бутане.
Таким образом, несмотря на предпринимаемые интенсивные противоэпидемические и про-тивоэпизоотические мероприятия большинством стран мира заболевание, по-прежнему, регистрируется без тенденции к расширению ареала циркуляции подтипа Н5Ш вируса гриппа А.
Угроза возникновения эпизоотиИ гриппа А (И5Ш) среди сельскохозяйственной и дикоИ
птицы, а также риск заболевания среди людей способствует активизации мероприятий, направленных на совершенствование имеющихся и разработку новых средств и методов биологической защиты, в том числе дезинфекционных.
Изложенное свидетельствует об актуальности исследований, целью которых являлась оценка вирулицидной активности лекарственного средства Монклавит-1 in vitro в отношении вируса гриппа А, подтип H5N1.
Материал и методы
Вирус. В работе использовали вирус гриппа, штамм А/курица/Курган/2/ Россия/05(Н5Ш), выделенный в октябре 2005 года специалистами филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ» из биопроб, доставленных из эпизоотии (пало и было уничтожено более 460 тыс кур). Штамм был получен из биопроб павших кур Утятской птицефабрики Курганской области, охарактеризован с помощью биологических и молекулярно-биологических методов исследования, в том числе путём секвенирования специфических областей генома возбудителя [5, 6].
+
+
+
+
+
+
+
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 3. Оценка токсичности препарата Монклавит-1 для культуры клеток MDCK
Разведения исходного
Частота выявления ЦПД после внесения препарата через
препарата в ... раз 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч
10 0/10 2/10 10/10 — —
20 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
40 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
80 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
160 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
320 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Таблица 4. Оценка вирулицидной активности препарата Монклавит-1 in vitro по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/02/Россия/05 (H5N1), в культуре клеток MDCK (n=3)
Температура инкубирования Разведения исходного препарата в ... раз Частота ЦПД Коэффициент ингибирования, Ки, ^ср±®хср, %
(25,0±1,0)°С 20 3/30 90,0±0,0
40 30/30 0
80 30/30 0
160 30/30 0
контроль без препарата 30/30 —
(14,0±1,0)°С 20 0/30 100
40 15/30 50,0±5,8
80 24/30 20,0±0,0
160 30/30 0
контроль без препарата 30/30 —
Штамм хранится в Специализированной коллекции филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ».
Культура клеток. Использована постоянная культура клеток почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Исследуемый препарат. Монклавит-1 — лекарственное средство для животных, обработки инкубационных яиц, инкубационных и выводных шкафов, санации воздушной среды животноводческих помещений (производство — ООО «Орг-полимерсинтез СПб»).
Вирулицидную активность препарата in vitro оценивали по следующим показателям:
— подавление цитотоксической активности вируса, %;
— подавление формирования специфического гемаг-глютинина, %.
Титрование вируса гриппа проводили по ЦПД в культуре клеток MDCK.
Результаты и обсуждение
На начальном этапе исследований оценивали токсичность препарата Монклавит-1 для культуры клеток. В этих целях использовали двухсуточный монослой культуры клеток MDCK — на каждую дозу препарата по 10 пробирок. Разведения препарата готовили на среде поддержания двукратным шагом. Ростовую среду удаляли из пробирок с монослоем клеток, вносили приготовленные разведения препарата Монклавит-1 и инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С. В течение 5 суток контролировали состояние монослоя клеток, визуальный учёт состояния монослоя клеток проводили ежедневно с помощью светового микроскопа.
В результате исследований установлено, что препарат Монклавит-1, разведённый в 10 раз, токсичен для культуры клеток MDCK (табл. 3).
Уже через 72 ч препарат в исследуемой концентрации полностью разрушает монослой культуры клеток MDCK. В разведениях 1:20 и выше препарат не токсичен для культуры клеток MDCK и в этих концентрациях может быть рекомендован для последующей оценки его активности.
В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость РКЭ, заражённых вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/2/ Россия/05(Н5Ш).
Вирулицидную активность препарата изучали при непосредственном контакте с вирусом в пробирке с последующим определением инфекционной активности смеси по задержке ЦПД в культуре клеток MDCK.
В стерильные пробирки вносили равные объёмы исследуемой концентрации препарата Монк-лавит-1 и разведения вируса гриппа (конечная концентрация 50 ЦПД50). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при температуре (14,0±1,0)°С (требование «Руководства по экспериментальному изучению...» [7] — при этой температуре вирус гриппа инактивируется в меньшей степени, а также это оптимальная температура для взаимодействия с субстанцией) и (25,0±1,0)°С в течение 60 минут. В процессе термостатирования пробирки встряхивали не менее 4 раз. По окончании инкубации смесь вносили на монослой культуры клеток MDCK в объёме 1 мл.
Результаты изучения вирулицидного действия препарата, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что при температуре (14±1,0)°С препарат Монклавит-1 в разведении в 20 раз в течение одного часа полностью инактивирует вирус гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (H5N1),
Є
Таблица 5. Оценка вирулицидной активности препарата Монклавит-1 in vitro по подавлению гемагглютини-рующей активности вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (H5N1)
Температура инкубирования Разведения исходного препарата в . раз ГА, ед (обратная величина) Коэффициент ингибирования, Ки, %
(25,0±1,0)°С 20 4 50,0
40 8 0,0
80 8 0,0
160 8 0,0
контроль без препарата 8 —
(14,0±1,0)°С 20 2 87,5
40 8 50,0
80 16 0,0
160 16 0,0
контроль без препарата 16 —
при разведении в 40 раз — в среднем на 50%, при разведении в 80 раз — в среднем на 20%, при разведении в 160 раз не инактивирует возбудитель. При температуре (25±1,0)°С препарат Монклавит-1 только в самой высокой из изученных концентрации инактивировал вирус гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (Н5Ш), на 90,0%.
Вирулицидную активность препарата оценивали также по снижению формирования специфического гемагглютинина (табл. 5). Установлено, что при температуре (14±1,0)°С препарат Монклавит-1 при разведении в 20 раз в течение одного часа инактивирует формирование специфического гемагглютинина вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/Россия/05 (Н5Ш), на 87,5%, при разведении в 40 раз — в среднем на 50%, при разведениях в 80 и 160 раз препарат не инактивирует формирование специфического ге-магглютинина возбудителя. При температуре (25±1,0)°С препарат Монклавит-1 только в самой
высокой из изученных концентрации инактивировал образование специфического гемагглюти-нина вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/02/05 (Н5Ш) на 50,0%.
Согласно «Руководству по экспериментальному изучению...» [7] если испытуемое соединение в концентрации 10 мкг/мл и ниже полностью нейтрализует инфекционные свойства возбудителя, то его оценивают как высокоактивное отечественное соединение с точки зрения вирули-цидного действия.
Таким образом, по результатам изучения вирулицидной активности препарата Монклавит-1 в отношении вируса гриппа А, сделан вывод о целесообразности его использования, отработки способов, режимов и условий применения препарата при аэрозольном и влажном методах дезинфекции поверхностей, воздушной среды, куриного навоза и других объектов, контаминированных вирусом гриппа А (Н5Ш).
ЛИТЕРАТУРА
2. Липатов А. С., Смирнов Ю. А., Каверин Н. В., Вебстер Р. Г. Эволюция вирусов гриппа птиц Н5Ш с 1997 по 2004 гг. в Южной и ЮгоВосточной Азии. Там же 2005; 4: 11—17.
3. www.oie.int/
4. www.who.int/
5. Сыромятникова С. И., Борисевич С. В., Хамитова М. Ф. и др. Обоснование выбора штамма гриппа А, подтип Н5Ш, предназначенного для оценки защитной эффективности существующих и вновь разрабатываемых в Российской Федерации лекарственных средств и медицинских иммунобиологических препаратов. Вестник Российской Военно-медицинской академии. Приложение (Труды
второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития», 15—17 ноября 2006, Санкт-Петербург). 2006; 1: 15: 167—168.
Мельников Д. Г., Меркулова О. В., Маношкин А. В. и др. Лабораторная диагностика гриппа А (Н5Ш) во время эпизоотий 2005—2007 гг. на территории Российской Федерации. Матер. докл. международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа», 9—10 октября 2008 г., Новосибирск. Новосибирск, 2008; 34—35.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Минздрав РФ, 2005.
