CC BY
46
130
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической ...
С. В. Утемов, К. А. Ветошкин, А. А. Костяев
Результаты консервирования лейкоцитных концентратов при низких температурах
ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России»
Принципы современной клинической трансфузиологии основ аны на применении по соответствующим показаниям отдельных компонентов крови, однако лейкоцитные концентраты (ЛК) не получили до сих пор широкого распространения в лечебной практике в виду кратковременной сохранности клеток в жизнеспособном состоянии (в течение 2-3 часов при температуре 22°С и не более 24 часов в условиях температуры 4°С). Увеличение продолжительности хранения гемокомпонента возможно путем криоконсервирования - способа сохранения биологических объектов в условиях отрицательных температур.
В то же время при указанном способе консервации ядерных клеток крови (ЯКК) наблюдаются необратимые их повреждения, снижается общее количество лейкоцитов, их жизнеспособность и функциональная активность после размораживания. Важнейшим фактором, от которого зависит разнообразие проявлений криоповреждений в клетках, является фазовый переход воды в лед. Переход внеклеточной и внутриклеточной воды из жидкого состояния в твердое при криоконсервировании биообъектов происходит от температуры начала кристаллизации до полного отвердевания образца в зоне эвтектических температур - точке эвтектики. При этом клетка подвергается воздействию комплекса повреждающих факторов, среди которых существенное значение имеют вымораживание воды, образование кристаллов эндо-и экзоцеллюлярного льда, избыточная дегидратация и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур, гиперконцентрация солей (эффект раствора), изменение величины рН и зарядовых характеристик мембран, что приводит к уменьшению объема, деформации и при определенных условиях разрушению клеток.
Результаты консервирования лейкоцитных концентратов при низких... 131
При введении клеток в криоанабиоз регуляцию процессов кристаллизации и снижение негативного влияния возникающих при этом физико-химических факторов осуществляют, во-первых, путем предварительного добавления в биологические системы криопротекторов. В 1959 г. в качестве криопротектора для замораживания ЯКК был предложен и получил широкое распространение диметилсульфоксид (ДМСО). Имеющиеся в настоящее время протоколы криоконсервации ЛК зачастую разрабатывались эмпирически и могут приводить к потере до 50% общего количества клеток, что является неприемлемым.
Помимо введения в биологическую систему хладоограждающих веществ, вторым способом защиты замораживаемых клеток от разрушающих факторов является изменение режимов и управление скоростями охлаждения биообъектов. С совершенствованием криогенного оборудования и появлением программных замораживателей протоколы введения клеток в криоанабиоз также претерпели изменения.
В этой связи с целью повышения эффективности криоконсервирования ЛК нами были внесены изменения в линейную программу замораживания ядерных клеток крови под защитой 10% раствора ДМСО, касающиеся увеличения продолжительности отведения тепла в точке эвтектики сформированной системы «ЛК + криоконсервант». Мы применили 2 режима для охлаждения ЛК до температуры -80°С (таблица 1).
Таблица 1 - Программы замораживания ЛК
Характеристики Программы замораживания
1 2
Стартовая температура биоматериала, °С 22,0 6,0
Скорость охлаждения, °С/мин 1,5-2,0 1,8-3,2
Точка эвтектики, °С -4,1 -5,9
Холодовая остановка (мин) 5,0 3,0
Скорость охлаждения до -80°С, °С/мин 10,0 15,0
При использовании программы № 1 стартовая температура (СТ) ЛК составляла 22±2°С, скорость охлаждения - 1,5-2°С/мин, холодовая остановка производилась при температуре -4,1°С и длилась 5 минут. На следующем этапе скорость охлаждения была 10°С/мин до достижения температуры -80°С, после чего биоматериал переносили в низкотемпературный электрохолодиль-
132
Вопросы экспериментальной, производственной и клинической ...
ник. Программа № 2 отличалась от программы № 1 СТ биоматериала (+6°С), скоростью охлаждения (1,8-3,2°С/мин) до точки кристаллизации (-5,9°С), длительностью холодовой остановки (3 минуты), а также скоростью охлаждения на завершающем этапе (15°С/мин) до температуры хранения (-80°С).
Основная цель криоконсервирования - получение после размораживания достаточного количества жизнеспособных клеток. В этой связи мы изучили результаты морфофункциональной сохранности клеток донорских ЛК в зависимости от режима замораживания. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Сохранность ЛК, замороженных по
усовершенствованным программам________________________
Показатель Программы замораживания
1 2
Количество ЯКК (% от исходного) 87,2-91,0 94,2-97,1
Жизнеспособность, % 69,0-75,0 78,0-94,0
Оба испытанных режима охлаждения позволили сохранить клетки крови. При замораживании клеток крови по режиму № 1 общее количество лейкоцитов после размораживания оставалось на достаточно высоком уровне (87,2-91,0%). В то же время содержание жизнеспособных (эозинорезистентных) клеток составило 69-75%. Наибольшее количество жизнеспособных ЯКК после размораживания сохранялось при использовании режима замораживания № 2. Так, общее количество лейкоцитов после размораживания оставалось на уровне 94,2-97,1% от исходного, а их жизнеспособность - 78-94%, что было выше, чем аналогичный показатель при применении программы замораживания (режима № 1).
Таким образом, после анализа полученных данных можно заключить, что при криоконсервировании ЛК под защитой ДМСО предпочтительно использовать режим № 2, характеризующийся СТ +4++6°С, скоростью охлаждения до температуры кристаллизации 1,8 - 3,2°С/мин, продолжительностью фазового перехода в течение 3 мин, скоростью дальнейшего охлаждения (15°С/мин) до температуры хранения (-80°С).
