CC BY
99
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО... 67
УДК 616.716.1-089.23:611.018.4
1 1 2;3 12 1
Алексеева И. С., Кулаков А.А., ' Гольдштейн Д.В., ' .Волков А.В, Шураев А.И.
РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ КОМБИНИРОВАННОГО КЛЕТОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ !ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХМинздравсоцразвития России», Москва 2ЗАО «РеМеТэкс», Москва
3УРАМН «Медико-генетический научный центр РАМН», Москва Резюме
Результаты нашего клинико-экспериментального исследования по использованию тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани показали, что использование данной конструкции приводит к восстановлению костной ткани и стимуляции репаративного остеогенеза. А также обрисовало направления дальнейшего клинического исследования по применению ТИК ЖТ в челюстно-лицевой хирургии.
Ключевые слова: тканевая инженерия, жировая ткань, стромальные клетки, материал-носитель, обогащенная тромбоцитарная масса, костная ткань.
Alekseeva I.S.1, Kulakov A.A.2’3, D. Goldstein, I;2. Volkov A.V., 1 ShuraevA.I1 THE RESULTS OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL STUDY ABOUT THE COMBINED CELL TRANSPLANTS BASED MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS ADIPOSE RECOVERY BONE DEFECT
IFGU "ZNIIS and Maxillofacial Surgery of the Health Ministry ofRussia", Moscow
2ZAO "ReMeTeks", Moscow
3URAMN "Medical Genetic Research Center", Moscow
Summary
The results of our clinical pilot study tkaneinzhenemoy design based on multipotent mesenchymal stromal cells of adipose tissue showed that the use of this construction leads to the restoration of bone tissue and stimulate reparative osteogenesis. And also to outline directions for further clinical study on the Application of LIC VT in maxillo-facial surgery.
Key words: Tissue Engineering, adipose tissue, stromal cells, the carrier material, enrichment of platelets, bone tissue.
Введение
Восстановительная медицина, основанная на использовании стволовых клеток, считается идеальной альтернативой регенерации кости. [13]. Последние достижения в области клеточной и молекулярной биологии привели к развитию новых методов лечения, направленных на регенерацию тканей.
Тканевая инженерия представляет собой многопрофильную отрасль, основанную на фундаментальных учениях в биологии, медицине, клеточной инженерии [2]. Более 15 лет тому назад клиницисты приступили к изучению возможности применения стволовых клеток для восстановления органов и тканей. ММСК были признаны оптимальными для применения в практической медицине, и связано это с простотой их выделения, изоляции, а также высоким потенциалом к дифференцировке в разные типы клеток.
С 2006 гг. по 2011 год - на базе ФГУ «ЦНИИС Минздравсоцразвития России» совместно с ЗАО «РеМеТэкс» в соответствии с решением Ученого совета и этического комитета было проведено клиническое и экспериментальное исследование по восстановлению костных дефектов и устранению дефицита костной ткани на верхней и нижней челюстях с помощью ТИК на основе мультипа-тентых мезенхимальных, стромальных клеток, выделенных из жировой ткани, и преддифференциро-ванных в остеогенном направлении.
Первоначальной задачей нашего исследования было обоснование выбора источника ММСК -жировой ткани. Практически во всех представлен-
ных клинических исследованиях по применению ММСК для восстановления костной ткани источником ММСК был красный костный мозг и в некоторых случаях надкостница.
Однако многочисленные доклинические исследования, проведенные за последнее десятилетие, предоставили данные о безопасности и эффективности стволовых клеток, полученных из жировой ткани, а также перспективности их использования. И в первую очередь это связано с возможностью получения достаточного объема клеток при том, что манипуляция забора жировой ткани является малотравматичной [11].
Обоснованием выбора жировой ткани как источника ММСК для клинического исследования стали не только литературные данные, но и проведенные нами лабораторные и экспериментальные исследования:
1. Малоинвазивность метода получения значительного объема ММСК: из 1 грамма жировой ткани может быть получено от 5000 клеток, что в 500 раз больше, чем количество клеток, полученных из 1 грамма костного мозга [5; 7-8; 11].
2. Низкий уровень клеточного старения ММСК ЖТ при многократном культивировании [7; 8].
3. Межклеточное взаимодействие ММСК ЖТ способствовало секрециия факторов роста и цитокинов [3].
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО.
4. Образование кости de novo в экспериментальном исследовании после трансплантации ТИК ЖТ.
Таким образом, наш выбор был предопределен изучением многочисленных зарубежных исследований in vitro, клинических исследований по применению ММСК ЖТ при лечении ишемической болезни сердца, ишемии мозга.
Объем липоаспирата рассчитывался исходя из предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергался криоконсервированию. В зависимости от этого объем липоаспирата составлял от 20-60 мл. Ни у одного пациента после липоаспирации осложнений не наблюдалось. В течение трех дней сохранялся отек мягких тканей в пупочной области, связанный с введением раствора Кляйна для гидропрепарирования.
Следующей задачей исследования был выбор материала-носителя. Одной из первостепенных задач материала-носителя было обеспечить жизнедеятельность клеток, то есть выполнять функцию внеклеточного матрикса. Материал должен был обладать высокой прочностью, чтобы была возможность использовать его в форме блоков индивидуальной формы, соответствующих форме дефекта [6]. Ведущими требованиями к имплантаци-онному материалу, который мог быть использован в виде носителя клеток, были: остеокондуктив-ность, биосовместимость, пористая структура, механическая прочность, возможность 3D моделирования. Материал должен был быть биодеградируе-мым и не вызывать воспалительных реакций; не препятствовать росту, пролиферации и дифферен-цировке клеточной культуры, формированию сосудистой сети поддерживать заданный объем и структуру в течение определенного времени [1,4,9].
Ддя обоснования выбора материала-носителя, оценки эффективности применения ТИК ЖТ, а также обоснование сроков проведения дентальной имплантации было проведено экспериментальное исследование. В качестве экспериментальной модели мы выбрали заживление критических дефектов в области теменных костей у взрослых кроликов. Животные выводились из эксперимента на 120 сутки.
В результате экспериментального исследования был выбран материал-носитель, «Остеоматрикс» - биокомпозиционный материал, представляющий собой костный матрикс с сохраненными коллагеновым и минеральным компонентами и природной архитектоникой губчатой кости. (ООО «Коннектбиофарм», Москва). В экспериментальной модели было проведено биомеханическое исследование ТИК ЖТ до и после трансплантации по ключевым показателям, характеризующим как прочностные характеристики, так и твердость конструкций. Прочностные характеристики ТИК ЖТ после 4 месяцев трансплантации позволили поддерживать механическую функцию замещаемой ткани.
Результат экспериментального исследования обосновал возможную эффективность использования ТИК ЖТ в клиническом исследовании, а также позволил определить возможные сроки проведения дентальной имплантации в 120 дней. Также результатом экспериментального исследования при трансплантации ТИК ЖТ стало утверждение, что трансплантация ТИК ЖТ в область дефекта позволяет получить такой объем костной ткани, который ограничивается лишь объемом самой ТИК, в последствие это было подтверждено клинически - объем трансплантата по данным КТ с течением времени не менялся.
Также эксперимент подтвердил наше предположение, что ТИК является полноценным аутотрансплантатом, внутри которого происходят процессы регенерации: образование костной ткани в регенерате после трансплантации происходило во всех зонах регенерата, независимо от «удаленности» от материнской кости. Эти данные были подтверждены и в клиническом исследовании: образование костной ткани при трансплантации ТИК ЖТ наблюдалось по всей толщине трансплантата.
При приготовлении ТИК мы использовали обогощенную тромбоцитарную массу - РКР - как дополнительный компонент. Использование РКР в ТИК как третьего компонента было важно, так как заключение преддифференцированных в остеогенном направлении клеток в фибриновый гель, состоящий из обогащенной тромбоцитами плазмы, позволяло смоделировать нормальное течение регенеративного процесса [10; 12], а также предотвратить вымывание клеток при трансплантации. Для этого культура клеток смешивалась с обогащенной тромбоцитами плазмой. Далее полученная суспензия наносилась на материал-носитель, после чего проводилась полимеризация. Таким образов клеточная культура фиксировалась в порах материала.
В клиническом исследовании было проведено лечение 20 пациентов с применением ТИК ЖТ (табл.). Срок наблюдения за пациентами составил от 1,5 до 5 лет. Немногочисленность нашего клинического исследования объясняется тем, что мы с большой осторожностью относились к проведению данного исследования.
Первые пять пациентов прошли лечение с помощью ТИК ЖТ в течение первого года клинического исследования. Когда были получены первые результаты лечения, клиническое исследование было продолжено.
В ходе клинического исследования был оптимизирован технологический процесс приготовления клеточного трансплантата, а именно:
■ сокращение сроков культивирования было достигнуто за счет увеличения объема липоаспирата. Увеличение объема липоаспирата позволяло получить большой объем малодифференцированных клеток, что способствовало уменьшению количества пассажей культивирования. Наименьший срок культивирования составил 14 дней, максимальный срок культивирования составлял 30 дней, что было обусловлено так называемой лаг-фазой, которая длится от 3 до 10 суток в зависимости от индивидуальных особенностей организма;
■ сокращение сроков дифференциров-ки: сроки дифференцировки в начале исследования составляли 21 сутки, но потом были сокращены до 14 суток. Этого срока оказалось достаточно для дифференцировки, что было подтверждено литературными данными. После 14 суток начиналась выраженная минерализация внеклеточного матрикса, и открепление клеток от поверхности материала становилось затруднительно: при откреплении клеток от ростковой среды на сроке более 14 дней, часть из них оставалась на материале. Также для сокращения срока по подготовке ТИК была разработана схема сборки ТИК в условиях операционной.
Таблица
Распределение пациентов по локализации хирургического вмешательства
Синус-лифтинг (19 пазух) Лунка (9 лунок) Костная пластика на нижней челюсти с 2 сторон Закрытие костного дефекта в области имплантата
13 пациентов (19 пазух) 7 пациентов из них 3 пациентам одномоментно был проведен синус-литинг 3 1
Результаты лечения оценивались по данным компьютерной томографии и морфометрии биоптата, полученного при формировании ложа для дентального имплантата.
Гистоморфометрическое исследование было основным критерием оценки результатов клинического исследования. Морфологическое исследование биопсийнного материала, показало, что костный регенерат состоял преимущественно из зрелой пластинчатой костной ткани, ориентированной на подобии балок губчатой кости.
Проведение компьютерной томографии до и после лечения являлось основным диагностическим показателем: через 120 дней после трансплантации определялась сформированная костная ткань, по структуре соответствующая неизменной костной ткани. В отдаленных сроках наблюдений объем трансплантата был постоянным, в области проведенной трансплантации была видна неизмененная костная ткань.
Литература
1. Burg K.J.L., Porter S., Kellam J.F. Biomaterials development for bone tissue engineering. Biomaterials 2000;21:2347-59.
2. Estrela C, Alencar AH, Kitten GT, Vencio EF, Gava E. Mesenchymal stem cells in the dental tissues: perspectives for tissue regeneration. Braz Dent J. 2011;22(2):91-8.).
3. Kilroy GE, Foster SJ, Wu X, Ruiz J, Sherwood S, Heifetz A, Ludlow JW, Stricker DM, Potiny S, Green P, Halvorsen YD, Cheatham B, Storms RW, Gimble JM. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol 212(3):702-709, 2007.
4. Kidd KR, Nagle RB, Williams SK. Angiogenesis and neovascularization associated with extracellular matrix-modified porous implants. J Biomed Mater Res. 2002;59:366-377.
5. Kuhbier JW, Weyand B, Sorg H, Radtke C, Vogt PM, Reimers K. Stem cells from fatty tissue : A new resource for regenerative medicine? Chirurg. 2010 Sep;81(9):826-32.
6. Li J, Zhang L, Lv S, Li S, Wang N, Zhang Z. Fabrication of individual scaffolds based on a patient-specific alveolar bone defect model. J Biotechnol. 2011 Jan 10;151(1):87-93.
7. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J Nippon Med Sch. 2009 Apr;76(2):56-66. Review.
8. Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cell-based therapy: current status of preclinical studies and clinical trials. Curr Opin Mol Ther. 2010 Aug;12(4):442-9.
9. Patel ZS, Mikos AG. Angiogenesis with biomaterial-based drug- and cell- delivery systems. J Biomater Sci Polymer Edn. 2004;15:701-726.
10. Verfaillie CM. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. Trends Cell Biol. 2002 Nov;12(11):502-8.
11. Witkowska-Zimny M, Walenko K. Stem cells from adipose tissue. Cell Mol Biol Lett. 2011 Jun;16(2):236-57.
12. Yamada Y, Boo JS, Ozawa R, Nagasaka T, Okazaki Y, Hata K,Ueda M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold. J Craniomaxillofac Surg 2003;31:27-33.
13. Zhang Z. Bone regeneration by stem cell and tissue engineering in oral and maxillofacial region. Front Med. 2011 Dec;5(4):401-13.
В результате проведенного экспериментального и клинического исследования был разработан новый способ создания ТИК для восстановления костной ткани, основанный на принципе свободного распределения клеток в фибриновом сгустке внутри матрицы-носителя. В качестве источника регенерации тканеинженерная конструкция включает в себя мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани, преддиференцированные в остеогенном направлении, обогащенную тромбоцитами плазму и резорбируемый материал на основе ксеногенного костного коллагена. Культура остео-прогениторных клеток охарактеризована по основным маркерам остеобластического дифферона. Используемый материал отвечает требованиям, предъявляемым к материалам для ТИК. Получен инновационный высокотехнологичный тканеинженерный продукт для клинического применения. Эффективность применения ТИК ЖТ подтверждена результатами клинического исследования.
