CC BY
27
УДК 579.8:577.336
РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБЩЕЙ ТОКСИЧНОСТИ ТАБАЧНОГО ДЫМА МЕТОДОМ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МИКРОБИОТЕСТИРОВАНИЯ
Н.М. Никитина, РЛ. Пшеничное, М.В. Демина
Введение
Огромный вред, наносимый населению табакокурением, общепризнан и широко известен. Тем не менее, около 40% взрослого населения Земли, или 1,28 млрд. человек, курят, что является причиной смерти 3,5 млн. человек ежегодно. По мнению специалистов, геноток-сины табачного дыма являются первой причиной злокачественного перерождения тканей, и рак легких составляет 1/8 часть регистрируемых новообразований. В табаке, как в любой сложной природной субстанции, химико-аналитическим путем обнаружено более 2500, а в табачном дыме уже 4000 компонентов, и по крайней мере 40 из них обладают общетоксическим действием на макроорганизм [5,6 и др.]. Как правило, они присутствуют в дыме в виде разнообразных сочетаний и суммарный эффект их действия можно определить только биологическим тестированием.
Цели и задачи
1. Выявить динамику развития эффекта ингибирования свечения в люминесцентном микробиотесте в зависимости от срока контакта поглотителя с сенсором.
2. Выявить возможные механизмы действия токсикантов табачного дыма на клетку-мишень.
3. Оценка задымленности помещения с помощью люминесцентного микробиотеста.
4. Выявить возможность использования микробиолюминесцентного теста для оценки факторов, снижающих опасность курения.
Материалы и методы
Авторами был разработан и апробирован для этих целей люминесцентный микробио-тест [3]. В основу метода положен перевод газообразных токсикантов табачного дыма в водорастворенное состояние и количественный учет их токсического действия на свечение генно-инженерных и природных видов светящихся бактерий в реакции угнетения микробиолюминесценции [2, 3]. Для проведения анализа дым горящей сигареты протягивали через колбу с поглотителем (П) - стерильный физиологический раствор рН 7,0. Для более полного перехода токсикантов в жидкую фазу закрытую колбу с П выдерживали на качалке в течение 30 минут при температуре 37°С. Далее определение вели по классической схеме [1, 3], для чего 0,5 мл П и двукратные его разведения сводили с равным объемом сенсора в рабочем разведении с последующим 30-минутным контактом при температуре 20°С. Интенсивность свечения опытных и контрольной пробирок оценивали в приборе «Биотокс-6». В нем же сравнивали их свечение и автоматически регистрировали степень снижения свечения под влиянием токсикантов табачного дыма, или индекс токсичности (ИТ, %). Контролем служил П, через который табачный дым не пропускали. В качестве сенсора использовали культуры генно-инженерных штаммов Escherichia coli commune lux+ и природные варианты морских светящихся бактерий в виде авторских препаратов - Микробио-люминесцентный Индикатор Токсичности [2],
«Эколюм-5» [4], Vibrio fischen, содержащие однотипный /ш>оперон.
По замыслу авторов, предлагаемая методика в сравнении с традиционными химическими анализами должна была обладать следующими преимуществами: 1) не только фиксировать присутствие токсикантов в табачном дыме, но и устанавливать их отрицательное влияние на клетки сенсора; 2) позволять объ-ективно-приборно-количественно оценивать не только влияние отдельных токсикантов, но и их многокомпонентных смесей с учетом эффектов суммации, взаимоусиления или ослабления их действия. Дальнейшие опыты показали, что предлагаемая методика оказалась четко воспроизводимой, а результаты сопоставимы между собой.
Результаты и обсуждение
Результаты и обсуждение можно сгруппировать следующим образом:
А. Динамика развития эффекта ингиби-рования свечения в зависимости от срока контакта П с сенсором. В этих опытах задымленный П и три его двукратных разведения сводили с сенсором и результаты ингибирова-ния свечения учитывали через 10 с, 5,15, 30,60 и 120 мин. Ивдекс токсичности для этих сроков составлял для цельного П - 36-80-89-91-93-95% соответственно. Для разведений П динамика была аналогичной, а абсолютные значения ИТ, соответственно, ниже. Это позволяет отнести токсиканты табачного дыма к числу быстродействующих, сильных и рекомендовать срок учета результатов реакции через 30 мин - как близкий к максимальному и технически удобный.
Б. Возможные механизмы действия токсикантов табачного дыма на клетку-мишень. В этих опытах в П добавляли 50% по объему мясопептонный бульон (МПБ) и через полученную смесь в опыте, но не в контроле, про-
пускали дым сигареты. Затем проводили засев сенсора в контрольную и опытную колбы, задавая исходную оптическую плотность 0,031 (КФК-3, кювета 5,0). Посевы инкубировали в термостате при 37°С. Забор образцов для анализа проводили через 2, 4, 6, 20 ч культивирования. Каждый раз замеряли интенсивность свечения, оптическую плотность биомассы (ФЭК), концентрацию живых клеток в 1 мл культуры (высевами на плотную питательную среду). Основные результаты отражены на рисунке и в тексте.
Время культивирования,ч
Рис. Влияние табачного дыма на рост (КОЭ/мл х 106) и накопление биомассы (ОП, ед. ФЭК) в условиях развития сенсора в МПБ: 1 - рост в контроле, 2 -рост в опыте, 3 - накопление биомассы в контроле, 4 - накопление биомассы в опыте
Развитие культуры в контроле было типичным для периодического культивирования. Интенсивность свечения клеток в течение первых двух часов быстро возрастала до максимума, сохранялась на этом уровне до четырех часов, затем постепенно снижалась. Оптическая плотность биомассы нарастала в течение первых шести часов до 0,97 ед.опт.пл, а затем стабилизировалась на этом уровне до конца опыта. Концентрация живых клеток, измеряемая числом колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), возрастала логарифмически к четы-
99
рем часам наблюдения до 71,9*106, а затем снижалась до 6,9х Ю6 к 20 часам опыта. Иную картину наблюдали в опытных колбах. Здесь ингибирование свечения клеток резко нарастало уже в первые минуты, к 2 ч ИТ уже составил 99,6% по сравнению с контролем и сохранялся на этом уровне до 4 ч наблюдения. Позднее, к 20 ч, свечение клеток восстанавливалось, а ИТ, соответственно, снижался до 2%. Оптическая же плотность биомассы в течение 6 ч наблюдений существенно не изменялась, затем плавно нарастала до 0,44 к концу опыта. В отличие от контроля, концентрация живых клеток в опытной колбе, незначительно снизившись после засева, оставалась практически неизменной до 6 ч с последующим подъемом и выравниванием с цифрами контроля к концу опыта. Создавалось впечатление, что под влиянием токсикантов табачного дыма опытные клетки испытывают некое «шоковое» состояние, для которого характерно резкое снижение их свечения, временное подавление репродуктивных свойств с сохранением концентрации живых клеток в культуре. Видимо, указанное воздействие не летально для клеток, находящихся в задымленной питательной среде, т.к к концу опыта показатели активности свечения и концентрация живых клеток в опыте и контроле выравнивались.
Если допустить, что легочные клетки под воздействием табачного дыма, т.е. при курении, испытывают подобное воздействие и ответные реакции их однотипны с описанными, а частота воздействия возрастает соответственно числу выкуренных сигарет, то напрашиваются два вывода;
1. Клетки макроорганизма (особенно легочные) курящего человека подвержены постоянному пульсирующему влиянию стрессовых нагрузок, степень которых возрастает при увеличении частоты курения.
2. Если изменения в клетках затрагивают и его репаративные системы, то возникающие
мутационные изменения легче закрепляются в потомстве клеток, что может вести и к увеличению числа их раковых перерождений, т.е. стимулировать канцерогенез тканей.
Высказанное предположение представляет интерес, но нуждается в дополнительном фактическом обосновании, которое и покажет его верность или ошибочность.
В. Оценка задымленности помещения предложенный способом. Учитывая важную роль «пассивного» курения, мы попытались использовать предлагаемую методику и для количественной оценки содержания токсикантов табачного дыма в воздухе при разной степени задымленности помещения. Опыты проводили в помещении объемом 15 м3, где размещали аппарат для протяжки воздуха через П и в течение одного часа сжигали б или 20 сигарет одновременно, пропуская воздух через П. Отбор проб П проводили на 5,15, 30-й и 60-й мшгутах опыта. Их анализ вели по стандартной схеме, и зарегистрированный уровень токсичности (ИТ,%) составлял для малозадымленного помещения 0,6-0,8-3,4-6,7%, а для сильно задымленного- 9,3-17,4-18,6-33,6% соответственно. Этот и подобный ему опыты показали пригодность разработанного биотеста для контроля содержания токсикантов табачного дыма в помещениях и еще раз подтвердили влияние степени задымления помещения и времени пребывания там на степень формируемой интоксикации.
Г. Использование микробитюминесцент-ного теста для оценки факторов, снижающих опасность курения. Есть основания полагать, что уровень общей токсичности табака и его дыма определяется целым рядом обстоятельств. К ним относятся сорт табака, условия его произрастания, технология переработки. В итоге о степени его вредности принято судить по содержанию никотина и смол, которое определяется химическим путем и вместе с маркировкой качества приводится на упаковке. Поэтому в
следующей серии опытов мы попытались сопоставить содержание никотина, смол в табаке с общей токсичностью его дыма. Для сравнения были взяты 8 вариантов сигарет с фильтром марки «1£>» с разным содержанием никотина и смол, выпускаемые одним производителем: ЗАО «Лиггет - Дукат» (Москва).
Содержание никотина и смол в табаке сигарет отражено в таблице. Их дым биотестиро-вали с помощью предлагаемой методики (результаты в виде ИТ в % приведены в таблице). Они свидетельствуют, что в принципе существует прямая зависимость между содержанием
Другим обстоятельством, способным существенно снизить токсичность дыма, несомненно, является использование сигарет с фильтром. Возникнув в свое время, такие сигареты получили быстрое признание среди населения и самое широкое распространение. Полезность фильтров была неоднократно подтверждена химическими анализами. Биотестирование позволило бы дополнить эту информацию и сформировать всестороннее, более цельное представление по данному вопросу. Рекомендуемый биотест был использован нами в трех вариантах опытов, преследующих единую цель.
В первом варианте исследованы сигареты с фильтром и без фильтра марки «Прима», изготовленные из одной партии табака, обработанные по единой технологии (ОАО «Табачная
названных поллютантов и общей токсичностью дыма. Однако эта зависимость не является строго прямолинейной и отклонения могут быть весьма существенными. Скорее всего, это объясняется тем, что на пачках указано содержание лишь двух, а реально в табаке присутствуют и десятки других неопределяемых токсикантов, которые выявляются предлагаемой методикой. Эта методика, к тому же, учитывает и эффекты их суммации, усиления и взаимоослабления действия. В этом смысле суммарный показатель ИТ представляется нам более информативным.
фабрика «Астра», г. Пермь). Их сжигали в описанной ранее установке, образующийся дым пропускали через П и исследовали по обычной схеме. Контролем служил П, через который пропускали чистый воздух. Ход исследований был одинаков с предыдущими опытами. ИТ для сигарет без фильтра составлял 92,1±1,5%, а для сигарет с фильтром - 74,8±0,5%. Преимущество качества сигарет с фильтром было очевидным.
Во втором варианте опытов исследованы три разных сорта сигарет с фильтром марки «LD» ЗАО «Лиггет-Дукат» (Москва) с одинаковым содержанием никотина (0,7 мг) и смолы (8 мг) в сигарете. Их фильтры были различны и имели следующую коммерческую маркировку качества: 1 - «Platinum», 4600051003058; 2 - «Lights», 4600051000255; 3- «Mint», 4600051000521. Их дым исследован по вышеописанной методи-
Содержание никотина, смол в сигаретах ЬЭ с 8 типами фильтров и общая токсичность
водорастворимых фракций их дыма
Показатель Тип фильтра
Filter Lights Mint Platinum Standart Lights Slims Super Lights Slims ultra
Состав смола/никотин, мг/сиг. 10/0,8 8/0,7 8/0,7 8/0,7 8/0,6 5/ 0,5 4/0,4 3/0,3
ГОСТ 3935-2000 3935-2000 3935-2000 3935-2000 3935-2000 3935-2000 3935-2000 3935-2000
Маркировка качества 4600051 002686 4600051 000255 4600051 000521 4600051 003058 4600051 002822 4600051 002426 4600051 000507 4600051 002440
ИТ, % 74,5 62,7 72,4 60,1 73,2 48,4 43,9 37,3
101
ке, ИТ был равен 60,1-62,7-72,4% соответственно. Таким образом, разница в эффективности проверенных типов фильтров оказалась столь существенной, что стоит рекомендовать потребителю уделять большее внимание этому показателю и даже использовать его при маркировке сигарет.
При определении задачи третьего варианта опытов мы невольно обратили внимание на столь же высокий эффект поглощения токсикантов дыма П. Еще в древности использовался прототип «жидкого» фильтра в курительных приборах типа «Кальян». Представлялось разумным сочетать два разнотипных способа очистки табачного дыма от токсикантов: фильтрами сигарет и жидкостной. Для этого использовали модернизированный ингалятор Махольда, представляющий собой и-образный стеклянный сосуд с открытыми концами. Один из патрубков трубки имеет больший диаметр и гофрирован для лучшего контакта жидкости П с воздушной средой, другой оборудован мундштуком. Общий размер прибора составляет 15х5х2 см. Он упакован в изящный пластиковый чехол и может быть отнесен к числу портативных карманных вещей. Перед применением в прибор заливали 5 мл обычной прокипяченной воды, вставляли в мундштук сигарету, второй конец выводили в колбу с П, поджигали сигарет}7 и протягивали табачный дым через прибор и систему поглощения в прерывистом, имитирующем курение, режиме с помощью вакуумного насоса. Таким образом, токсиканты дыма улавливались сначала фильтром сигареты, а затем водной средой «микрокальяна», чем достигалась двойная очистка от токсикантов дыма. Контролем служила та же система, где в «кальян» воду не заливали. По завершении опыта определяли ИТ в пробах воды «микрокальяна» и в II колбы. На основании двух групп опытов при трехкратном повторении получены следующие результаты. Для сигарет без фильтра ИТ жидкости «кальяна» составлял
94,6%, для П колбы - 23,1%. В группе опытов, где использовали сигареты с фильтром, эти же показатели составляли 97,2% и 9,0% соответственно. В контрольном варианте ИТ поглотителя в колбе составил для сигарет с фильтром 76,6%, для сигарет без фильтра - 86,2%. Приведенные данные свидетельствуют о высокой степени извлечения токсических компонентов табачного дыма водой «кальяна», которое дополнительно значительно возрастало при комбинированном использовании двух разнотипных способов очистки: фильтрами сигарет и жидкостном.
Выводы
1. Разработан и апробирован вариант метода микробиолюминесцентного тестирования, позволяющий выявлять и количественно определять эффекты действия токсикантов табачного дыма. Способ хорошо воспроизводим, доступен санитарно-гигиеническим лабораториям, пригоден для выявления токсичности отдельных компонентов табачного дыма и суммарного действия многокомпонентных смесей с учетом конечных эффектов их взаимодействия. Он объективен и позволяет при-борно определять индекс токсичности, выраженный в %.
2. Метод успешно использован для изучения динамики развития и некоторых механизмов интоксикации ¡слеток, оценки задымлен-ности помещений, факторов, снижающих опасность табакокурения и т. п.
Библиографический список
1. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм»: методические рекомендации. - М., 2000. - 19 с.
2. Микробиолюминесцентный индикатор токсичности./ РА. Пшеничное., АВ. Браж-
кин, ВМ. Колотое и др. // ТУ 846-001-04538050-00. - Пермь, 2000. - 12 с.
3. Пшеничное, РА Микробиолюминесценция (оптимизация сенсоров и расширение сферы использования реакции) / РА. Пшеничное, ИЛ. Масленникова, НМ. Никитина // Сборник УрО РЖ - Пермь. - 2005. - 76 с.
4. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе /шг-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / B.C. Данилов, АЛ. Зарубина, ГЕ. Ерошников и др. // Вестник МГУ. - 2002. - № 3. - С. 20-24.
5. Bemhard, D. Metals in cigarette smoke / D. Bernhard, A.Rossman, G.Wick I I IUBMB Life. - 2005. - Vol. 57. - № 12. - P. 805-809.
6. Fujioka, K. Determination of toxic carbonyl compounds in cigarette smoke / K. Fujioka, T.Shibamato // Environ. Toxicol. - 2006. -Vol. 21. - № l.-P. 47-54.
N.M. Nikitina, RA. Pshenichnov, M.V. Demina
results of studying general toxicity of tobacco smoke with bioluminescent microbiotesting method
Relatively simple, short-term, generally available variant of luminescent microbiotesting using cultures of luminescent bacteria to reveal and estimate degree of tobacco smoke toxicity recommended for primary screening was described. The method is well reproduced, available for sanitary-hygienic laboratories, usable for revealing separate toxicants and multicomponent mixtures of tobacco smoke taking into account final effects of their interaction. The method is successfully used to investigate dynamics of interaction between toxicants and sensor cells. It is also available for studying some mechanisms of sensor cell intoxication, tobacco toxicant content in buildings, factors reducing danger of tobacco smoking and some other purposes.
Keywords: tobacco, smoking, tobacco smoke toxins, microbioluminescent method of their revealing.
Институт экологии и генетики микроорганизмов
УрО РАН, г. Пермь
Материал поступил в редакцию 10.05.2007
© Никитина Н.М., Пшеничное РА, Демина М.В, 2007
103
