CC BY
61
УДК 611.12: 575.16-029.9
О.О. Савенкова, С.В.Козлов, В.В.Кошарний, В.Ф. Шаторна
результати використання імуногістохімічних методів у дослідженнях процесів васкулогенезу та їх порушень після впливу гіпоксії і гіпертермії
дніпропетровська державна медична академія (м. дніпропетровськ)
Дане дослідження є фрагментом планової наукової роботи кафедри анатомії людини Дніпропетровської державної медичної академії «Морфогенез серця та судин після експериментальних втручань» (номер державної реєстрації 0106Ш12193).
Вступ. В наш час, у зв’язку з посиленням негативного впливу екологічної обстановки на організм людини, зростає інтерес спеціалістів як медицини так і біології до адаптаційних можливостей серцево-судинної системи та проблем виникнення вад розвитку [1, 2, 3, 4]. В цьому аспекті набуває практичного значення медична і порівняльна ембріологія та їх методи дослідження [5, 6, 8, 11]. Сучасну науку цікавлять зміни в навколишньому середовищі, що виникають під впливом антропогенних факторів та можуть провокувати порушення розвитку органів (гіпоксія, гіпертермія, хімічні речовини, вплив опромінення та ін.) [7, 9, 10]. До теперішнього часу відсутня в необхідному обсязі інформація про морфогенетичні закономірності змін, що виникають на етапах раннього кардіогене-зу в будові серця під впливом тих чи інших факторів. Серед цих факторів досить часто зустрічаються такі, як гіпертермія та гіпоксія, але дослідження впливу зазначених факторів не виявляють механізму та термінів ембріогенезу, коли можливим стає утворення аномалії [12, 13, 14].
У зв’язку з тим, що безпосереднє спостереження за розвитком вад у людини неможливо, тому за допомогою індукованих експериментальних моделей піддослідних тварин стає можливим аналіз морфогенетичних змін у серці при формуванні вад розвитку серця. Виявлення термінів, причин та механізму утворення аномалії розвитку серця в цілому, або його компонентів під впливом високих температур або гіпоксії дозволить розробити модель виникнення вади розвитку серця. Вірогідність формування відхилень розвитку в критичні періоди ембріогенезу, коли підвищена чутливість до дії ушкоджувальних чинників, найбільш висока.
Метою дослідження було визначення основних етапів і термінів васкулогенезу ембріонального серця піддослідних тварин в нормі та виявлення змін після впливу гіпоксією та гіпертермією.
Об’єкт і методи дослідження. Матеріалом дослідження послужили 35 сердець ембріонів білих безпородних щурів, які отримувались на фіксованих термінах вагітності самки в лабораторних умовах за загальноприйнятими методиками. Для більш детального вивчення структурно-функціональних перетворень проводили гістологічні зрізи в трьох взаємно перпендикулярних площинах, що дало можливість співставлення результатів для повного просторового аналізу. В ході дослідження використали експериментальну модель гіпоксії та гіпертермії у дослідних тварин. Підвищення температури у щурів викликали шляхом однократного внутрішньоочеревинного ведення пірогеналу в дозі 3,0мг/кг вагітній самиці. Вплив гіпоксією проводився згідно рекомендацій Н.Ф.Іваницької (1976) та методичних рекомендацій міністерства охорони здоров’я України (2003) підшкірним введенням нітрату натрію (50 мг/кг) одноразово.
Для визначення часу найбільшого впливу гіпоксії та гіпертермії на кардіогенез та розвиток судин проводили попереднє дослідження шляхом моделювання гіпоксії та гіпертермії ембріонів у три різні періоди розвитку ембріону. Відповідно спочатку формувались три експериментальні групи. Перший експеримент впливу проводили на стадії розвитку, що відповідає початку формування серцевої трубки (у ембріонів щура - 8-ма доба ембріогенезу), другий експеримент по впливу проводили в період ембріогенезу, що передає септації серця (у ембріонів щура -9-та доба ембріогенезу). Третій експеримент по впливу проводився в стадії розвитку, яка відповідає закінченню септації серця дослідних тварин. Результати показали, що 1-й вплив (перша експериментальна група) гіпертермією призводив до загальної загибелі ембріонів тварини, бо на цей період розвитку ембріон являє собою нестабільну систему і вплив високих тем-
ператур призводить до незворотних процесів та руйнує організм. В тій же групі дослідних тварин вплив гіпоксією не мав наслідків, бо потреба ембріона в кисні на цей період розвитку незначна. Аналіз результатів другої експериментальної групи показав, що вплив саме в цей період призводив до часткової загибелі ембріонів та формування численних вад , як зовнішнього розвитку , так і вад серця. Вплив на розвиток в 3-й період теж викликав масову загибель ембріонів. Тому в подальшому нами розглядались лише результати впливу на 2-гу групу ембріонів.
Для виконання поставленої задачі використовували окрім стандартних морфологічних також і сучасні методи дослідження-імуногістохімію. Імуногістохімічні методи застосовувалися для оцінки процесів ангіогенезу та васкулогенезу. Ми проводили аналіз даних після впливу гіпертермією і гіпоксією, що дало можливість співставили результати для визначення терміну найбільшого впливу на хід процесів ангіо-та васкулогенезу. В роботі використовували наступні маркери:
- CD34—цитоспецифічний маркер ендотелію. Використання саме цього маркеру дало можливість визначити початок та напрямок перших етапів утворення судин серця;
- а-Бта-маркер гладенької м’язової тканини, використання якого дало можливість не тільки визначити основні етапи ва-скулогенезу, але й дозволило відстежити диференціювання первинних судин серця, що розвивається у процесі кардіогенезу та зміни, які відбуваються після впливу гіпоксії та гіпертермії;
Результати досліджень та їх обговорення. Спостереження за процесами ангіогенезу та васкулогенезу проводилися на гістологічних зрізах з використанням маркерів CD34 та а-Бта. Накопичення маркеру CD34 в структурах ембріонального серця вказувало на початок формування ендотелію первинних судин. Контролем даної реакції було накопичення зазначеного маркеру ендокардом серця. Подальше диференціювання первинних судин серця, що розвиваються спостерігали завдяки накопиченню імуногістохімічного маркеру а-Бта, що є маркером гладенької м’язової мускулатури. Таким чином, ці два маркери дозволили визначити основні етапи васкулогенезу та відстежити зміни, які відбуваються після впливу гіпоксії та гіпертермії.
Ми спостерігали виражено нерівномірне накопичення маркерів у різних відділах серця та його судин в нормі та після впливу те-ратогенних чинників. Найбільша кількість маркеру а-Бта спостерігалась звісно у стінках
великих судин серця-аорті та в легеневому стовбурі (рис. 1).
Рис. 1. Серце ембріона щура 17,5 діб розвитку після впливу гіпоксією. Накопичення маркеру а-Бта (коричневий колір). Збільшення: ок.8 Х об.10. Позначення: 1 - шлуночок; 2 -передсердя; 3 - аорта.
Накопичення цього маркеру також продемонструвало, що півмісяцеві заслінки на 17,5 добі розвитку вже містять гладенькі м’язові волокна. Дослідження зрізів у трьох взаємно перпендикулярних площинах показало, що заселення ендокардіальних гребенів та півмісяцевих заслінок великих судин серця гладенькими м’язовими волокнами відбувається не хаотично, а таким чином, що утворюється немовби контрактурні тяжі в основі заслінки (рис. 2). Гістологічне диференціювання напівмісячних заслінок великих судин у часі випереджає формування стулок передсердно-шлуночкових клапанів, де не спостерігалось накопичення зазначеного маркеру.
Рис. 2. Півмісяцеві заслінки аорти серця ембріону щура 17,5 діб розвитку після впливу гіпоксією. Накопичення маркеру а^та має вигляд тяжів в стулках, що формуються (коричневий колір). Збільшення: ок.10 х об.10.
Стінка ембріонального передсердя посідає друге місце у накопиченні цього маркеру, так як саме передсердя є за своїм походженням розширенням венозного синусу раннього трубчастого серця, тобто передсердя є похідною судини, що і підтверджено імуногістохімічними дослідженнями. У стінці шлуночків даний маркер спостерігався лише в судинах міокарду. Більш інтенсивне або менш інтенсивне накопичення маркеру (коричневий колір) лише говорить про ступінь диференціювання стінки даної судини.
Наданому етапі ембріогенезу найбільшого ступеню диференціювання сягають судини атріовентрикулярної борозни та компактного міокарду шлуночків, який на відміну від трабекулярного шару вже не може отримувати кровопостачання з порожнини серця (рис. 3). Використання маркеру а-Бта показало, що гіпоксія не тільки підвищує кількість діючих кровоносних судин, але й призводить до раннього диференціювання стінок судин.
Рис. 3. Судини стінки лівого шлуночку серця ембріону щура 16,5 діб розвитку після впливу гіпоксією. Збільшення кількості функціонуючих судин. Коричневим кольором (накопиченням маркеру СБ34) забарвлено ендотелій судин, що формуються. Збільшення: ок.4 Х об.10.
Позначення: 1 - судини
атріовентрикулярної борозни; 2 - стінка шлуночку; 3 - порожнина шлуночку.
В міокарді сердець, які перенесли гіпертермію кількість судин та їх ступінь диференціювання істотно не відрізнявся від норми, але формувалися аномальні за формою півмісяцеві заслінки аорти та легенево-
го стовбуру. Відрізнявся від норми також і клітинний вміст самих заслінок.
Вокремихм’язовихструктурахшлуночків, таких як трабекули, соскоподібні м’язи, первинні сухожилкові нитки, формування судин відбувалось пізніше у порівнянні з судинами компактного міокарду. Ці структури отримують живлення з порожнини шлуночку і потреба в судинах виникає лише при збільшенні обсягу. Утворення судин в трабекулярному шарі та соскоподібних м’язах, як показали наші спостереження, відбувається одночасно і досить рівномірно. У зв’язку з тим, що ангіогенез у трабекулах відбувається пізніше ніж у стінках шлуночків, то і вплив гіпоксії і гіпертермії на розвиток судин цих структур не визначався. Таким чином, формування судин трабекул та соскоподібних м’язів майже не відходило від норми, в той час як судини компактного міокарду реагували на вплив тератогенного чинника.
Висновки. Протягом 10-11 стадії ембріогенезу щура відбувається закладка і диференціювання судин серця, а вплив гіпоксією і гіпертермією призводить до змін у структурах судинної системи. Як наслідок цих порушень виникають вади розвитку судин серця: аномальні за формою і клітинним вмістом стулки аорти та легеневого стовбуру, після впливу гіпертермією та збільшення діаметру і кількості діючих судин після впливу гіпоксією.
Перспективи подальших досліджень. Подальші імуногістохімічні дослідження дозволять виявити механізм і терміни виникнення вад розвитку судин серця після впливу гіпоксії та гіпертермії на клітинному рівні, і, можливо, викриють шлях до їх запобігання. Дані про механізми формування уроджених вад є важливими для розробки основ профілактичних і коригуючих заходів в гінекологічно-акушерській практиці.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Анатомия сложных врожденных пороков сердца / [Г. С. Кирьякулов, В. А. Васильев, Т. В. Бородий и др.]. — Донецк : КИТИС, 2000. — 330 с.
2. Антипов В.Н. Кровоснабжение проводящей системы при сложных врожденных пороках сердца /В.Н. Антипов, ГС. Кирьякулов, Н.В. Антипов // Таврический медикобиологический вестник.-2008.- т. 11.-№3, Ч. 2.-С. 59-61.
3. Жаріков М.Ю. Особливості впливу експериментальної коарктації аорти на стан міокарда і секреторних компонентів серця щурів / М.Ю. Жаріков, В.В.Кошарний, О.Г Козловська // Таврический медико-биологический вестник.- 2006.- Т. 9, № 3, Ч 1.- С. 58-60.
4. Козлов В. О. Формоутворення структурних компонентів серця в нормі та при моделюванні вад розвитку / В. О. Козлов, В. Ф. Шаторна, О. О. Савенкова // Вісник наукових досліджень. — 2006. — № 3. — С. 106—108.
5. Круцяк В. М. Значення ембріологічних досліджень на сучасному етапі розвитку морфологічної науки / В. М.
Круцяк, В. І. Проняєв, Ю. Т. Ахтемійчук // Буковинський медичний вісник. — 1998. — Т. 2, № 1. — С. 3—7.
6. Машталір М. А. Перебудова атріовентрикулярного каналу у курячого зародка у нормі та при порушеннях розвитку серця під впливом етанолу / М. А. Машталір // Медичні перспективи. — 2004. — Т. IX, № 3. — С. 20—23.
7. Мутафьян О. А. Врожденные пороки сердца у детей / Му-тафьян О. А. — Санкт-Петербург, 2002. — 210 с.
8. Сілкіна Ю. В. Порівняльна характеристика перетворень архітектури міокарду в ранньому серці у представників хребетних / Ю. В. Сілкіна // Карповські читання : ІІ Всеукраїнська морфол. наук. конф., 12-15 квітня 2005 р. тези доп. — Дніпропетровськ, 2005. — С. 55—57.
9. Ярцев В.Н. Возможный механизм терморегуляции при адаптации к холоду, связанный с восстанавливающим действием норадреналина на сниженную нейрогенную вазореактивность / В.Н. Ярцев, О.В. Караченцева // Гормональные механизмы адаптации: Программа и тезисы Всероссийского симпозиума с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» .- С.-Петербург, 3-5 окт. 2007 г.-СПб.: Ин-т физиологии им.И.П.Павлова.- 2007.- С.101.
УДК 611.12: 575.16-029.9
результаты использования иммуногистохимичЕских МЕТОДОВ в ИССЛЕДОВАНИЯХ процессов васкулогенеза и их нарушений после воздействия гипоксии и гипертермии
Савенкова Е.А., Козлов С.В., Кошарный В.В., Шаторная В.Ф.
Резюме. Исследовали процессы васкулогенеза сердца эмбрионов крысы в норме и под воздействием физических факторов (недостаток кислорода, гипертермия). Материалом исследования стали 35 сердец эмбрионов крысы ранних этапов развития сердца. Влияние гипоксией и гипертермией на эмбрионы проводилось опосредствовано на сроке беременности самки крысы 8-9 суток. Гипоксия провоцировала увеличение диаметра и количества сосудов миокарда, а гипертермия вызывала аномалии развития клапанов аорты и легочного ствола. Для подтверждения влияния тератогенов и нарушений закладки и дифференцировки сосудов сердца использовались иммуногистохимические маркеры. Использование маркеров CD34 и -sma позволило сопоставить процессы васкулогенеза с адаптационными механизмами тканей. Ключевые слова: кардиогенез, эмбриогенез, васкулогенез сердца.
UDC 611.12: 575.16-029.9
RESULTS OF USE OF IMMUNOGISTOCHEICAL METHODS IN RESEARCHES OF PROCESSES VASCULOGENESIS AND THEIR INFRINGEMENTS AFTER INFLUENCE HYPOXIA AND HYPERTERMIA
Savencova E.A., Kozlov S.V., Kosharnij V.V., Shatornaja V.F.
Summary. Investigated processes vasculogenesis hearts of embryos of a rat in norm and under the influence of physical factors (an oxygen lack, hyperthermia). A material of research of a steel of 35 hearts of embryos of a rat of early stages of development of heart. Influence hypoxia and hyperthermia on embryos was spent on term of pregnancy of a female of a rat of 8-9 days. Hypoxia provoked increase in diameter and quantity of vessels of a myocardium, and hyperthermia caused anomalies of development of valves of an aorta and a pulmonary trunk. For influence acknowledgement тератогеном and infringements of a bookmark and a differentiation of vessels of heart were used immunohystochemical markers. Use of markers CD34 and a-sma has allowed to compare processes vasculogenesis with adaptable mechanisms of fabrics.
Key words: cardiogenesis, embryogenesis, vasculogenesis hearts.
Стаття надійшла 9.09.2009 р.
10. Barry M. A. Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anti-cancer drugs,toxins and hyperthermia / M. A. Barry, C. A. Behnke, A. // Eastman biochem pharmacol. — 1990. — Vol. 40. — P. 2353—2362.
11. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart / V. M. Christoffels, P. E. Habets, D. Franco [et al.] // J. Dev. biol. — 2000. — Vol. 223, № 2. — P. 266— 278.
12. Chan T. Hypoxic incubation creates differential
morphological effects during specific developmental critical windows in the embryo of the chicken (Gallus gallus) / T. Chan, W. Burggren // J. Respir physiol. neurobiol. — 2005. — Vol. 145, № 2—3. — P. 251—263.
13. Chronic hypoxia stimulates periarterial sympathetic nerve development in chicken embryo / K. Ruijtenbeek, F. A. le Noble, G. M. Janssen [et al.] // J. Circulation. — 2000. — Vol. 102. — P. 2892—2897.
14. Edwards M. J. Hyperthermia, teratogenesis and the heat shock response in mammalian embryos in culture / M. J. Edwards, D. A. Walsh, Z. Li // J. Dev. biol. — 1997. — Vol. 41. — P. 345—358.
