CC BY
9© Коллектив авторов, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-02-06
РЕЗУЛЬТАТЫ I ФАЗЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НОВОГО РАДИОФАРМПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕЧЕННЫХ "-"ТЕХНЕЦИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДРЕСНЫХ МОЛЕКУЛ DARPin9_29 ДЛЯ РАДИОНУКЛИДНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ Her2/neu
О.Д. Брагина1' 2, В.И. Чернов1' 2, М.С. Ларькина2' 5, Е.С. Стасюк2, Р.В. Зельчан1' 2, Медведева А.А.1,Е.Ю. Гарбуков1, Р.Ю. Вернадский1, С.М. Деев2, 3, В.М. Толмачев2, 4
'Национальный исследовательский институт онкологии, ФГБУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Российская Федерация, 634009, Томск, пер. Кооперативный, 5; 2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», Российская Федерация, 634050, Томск, проспект Ленина, 30; 3ФГБУ «Институт биоорганической химии. им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, Российская Федерация, '17997, ул. Миклухо-Маклая, '6/10; 4Уппсальский университет, Швеция, Уппсала, Segerstedthuset, Dag Hammarskjölds väg 7; 5ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет», Российская Федерация, 634050, Томск, Московский тракт, 2 E-mail: rungis@mail.ru
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Брагина Ольга Дмитриевна — кандидат медицинских наук, врач-онколог, старший научный сотрудник отделения радио-нуклидной диагностики НИИ онкологии Томского НИМЦ. Тел.: +7 (962) 776-14-23. E-mail: rungis@mail.ru ORCID: 0000-00015281-7758.
Чернов Владимир Иванович — доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения радионуклидной диагностики НИИ Онкологии Томского НИМЦ. Тел.: +7 (903) 952-04-51. E-mail: chernov@tnimc.ru ORCID: 0000-0002-5524-9546.
Ларькина Мария Сергеевна — кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры СибГМУ. Тел.: +7 (960) 974-40-64. E-mail: marialarkina@mail.ru ORCID: 0000-0003-1176-2441.
Стасюк Елена Сергеевна — кандидат технических наук, научный сотрудник лаборатории №31 ЯР УНЦ«ИЯР» ФТИ Томского Политехнического университета. Тел.: +7(913) 828-04-82. E-mail: stasyuk@tpu.ru ORCID: 0000-0001-5281-7758.
Зельчан Роман Владимирович — кандидат медицинских наук, врач-радиолог отделения радионуклидной диагностики НИИ онкологии Томского НИМЦ. Тел.: +7(913) 829-5161. E-mail: r.zelchan@yandex.ru ORCID: 0000-0002-4568-1781.
Медведева Анна Александровна — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения радионуклидной диагностики НИИ онкологии Томского НИМЦ. Тел.: +7 (903) 952-45-75. E-mail: medvedeva@tnimc.ru ORCID: 0000-0002-5840-3625.
Гарбуков Евгений Юрьевич — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения общей онкологии НИИ онкологии Томкого НИМЦ. Тел.: +7(913) 808-46-88. E-mail: jrmaximum9@gmail.com ORCID: 0000-0002-6016-7078.
Вернадский Роман Юрьевич — младший научный сотрудник отделения общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ. Тел.: +7(923) 431-57-73. E-mail: vernadskyi@gmail.com ORCID: 0000-0003-2473-3893.
Деев Сергей Михайлович — доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, руководитель лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Тел.: +7 (905) 775-39-30. E-mail: biomem@ mail.ru ORCID: 0000-0002-3952-0631.
Толмачев Владимир Максимилианович — профессор, руководитель лаборатории иммунологии, генетики и патологи Уп-псальскогоуниверситета. Тел.: +7(968) 928-79-33. E-mail: Vladimir.tolmachev@igp.uu.se ORCID: 0000-0002-6122-1734.
Введение. Основное внимание исследователей уделяется изучению одного из представителей семейства EGF — рецептору эпидермального фактора роста 2 (Her2/neu), гиперэкспрессия которого выявляется в 15—20% случаев инвазивного рака молочной железы (РМЖ) и характеризуется неблагоприятным прогнозом и агрессивным течением опухолевого процесса. В последние годы для радионуклидной диагностики данного типа опухоли используются меченные различными радионуклидами альтернативные каркасные белки, одним из представителей которых является рекомбинантный адресный протеин DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein).
Цель исследования. Изучение возможности клинического использования нового радиофармацевтического препарата (РФП) 99mTc-DARPin9_29 для диагностики РМЖс гиперэкспрессией Her2/neu у человека.
Материал и методы. В исследование включены 12 пациенток с диагнозом РМЖ (T1-4N0-2M0): у 6 больных отмечалась гиперэкспрессия her2/neu, у 6 экспрессии не выявлено. У всех больных проводилось морфологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала первичного опухолевого узла. До проведения системного лечения выполнялось внутривенное введение 99mT:-DARPin9_29 с последующим проведением планарной сцинтиграфии в режиме WholeBody и ОФЭКТ через 2, 4, 6 и 24 ч после введения.
Результаты. При анализе распределения РФП в органах и тканях наибольшее накопление вещества определялось в почках, надпочечниках и селезенке. Период полувыведения из кровяного русла для исследуемого вещества составил 2,51 ч. При изучении показателя опухоль/фон показано, что значения изучаемого параметра у больных с позитивным статусом рецептора Her2 более чем в 2,5раз превосходили значения в подгруппе больных с отрицательной экспрессией данного маркера (р<0,05).
Заключение. РФП99mTc-DARPin9_29можно рассматривать в качестве нового дополнительного метода диагностики Her2-позитивных опухолей молочной железы.
Ключевые слова: рак молочной железы, DARPin9_29, таргетная радионуклидная диагностика
PHASE I CLINICAL STUDY OF A NEW RADIOPHARMACEUTICAL BASED ON RECOMBINANT TARGET MOLECULES DARPIN9_29 LABELED WITH99m TECHNETIUM FOR RADIONUCLIDE DIAGNOSIS OF THE Her2/neu-POSITIVE BREAST CANCER O.D. Bragina1-2, V.I. Chernov1'2, M.S. Larkina25, E.S. Stasyuk2, R.V. Zelchan1-2- A.A. Medvedeva', E.Yu. Garbukov', R.Yu. Vernadskyi', S.M. Deev2-3- V.M. Tolmachev2-4
Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Kooperativny Str., 5, Tomsk, 634009, Russian Federation;
2National Research Tomsk Polytechnic University, Lenina Avenue, 30, Tomsk, 634050, Russian Federation; 3Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Ulitsa Miklukho-Maklaya, 16/10, Moscow, 117997, Russian Federation;
4Uppsala University, Segerstedthuset, Dag Hammarskjolds vag 7, Uppsala, Sweden;
5Siberian State Medical University, Moskovsky trakt, 2, Tomsk, 634050, Russian Federation
E-mail: rungis@mail.ru
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Bragina Olga Dmitrievna — PhD, MD, Senior Researcher in Nuclear Medicine Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (962) 776-14-23. E-mail: rungis@mail.ru ORCID: 0000-0001-5281-7758.
Chernov Vladimir Ivanovich — Dr. Sc. Med., MD, Prof., Head of the Department of Nuclear Medicine, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (903) 952-04-51. E-mail: chernov@tnimc.ru ORCID: 0000-0002-5524-9546.
Larkina Maria Sergeevna — PhD, Associate Professor, Pharmaceutical Analysis Department, SSMU. Tel.: +7 (960) 974-40-64. E-mail: marialarkina@mail.ru ORCID: 0000-0003-1176-2441.
Stasyuk Elene Sergeevna — PhD, researcher in TPU. Tel.: +7 (913) 828-04-82. E-mail: stasyuk@tpu.ru ORCID: 0000-00015281-7758.
Zelchan Roman Vladimirovich — PhD, MD, Senior Researcher in Nuclear Medicine Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (913) 829-5161. E-mail: r.zelchan@yandex.ru ORCID: 00000002-4568-1781.
Medvedeva Anna Aleksandrovna — PhD, MD, Senior Researcher in Nuclear Medicine Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (903) 952-45-75. E-mail: medvedeva@tnimc.ru ORCID: 00000002-5840-3625.
Garbukov Evgeny Yurievich — Senior Researcher in General Oncology Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7(913) 808-46-88. E-mail: jrmaximum9@gmail.com ORCID: 0000-0002-6016-7078.
Vernadskyi Roman Yurievich — Junior Researcher in General Oncology Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center Russian Academy of Sciences. Tel.: +7 (923) 431-57-73. E-mail: vernadskyi@gmail.com. ORCID: 0000-00032473-3893.
Deyev Sergey Mikhailovich — Prof., Head of the Molecular Immunology Laboratory, Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences. Tel.: +7(905) 775-39-30. E-mail: biomem@mail.ru ORCID: 0000-0002-3952-0631.
Tolmachev Vladimir Maximilianovich — Prof., Head of the Department of Immunology, Genetics and Pathology, Uppsala University. Tel.: +7(968) 928-79-33. E-mail: Vladimir.tolmachev@igp.uu.se ORCID: 0000-0002-6122-1734.
Introduction. The main attention of researchers is paid to the study of one of the members of the EGF family — the receptor of epidermal growth factor 2 (Her2/neu), the overexpression of which is detected in 15—20% of cases of invasive breast cancer and had an unfavorable prognosis and an aggressive process. In recent years, alternative scaffold proteins are used for the targeted radionuclide imaging. Molecules of DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein) are one of the representatives of scaffolds.
The aim of the study. Assessment of the clinical use of a new radiopharmaceutical 99mTc-DARPin9_29 for the diagnosis of breast cancer with overexpression of Her2/neu in humans.
Methods. The study included 12 breast cancer patients (T1-4N0-2M0): in 6 patients, Her2/neu overexpression was noted, in 6 patients — not detected. At the preclinical stage, all patients underwent morphological and immunohistochemical studies of the primary tumor biopsy material. 99mTc-DARPin9_29 was injected intravenously before therapy, WholeBody scintigraphy and SPECT were performed 2, 4, 6, and 24 hours after injection.
Results. The distribution of radiopharmaceuticals in organs revealed the greatest accumulation in the liver and kidneys, adrenal glands, and spleen. The half-life elimination from blood was 2.51 hours. In studying tumor/background index, values of the studied parameter in patients with overexpression of Her2 receptors were revealed to be more than by 2.5 times higher than the values in the subgroup of patients with negative expression of this marker.
Conclusion. The radiopharmaceutical 99mTc-DARPin9_29 may be considered as a new additional method for Her2-positive breast tumors diagnosis.
Key words: breast cancer, DARPin9_29, target radionuclide diagnostics
Рецепторы семейства эпидермального фактора роста EGFR (ErbB1/HER1; ErbB2/HER2; ErbB3/ HER3; ErbB4/HER4) играют важную роль в функционировании нормальных и опухолевых клеток, отвечая за процессы клеточного деления, диффе-ренцировки, пролиферации, миграции и апоптоза [1, 2]. Основное внимание исследователей уделяется изучению одного из представителей семейства EGF — рецептору эпидермального фактора роста-2 (Her2/neu), гиперэкспрессия которого выявляется в 15—20% случаев инвазивного рака молочной железы (РМЖ) и характеризуется неблагоприятным прогнозом и агрессивным течением опухолевого процесса [3].
Определение статуса Her2/neu в клинической практике прежде всего необходимо для определения показаний для назначения таргетной терапии с применением таких препаратов, как трастузумаб, пертузумаб, трастузумаб эмтамзин в сочетании с химиотерапией или в монорежиме, что значительно улучшает показатели выживаемости у больных с гиперэкспрессией данного маркера [4]. К основным методами определения статуса Her2/neu являются иммуногистохимический метод (ИГХ) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Существенными недостатками указанных методик являются невозможность выполнения исследования in vivo с определением распространенности опухолевого процесса; оценка случаев, связанных с гетерогенностью экспрессии рецептора Her2/neu в опухолевой ткани; необходимость выполнения инвазивных процедур (биопсия и(или) хирургическое вмешательство), а также возможные различия экспрессии маркера в основном опухолевом и метастатических очагах [5].
Продолжающийся поиск новых эффективных агентов способствовал разработке молекулярных конструкций, альтернативных связывающим доменам антител и обладающих такими характеристиками, как специфическое связывание исключительно с таргетным антигеном, отсутствие иммуногенно-сти, стабильность и возможность быстрой химической модификации в ходе проведения исследований [6, 7]. В течение последних нескольких лет большое распространение приобретает новый класс альтернативных каркасных белков (АКБ) или «скаффолды» (scaffolds), отвечающих всем требованиям для оптимальной доставки радионуклида к опухолевым клеткам [8—10]. К несомненным преимуществам данных конструкций относятся значительно меньшие раз-
меры по сравнению со стандартным антителом; стабильная структура; дополнительная функционализа-ция и экспрессия в бактериальной системе; высокая термостабильность, а также возможность прямого химического синтеза [11—15].
Одним из представителей альтернативных каркасных белков является таргетная молекула DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein) [16—19], основными характеристиками которого являются небольшой размер (14—20 кДа), стабильная структура, высокая специфичность к антигену и более низкая стоимость производства [20, 21].
В рамках проекта «Доклинические исследования радиофармацевтического препарата (РФП) на основе меченных 99mTc рекомбинантных адрес -ных молекул для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией Her-2/neu» (ГК №14.N08.11.0163) Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 г. и дальнейшую перспективу» разработан новый РФП на основе меченных 99ттехнецием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики злокачественных новообразований c гиперэкспрессией Her2/neu и выполнен полный комплекс его доклинических исследований. Проведение клинических исследований было одобрено биоэтическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ (протокол №7 от 24.04.2017) [23, 24].
Целью настоящего исследования явилось изучение возможности клинического использования нового РФП 99тТс^АКРт9_29 для диагностики РМЖ с гиперэкспрессией Her2/neu у человека.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включены 12 больных РМЖ (T1-4N0-2M0) до проведения системной химио-или таргетной терапии: у 6 из них выявлена гиперэкспрессия Her2/neu, у 6 экспрессия маркера не выявлена. Средний возраст пациенток составил 49,4±5,1 года. Всеми пациентами подписано добровольное информированное согласие с информацией о разглашении полученных сведений (п. 3, статья 13 Федерального закона Российской Федерации №323-Ф3 от 21 ноября 2011 г.). Критерии включения и исключения пациенток из исследования представлены в табл. 1.
Все больные находились под динамическим наблюдением в течение 48 ч после введения РФП с
оценкой жалоб пациентов, частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД) и температуры тела до введения препарата, через 2, 4, 6, 24 и 48 ч после инъекции. Всем пациенткам выполнялись лабораторные исследования такие как общий и биохимический анализы крови и общий анализ мочи до введения исследуемого соединения, через 48 ч и 7 дней. Анализы проводились по стандартным методикам в условиях лаборатории НИИ онкологии Томского НИМЦ.
Морфологические методы исследования. Во всех случаях выполнялось морфологическое и имму-ногистохимическое исследования биопсийного материала первичной опухоли по стандартным методикам. Диагноз РМЖ устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2019). Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала проводилось с использованием антител фирмы Dako к онко-протеину c-erbB-2 (рабочее разведение 1:500, кроличьи). При оценке результатов негативными считались случаи с отсутствием окрашивания или со слабым, прерывистым мембранным окрашиванием (категории 0 и 1+), положительными — случаи с сильным окрашиванием всей цитоплазматической мембраны >10% опухолевых клеток (категории 3+). При наличии от слабого до умеренного окрашивания всей цитоплазматической мембраны >10 % опухолевых клеток (категории 2+) всем пациенткам выполнялся FISH-анализ.
FISH-анализ выполнялся с использованием ДНК-зонда ERBB2(17q12)/SE17 (Kreatech, США), оценка результата реакции проводилась с помощью люминесцентного микроскопа Axiostar PLUS, Carl Zeiss (Германия). Положительными считались результаты теста при соотношении среднего количества копий гена Her2/neu и среднего числа центромер хромосомы 17 в клетке >2,2.
Таблица 1
Критерии включения и исключения пациенток с раком молочной железы из исследования
Table 1
Inclusion and exclusion criteria for breast cancer patients
Критерии включения
Критерии исключения
Больные с впервые диагностированным, морфологически верифицированным РМЖ с экспрессией (п=15) и без экспрессии (п=15) Нег2/пеи Т1-4Ш-3М0-1 стадии. Общее состояние больных с оценкой по системе ЕСОС-ВОЗ 0-2 балла. Подписанное информированное согласие пациента на участие в научном исследовании
Выраженная
анемия, лейкопения, тромбоцитопения, сепсис, кахексия, тяжелая сопутствующая
патология. Клаустрофобия. Отказ от лечения
Радионуклидные методы исследования. Препарат готовился непосредственно перед введением в отделении радионуклидной диагностики НИИ Онкологии Томского НИМЦ по трикарбонильной методике с использованием набора CRS Isolink (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария). В состав набора входят 2,9 мг натрия тетрабората декагидрата, 7,8 мг натрия карбоната, 4,5 мг динатрия боранокарбоната и 9,0 мг калия натрия тартрата тетрагидрата.
Для достижения целей в асептических условиях в набор CRS Isolink добавлялось 500 мкл (4 ГБк) элю-ата 99mTcO4- и инкубировалось в течение 30 мин при температуре 1000С. После этого 1 мл трикарбониль-ного технеция добавляли к 1200 мкг DARPin9_29 и инкубировалось при температуре 40°С в течение 60 мин (лабораторный регламент получения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017). Очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавших-ся с технецием молекул DARPin9_29 проводилась с использованием очистительных колонок NAP-5 (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход (РХВ) и чистота (РХЧ) определялись с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводился с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат разбавлялся в 10 мл физраствора, забирался через стерилизующий фильтр и после измерения активности медленно вводился пациенту внутривенно [25].
Сцинтиграфия в режиме WholeBody. Сцинтигра-фические исследования выполнялись на гамма-камере E.CAM 180 фирмы Siemens (Германия) в режиме WholeBody с использованием параллельных высокоразрешающих коллиматоров для энергии 140 КэВ в положении лежа на спине через 2, 4, 6 и 24 ч после введения со скоростью сканирования 15 см/мин.
Однофотонная эмиссионная компьютерная томография также выполнялась пациентам в положении «лежа на спине» через 2, 4, 6 и 24 ч после введения препарата, поле зрения при котором входили голова, шея, аксиллярная область и грудная клетка до уровня бифуркации трахеи. Проводилась запись 32 проекций (каждая проекция по 30 с) в матрицу 64*64 пикселя без аппаратного увеличения.
Обработка данных и используемые показатели. При выполнении исследовании полученные данные подвергались постпроцессинговой обработке с использованием специализированного пакета программ E.Soft фирмы Siemens (Германия), при этом изучался уровень аккумуляции препарата в основных органах и тканях путем обведения «зоны интереса» (ROI) на изображениях WholeBody в передней и задней проекциях. Биораспределение РФП представлено в виде процента аккумуляции РФП в «зонах интереса» к показателю общего счета в обеих проекциях. Для подсчета дозы абсорбции РФП использовалась
программа OLINDA/EXM. 1.1 с применением фантома «взрослой женщины».
Также выполнялась оценка характера накопления РФП в исследуемой области: симметричность, интенсивность, однородность накопления РФП; наличие и численность очаговых включений индикатора в исследуемом органе, регионарных лимфоузлах (патологическим считались асимметричные участки гиперфиксации РФП); наличие других очагов патологического включения РФП в пределах исследуемой области. Кроме этого, в исследуемых группах рассчитывался количественный показатель опухоль/фон (ОФ), отражающий степень аккумуляции препарата в патологическом очаге по сравнению с интактными тканями. Указанный показатель оценивался путем обведения зоны интереса (ROI) опухоли на аксиальных срезах с наилучшей визуализацией последней; в качестве фона использовались симметричные зоны интереса контрлатеральной молочной железы.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Statistica 10.0 for Windows с использованием непараметрического метода Манна—Уитни. Различие 2 сравниваемых величин считали достоверным в случае, если вероятность их тождества была <5% (p<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным проведенного анализа показатели РХВ и РХЧ составили 80±4 и 98±1% соответственно. Активность препарата, непосредственно перед введением больным составила 434±19,5 МБк. Во время проведения исследования жалоб, изменений ЧСС, АД и температуры не выявлено. Изменений в показателях крови и мочи также не определялись.
Наибольший захват в нормальных органах отмечался почками через 2 ч после введения (29,2±
3,1%/ИД/орган), наименьший — в тонком кишечнике через 6 ч после введения (1,6+0,5%/ИД/ор-ган) (табл. 2).
При изучении дозы абсорбции 99mTc-DARPin9_29 в органах и тканях оказалось, что наибольшее накопление вещества отмечалось в почках (0,12± 0,02 мГр), надпочечниках (0,036+0,003 мГр) и селезенке (0,029+0,019 мГр). Наименьшее накопление изучаемого препарата отмечалось в головном мозге (0,002+0,000 мГр), яичниках и коже (0,003+0,000
Таблица 3
Распределение препарата 99mTc-DARPin9_29 в органах и тканях после введения у больных раком молочной железы
Table 3
Biodistribution of 99mTc-DARPin9_29 in organs and tissues after injection in breast cancer patients
Органы 2 ч после введения 4 ч после введения 6 ч после введения
Молочные железы 2,6±0,6 2,4±0,5 2,3±0,5
Тонкий кишечник 1,9±0,6 1,9±0,5 1,6±0,5
Почки 29,2±3,1 26,9±3,9 26,6±3,0
Печень 7,6±1,7 7,7±2,3 7,5±2,2
Легкие 3,5±0,8 2,8±0,3 2,5±0,4
Референсные органы Абсорбционная доза (мГр)
Надпочечники 0,036+0,003
Головной мозг 0,002+0,000
Молочная железа 0,010+0,002
Желчный пузырь 0,016+0,003
Нижняя стенка толстой кишки 0,007+0,001
Тонкая кишка 0,010+0,002
Желудок 0,009+0,002
Верхняя стенка толстой кишки 0,009+0,002
Сердце 0,0056+0,0009
Почки 0,12+0,02
Печень 0,015+0,004
Легкие 0,007+0,002
Яичники 0,003+0,000
Поджелудочная железа 0,016+0,003
Надпочечники 0,015+0,003
Красный костный мозг 0,0047+0,0006
Остеогенные клетки 0,0092+0,0008
Кожа 0,002+0,000
Селезенка 0,029+0,019
Тимус 0,012+0,005
Щитовидная железа 0,012+0,003
Мочевой пузырь 0,010+0,002
Матка 0,038+0,031
Все тело 0,0053+0,0008
Эквивалентная эффективная доза (мЗв/МБк) 0,022+0,005
Эффективная доза (мЗв/МБк) 0,012+0,001
Таблица 2
Наибольший захват 99mTc нормальными органами на планарной сцинтиграфии после введения 99mTc-DARPin9_29 (результаты представлены как %/ИД/орган)
Table 2
Highest Uptake of 99mTc in Tumor-Free Areas of Organs on Planar WholeBody Images After Injection of 99mTc-DARPin9_29 (data are presented as %ID/organ)
Рис. 1. Распределение препарата 99mTc-DARPin9_29 в органах и тканях у больной раком молочной железы через 2, 4, 6 и 24 ч после введения: передняя и задняя проекции (стрелками показана опухоль)
Fig. 1. Biodistribution of 99mTc-DARPin9_29 in organs and tissues 2, 4, 6 and 24 hours after injection in breast cancer patient: anterior and posterior projections
* W Л - i VV Л - в • JI щ - t »1 Щ
2 часа после введения 4 часа после введения 6 часов после введения 24 часа после введения
Время, ч
Рис. 2. Кинетика элиминации препарата 99mTc-DARPin9_29 из крови. Результаты были посчитаны, основываясь на данных счета ROI в проекции сердца Fig. 2. Kinetics of elimination of 99mTc-DARPin9_29 from blood (data were calculated based on count rates in ROIs placed over hearts)
и 0,002±0,000 мГр соответственно). Эффективная доза при этом составила 0,012±0,001 мГр. Полученные результаты представлены в табл. 3 и рис. 1.
Кинетика элиминации препарата 99mTc-DARPm9_29 из кровяного русла представлена на рис. 2 (период полувыведения для исследуемого вещества составил 2,51 ч).
При изучении показателя опухоль/фон было показано, что значения изучаемого параметра у больных с позитивным статусом рецептора Шг2 более чем в 2,5 раза превосходили значения в подгруппе больных с отрицательной экспрессией данного маркера (р<0,05) на всех временных точках. При этом наиболее оптимальной для проведения исследований явилась отметка в 2 ч (индекс 3,6) (табл. 4). Временной интервал в 24 ч в исследование не учитывался в связи с невозможностью визуализации ^г2-негативных опухолей в ряде случаев.
Таблица 4
Соотношение опухоль/фон основного опухолевого узла у больных раком молочной железы после введения препарата 99mTc-DARPin9_29
Table 4
Tumor/background indicator of tumor in breast cancer patients after injection of 99mTc-DARPin9_29
Her2/neu статус опухоли Показатель опухоль/фон через 2 ч после введения Показатель опухоль/фон через 4 ч после введения Показатель опухоль/фон через 6 ч после введения
Позитивный 10,2±1,2 7,4±1,3 6,3±0,6
Негативный 2,8±0,34 3,1±0,75 2,18±0,8
р р<0,05 р<0,05 р<0,05
Соотношение опухоль/фон у больных с разным статусом Her2/neu 3,6 2,5 2,9
Рис. 2. Данные ОФЭКТв поперечной (1) и планарных проекциях (2, 3) пациентки с позитивным рецепторным статусом Her2/neu через 2 ч после введения препарата 99mTc-DARPin9_29: визуализация накопления индикатора в центральных отделах левой молочной железы (стрелки указывают на опухоль в левой молочной железе)
Fig. 2. SPECT in transverse (1) and planar (2, 3) projections in Her2-positive breast cancer patient 2 hours after injection of 99mTc-DARPin9_29: visualization of high radiopharmaceutical accumulation in central part of left breast cancer
Рис. 3. Данные ОФЭКТ в поперечной (1) и планарных проекциях (2, 3) пациентки с отрицательным статусом Her2/neu через 2 ч после введения препарата 99mTc-DARPin9_29: отсутствие накопления препарата в проекции опухоли в верхненаружном квадранте левой молочной железы Fig. 3. SPECT in transverse (1) and planar (2, 3) projections in Her2-negative breast cancer patient 2 hours after injection of 99mTc-DARPin9_29: absence radiopharmaceutical accumulation tumor projection in upper outer quadrant of left breast cancer
В качестве примера на рис. 2 и 3 представлены данные ОФЭКТ в поперечной и планарных проекциях больных с Нег2-позитивным и Нег2-негативным РМЖ (в последнем случае опухоль при исследовании не выявлена). При анализе изображения Нег2-позитивного опухолевого процесса у пациентки отмечалось накопление высокой интенсивности в проекции опухоли в центральном отделе левой молочной железы, что соответствовало данным других обследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время в мировой практике известны лишь немногочисленные исследования, посвящен-
ные клиническому использованию альтернативных каркасных белков для диагностики злокачественных образований. Например, исследования меченной различными радионуклидами молекулы аффибоди для ПЭТ-диагностики РМЖ, показавшие хорошую переносимость и отсутствие высокой лучевой нагрузки у пациентов. В то же время авторам не удалось получить РФП на основе наиболее распространенного и доступного в мировой ядерной медицине 99mTc для использования в рутинной клинической практике [26].
По результатам выполненных исследований изучаемый РФП 99mTc-DARPin9_29 продемонстрировал существенные различия в накоплении в опухолевой ткани с различной экспрессией рецептора Her2/neu. Высокое соотношение показателя опухоль/фон свидетельствует о возможности рутинного клинического использования данного соединения как в качестве дополнительного метода диагностики Нег2-статуса опухоли, так и для первичной оценки распространенности опухолевого процесса у больных РМЖ на доклиническом этапе (до проведения лечения). Выявленное высокое накопление препарат в печени, возможно, будет существенно снижать его диагностическую эффективность в детекции внутрипече-ночных метатстазов, что, несомненно, в будущем требует химической модификации протеина и улучшение его биологических свойств.
Таким образом, на основании полученных результатов можно свидетельствовать о том, что РФП 99mTc-DARPin9_29 возможно рассматривать в качестве нового дополнительного метода диагностики
Нег2-позитивных опухолей молочной железы.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Romond E.H., Perez E.A., Bryant J., Suman V.J., Geyer C.E. Jr., Davidson N.E., Tan-Chiu E., Martino S., Paik S., Kaufman P.A., Swain S.M., Pisansky T.M., Fehrenbacher L., Kutteh L.A., Vogel V.G., Visscher D.W., Yothers
G., Jenkins R.B., Brown A.M., Dakhil S.R., Mamounas E.P., Lingle W.L., Klein P.M., Ingle J.N., Wolmark N. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 1673-84.
2. Zahid M., Khan S., Khan R. Detection of Her2/neu gene amplification by fluoro-scence in situ hybridization technique. Pathology. 2016; 48 (1): 163-70.
3. Orlando L., Viale G., Bria E., Lutrino E.S., Sperduti I., Carbognin L., Schiavone P., Quaranta A., Fedele P., Caliolo C., Calvani N., Criscuolo M., Cinieri S. Discordance in pathology report after central pathology review: Implications for breast cancer adjuvant treatment. Breast. 2016; 30: 151-5.
4. Zavyalova M., Vtorushin S., Krakhmal N., Savelieva O., Tashireva L., Kaigorodova E., Perelmuter V., Telegina N., Denisov E., Bragina O., Slonimskaya E., Choynzonov E. Clinicopathological features of nonspecific invasive breast cancer according
to its molecular subtypes. Experimental Oncology. 2016; 38 (2): 122-7.
5. Telugu R.B., Chowhan A.K., Rukmangadha N., Patnayak R., Phaneendra B.V., Prasad B.C., Reddy M.K. Human epidermal growth factor receptor 2/neu protein expression in meningiomas: An immunohistochemical study. J. Neurosci Rural Pract. 2016; 7 (4): 526-31.
6. Брагина О.Д., Чернов В.И., Зельчан Р.В., Синилкин И.Г., Медведева А.А., Ларькина М.С. Альтернативные каркасные белки в радионуклидной диагностике злокачественных образований. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (3): 125-33.
[Bragina O.D., Chernov V.l., Zelchan R.V., Sinilkin I.G., Medvedeva A.A., Larkina M.S. Alternative scaffolds in radionuclide diagnosis of malignancies. Bulleten Sibirskoi Medicini. 2019; 18 (3): 125-33 (in Russian)]
7. Чернов В.И., Брагина О.Д., Зельчан Р.В., Медведева А.А., Синилкин И.Г., Ларькина М.С., Стасюк Е.С., Нестеров Е.А., Скуридин В.С. Меченые аналоги соматостатина в тераностике нейроэндокринных опухолей. Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2017; 62 (3): 42-9.
[Chernov V.I., Bragina O.D., Zel'chan R.V., Medvedeva A.A., Sinilkin I.G., Larkina M.S., Stasyuk E.S., Nesterov E.A., Skuridin V.S. Labeled Somatostatin Analogues in Theranostics of Neuroendocrine Tumors.
Medicinskaya radiologiya I radiacionnaya bezopasnost. 2017; 62 (3): 42-9 (in Russian)]
8. Lindbo S., Garousi J., Mitran B., Altai M., Buijs J., Orlova A., Hober S., Tolmachev V. Radionuclide Tumor Targeting Using ADAPT Scaffold Proteins: Aspects of Label Positioning and Residualizing Properties of the Label. J. Nucl Med. 2018; 59 (1): 93-9.
9. Tolmachev V., Orlova A., Andersson K. Methods for radiolabelling of monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2014; 1060: 309-30.
10. Nicholes N., Date A., Beaujean P., Hauk P, Kanwar M, Ostermeier M. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins. Protein Engineering, Design and Selection. 2016; 29: 77-85.
11. Pluckthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511.
12. Stumpp M. T., Binz H.K., Amstutz P. DARPins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today. 2008; 13 (15): 695-701.
13. Tamaskovic R., Simon M., Stefan N., Schwill M., Pluckthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy. Methods Enzymol. 2012; 503: 101-34.
14. Boersma Y.L., Pluckthun A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. Curr. Opin. Biotechnol. 2011; 22: 849-57.
15. Binz H.K., Stumpp M.T., Forrer P., Amstutz P., Pluckthun A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. J. Mol. Biol. 2003; 332: 489-503.
16. Goldstein R., Sosabowski J., Livanos M., Leyton J., Vigor K., Bhavsar G., Nagy-Davi-descu G., Rashid M., Miranda E., Yeung J., Tolner B., Pluckthun A., Mather S., Meyer T., Chester K.. Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 for HER2 molecular imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2015; 42 (2): 288-301.
17. Hausammann S., Vogel M., Kremer J.A. Designed Ankyrin Repeat Proteins: A New Approach to Mimic Complex Antigens for Diagnostic Purposes? PLoS One. 2013; 8: 1-9.
18. Moody P., Chudasama V., Nathani R. I., Maruani A., Martin S., Smith M.B., Caddick S. A rapid, site-selective and efficient route to the dual modification of DARPins. Chem Commun (Camb). 2014: 50 (38): 4898-900.
19. Kramer L., Renko M., Zavrsnik J., Turk D., Seeger M.A., Vasiljeva O., Grutter M.G., Turk V., Turk B. .Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin B by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-21.
20. Houlihan G., Gatti-Lafranconi P., Lowe D., Hollfelder F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/ function trade-offs in the selection process. Protein Eng Des Sel. 2015; 28 (9): 269-79.
21. Hanenberg M., McAfoose J., Kulic L. Amyloid- peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 2014; 26: 27080-9.
22. Брагина О.Д., Ларькина М.С., Стасюк
E.С., Чернов В.И., Юсубов М.С., Скуридин В.С., Деев С.М., Зельчан Р.В., Булдаков М.А., Подрезова Е.В., Белоусов М.В. Разработка высокоспецифичного радиохимического соединения на основе меченых 99mTc рекомбинантных адресных молекул для визуализации клеток с гиперэкспрессией Her2/neu. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (3): 25-33.
[Bragina O.D., Larkina M.S., Stasyuk E.S., Chernov V.l., Yusubov M.S., Skuridin V.S., Deyev S.M., Zel'chan R.V., Buldakov M.A., Podrezova E.V., Belousov M.V. The development of a highly specific radiochemical compound based on labeled 99mTc recombinant molecules for targeted imaging of cells with the overexpression of Her-2 / neu. Bulleten Sibirskoi Medicini. 2017; 16 (3): 25-33 (In Russian)]
23. Vorobyeva A., Bragina O., Altai M., Mitran B., Orlova A., Shulga A., Proshkina G., Chernov V., Tolmachev V, S. Deyev. Comparative Evaluation of Radioiodine and Technetium-Labeled DARPin9_29 for Radionuclide Molecular Imaging of HER2 Expression in Malignant Tumors. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018; 6930425.
24. Vorobyeva A., Garousi J., Tolmachev V., Schulga A., Konovalova E., Deyev S.M., Güler R., Löfblom J., Sandström M., Chernov V., Bragina O., Orlova A. Optimal composition and position of histidine-containing tags improves biodistribution of 99mTc-labeled DARPinG3. Scientific Reports. 2019: 9 (1); 9405.
25. Bragina O., Witting E., Garousi J., Zelchan R., Sandström M., Medvedeva A., Orlova A., Doroshenko A., Vorobyeva A., Lindbo S., Borin J., Tarabanovskaya N., Sorensen J., Hober S., Chernov V., Tolmachev V. Phase
I study of 99mTc-ADAPT6, a scaffold protein-based probe for visualization of HER2 expression in breast cancer. J. of nuclear medicine. 2020. In press
26. Garousi J., Honarvar H., Andersson K.G., Mitran B., Orlova A., Buijs J., Löfblom J., Frejd
F.Y., Tolmachev V. Comparative Evaluation of Affibody Molecules for Radionuclide Imaging of in Vivo Expression of Carbonic Anhydrase IX. Mol Pharm. 2016; 13 (11): 3676-87.
Для цитирования: Брагина О.Д., Чернов В.И., Ларькина М.С., Стасюк Е.С., Зельчан РВ., Медведева А.А., Гарбуков Е.Ю., Вернадский РЮ., Деев С.М., Толмачев В.М. Результаты I фазы клинического исследования нового радиофармпрепарата на основе меченных 99ттехнецием рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 для радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu. Молекулярная медицина. 2021; 19 (2): 41-48. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-02-06
Поступила 11 сентября 2020 г.
For citation: Bragina O.D., Chernov V.I., Larkina M.S., Stasyuk E.S., Zelchan R.V., Medvedeva A.A., Garbukov E.Yu., Vernadskyi R.Yu., Deev S.M., Tolmachev V.M. Phase I clinical study of a new radiopharmaceutical based on recombinant target molecules DARPin9_29 labeled with technetium-99m for radionuclide diagnosis of the Her2/neu-positive breast cancer. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (2): 41-48 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-02-06
