CC BY
67
УДК 639.3
М. М. Богатырева, Н. В. Болонина, Е. Н. Пономарева, А. М. Тихомиров РЕЗУЛЬТАТЫ ХРАНЕНИЯ ОБРАЗЦОВ СПЕРМЫ СЕВРЮГИ
Введение
Научная разработка нового направления - криоконсервации половых продуктов рыб -начата сравнительно недавно - в конце 90-х гг. XX в. и носит экспериментальный характер. Работа проводится с целью сохранения генетического разнообразия как объектов аквакультуры, так и естественных популяций. В настоящее время удается замораживать только сперму различных видов рыб [1].
Использование криоконсервированной спермы для искусственного воспроизводства ценных видов рыб становится актуальным для многих рыбоводных предприятий. Это обусловлено нехваткой производителей в естественных районах обитания. На предприятиях, где сформировано собственное маточное стадо, производители имеют необходимые рыбоводные показатели. Кроме того, для улучшения качества потомства необходимо ежегодное пополнение маточного стада «свежей кровью» на 25 %. Чтобы исключить расходы по содержанию производителей, применяют криоконсервированные образцы спермы, которые могут быть использованы в любое удобное время.
Основной проблемой при разработке методов низкотемпературной консервации является защита спермы рыб от повреждающего действия низких температур путем подбора оптимальных разбавителей, стабилизаторов, криопротекторов, режимов охлаждения и отогрева [2]. Установлено, что подбор криопротекторов видоспецифичен.
Одним из наиболее важных этапов в получении спермы высокого качества является процесс хранения криоконсервированного материала. Существует мнение, что замороженную сперму можно хранить в парах жидкого азота, а также при более высокой температуре - при -18 °С. Так, оценка состояния клеток сперматозоидов рыб после хранения при низкой (-18 °С) и сверхнизкой (-196 °С) температуре показала, что качественные изменения отсутствуют при различных температурах хранения [3]. Однако исследованиями Н. Н. Петропавлова с соавторами [4] показано, что рекристаллизация биологических образцов наступает уже при температуре -150 °С. Исходя из этого, хранение биологических образцов генофонда рыб необходимо осуществлять только в жидком азоте, в специализированных хранилищах, поддерживая его постоянный уровень.
Материалы и методы исследований
Исследования проводили на кафедре «Аквакультура и водные биоресурсы» Астраханского государственного технического университета (АГТУ) совместно с лабораторией «Аквакультура и биологические ресурсы» Южного научного центра Российской академии наук в 2007-2008 гг. Объектом исследований служила сперма севрюги, заготовленная в июне 2007 г. на осетровых рыбоводных заводах Астраханской области. Для криоконсервации использовали сперму высокого качества - 4 и 5 баллов по шкале Г. М. Персова [5]. Ранее были подобраны оптимальные криопротекторы для осетровых видов рыб. Использовали ступенчатый режим замораживания: (3°/мин в течение 4 минут, затем 10°/мин в течение 10 минут), после чего ампулы со спермой помещали в жидкий азот. Хранение образцов биологического материала проводили в хранилище биопродуктов в течение 9 месяцев. Цель исследований заключалась в выявлении влияния долгосрочного хранения образцов спермы на ее рыбоводные показатели.
Качество половых продуктов определяли по двум показателям - количеству сперматозоидов с поступательным движением (т. к. только активные сперматозоиды способны оплодотворить яйцеклетки) и времени подвижности сперматозоидов. Сравнение по данным показателям проводили на нескольких этапах работ: нативная сперма (заготовленная от производителей), сперма после эквилибрации с криопротектором, сперма после замораживания и хранения в течение 1 часа, сперма после хранения - в течение 9 месяцев.
Для определения качества криоконсервированной спермы проводили искусственное оплодотворение икры севрюги по методике Е. М. Коханской в чашке Петри [6]. Этот способ позволяет реализовать оплодотворение и инкубацию эмбрионов без обесклеивания икры, что весьма важно при проведении исследований на малых партиях материала. В чашки Петри помещали от 150 до 180 шт. икринок севрюги. После оттаивания образцов спермы проводили
расчет ее количества для данной партии икры и времени оплодотворения, которое, в свою очередь, зависело от времени жизни дефростированной спермы. После этого оплодотворяли икру по указанной методике. Перемешивание икры со спермой осуществляли пером во избежание механических повреждений, т. к. количество икры было слишком малым.
Инкубацию икры проводили в пластиковых рыбоводных бассейнах при температуре 18-19 °С в условиях аквариального комплекса АГТУ. Через 18-24 часа определяли показатели оплодотворения икры опытных партий и сравнивали их с показателями из рыбоводных журналов завода, на котором брали ту или иную партию икры.
Достоверность различий между контролем (нативная сперма, показатели оплодотворения из рыбоводных журналов) и опытными партиями устанавливали с применением ^-критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
После статистической обработки и анализа результатов исследования были построены графики изменения показателей качества спермы севрюги во время криоконсервации и хранения образцов (рис. 1, 2).
Показатели нативной спермы составляют 4 балла по шкале Персова, что соответствует 95 % поступательного движения сперматозоидов, время подвижности - 2 800 с. В процессе криоконсервации качество спермы достоверно снижается, что обусловлено рядом факторов: токсическое воздействие криопротектора; двойной температурный шок (заморозка и оттаивание); кристаллизация внутриклеточной жидкости, что приводит к нарушению целостности клеток; повреждения спермиев в виде обломанных хвостов и т. д.
Рис. 1 отражает изменения количества спермиев с поступательным движением в процентном соотношении от общего количества спермиев. На диаграмме видно постепенное снижение числа активных сперматозоидов. Так, в нативной сперме этот показатель равен 95 %, после эквилибрации -80 %, через 1 час после заморозки - 70 %, после 9 месяцев хранения - 70 %. Такие результаты свидетельствуют о том, что в процессе хранения количество активных спермиев не изменяется, т. е. образцы спермы можно хранить длительное время без снижения рыбоводных показателей.
□ Нативная сперма □ После эквилибрации
□ Через час В Через 9 месяцев
Рис. 1. Изменение количества подвижных спермиев во время криоконсервации и хранения
На рис. 2 показаны изменения времени подвижности сперматозоидов в процессе криоконсервации и хранения. Нативная сперма демонстрирует поступательные движения клеток в течение 2 800 с, а после эквилибрации - 1 200 с, что можно объяснить токсическим действием компонентов последнего. Через 1 час после замораживания это время составляет уже 270 с, а через 9 месяцев хранения - 1 210 с.
□ Нативная сперма □ После эквилибрации
□ Через час Щ Через 9 месяцев
Рис. 2. Изменение времени подвижности сперматозоидов во время криоконсервации и хранения
Увеличение времени подвижности в процессе хранения указывает на то, что сперма, по-видимому, проходит холодовую адаптацию, и на то, что снижается токсическое воздействие криопротектора на клетки. Исходя из этого, для искусственного оплодотворения икры криокон-сервированным материалом целесообразно использовать сперму после долгосрочного хранения, когда завершатся все этапы адаптации. В этом случае удастся получить более высокие показатели оплодотворения.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что правильное хранение образцов спермы обеспечивает сохранение высоких показателей качества в течение длительного времени.
На завершающем этапе исследования устанавливали возможности оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы. Очевидно, что показатель оплодотворения икры является наиболее информативным при определении качества дефростированной спермы, т. к. он дает полное представление о рыбоводных свойствах половых продуктов, прошедших глубокую заморозку и долгосрочное хранение. Проведение инкубации икры показано на рис. 3.
Рис. 3. Инкубация икры севрюги по методу Коханской
Необходимо отметить, что условия аквариального комплекса АГТУ не позволяют провести процесс инкубации в полном объеме в связи с невозможностью удерживать и регулировать температурный и газовый режимы. Поэтому показатели оплодотворения икры севрюги определяли на начальных стадиях дробления (4-6 стадии эмбрионального развития).
Статистическая обработка результатов показала, что показатели оплодотворения спермой, взятой от тех же самцов и проинкубированной в заводских условия, не отличались от таковых в опыте.
Показатели оплодотворения опытных партий составили 64, 64, 88, 84 %; средний заводской показатель оплодотворения - 79 %.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что криоконсервированная сперма по своим рыбоводным показателям не уступает нативной и может быть использована для искусственного воспроизводства ценных видов рыб, в частности севрюги.
Выводы
В результате исследований выявлено следующее.
1. Долгосрочное хранение образцов спермы в жидком азоте не оказывает отрицательного воздействия на ее рыбоводные показатели. Так, при сравнении результатов дефростации через 1 час после заморозки и через 9 месяцев хранения, количество сперматозоидов с поступательным движением не изменилось, а время подвижности увеличилось в 4,5 раза.
2. Сохранение свойств спермы возможно только при хранении в жидком азоте.
3. Оплодотворяющая способность дефростированной спермы не отличается от таковой спермы, проинкубированной в заводских условиях. Последнее позволяет рекомендовать использование криоконсервированного генетического материала для искусственного воспроизводства и товарного выращивания севрюги.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Савушкина С. И. Выращивание рыбопосадочного материала, полученного с использованием крио-консервированной спермы // Рациональное использование пресноводных экосистем - перспективное направление реализации национального проекта «Развитие АПК» (2007, Москва). Междунар. науч.-практ. конф., 17-19 декабря 2007 г.: Материалы и докл. / ГНУ ВНИИР Россельхозакадемии. - М.: Изд-во Россельхозакадемии, 2007. - С. 303-305.
2. Цветкова Л. И. Создание низкотемпературной коллекции спермы рыб // Проблемы репродуктивной биологии в трудах профессора С. И. Кулаева и его последователей. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1998. -С. 326-330.
3. Акимочкина Т. И., Попов О. П., ЗемковГ. В. Определение сравнительной криоустойчивости спермиев в зависимости от видовой принадлежности // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных: Материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Дубровицы: ВНИИЖ, 2007. - С. 127-128.
4. Петропавлов Н. Н., Андреев А. А., Каранова М. В. Кристаллофизические аспекты криоконсервации генетических ресурсов // Биофизика живой клетки. - Пущино, 1994. - Т. 6. - С. 62-64.
5. Персов Г. М. Дозирование спермиев как способ управления оплодотворением яйцеклеток осетровых: Докл. АН СССР. - 1953. - Т. 90, № 6. - С. 1183-1185.
6. Мильштейн В. В. Осетроводство. - М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1982. - 152 с.
Статья поступила в редакцию 21.03.2008
RESULTS OF STELLATE STURGEON SPERM SAMPLES STORAGE
M. M. Bogatyreva, N. V. Bolonina, E. N. Ponomareva, A. M. Tikhomirov
The process of cryopreservation and sturgeon sperm storage, prepared at the fishing plants of Astrakhan Region is examined. The already selected cryo-protectors and native sperm of high quality have been used. It is shown that under right conditions of storage sperm keeps its fishing characteristics. The most important indices: the quantity of progressive sperm cells, mobility time, insemination rates are investigated. Defrosting sturgeon sperm has high quality: 70 % of progressive sperm cells, mobility time is 1 210 sec., insemination rates are 64-68 %.
Key words: sturgeon, cryopreservation, cryoprotector, native sperm, defrosting sperm, insemination rate.
